一种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷的新方法
【专利摘要】一种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷的新方法，具体涉及从萝卜籽或西兰花或油菜种子中提取萝卜硫素的方法。本发明以风干萝卜籽和西兰花种子或油菜籽为原料，经制备萝卜籽粉碎液、灭酶西兰花或油菜籽分散液、脱脂精磨液、发酵液、脱蛋白发酵液、浓缩液、多糖干粉、高纯度萝卜硫素冻干粉，制备出纯度高达98％以上的1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷。本发明方法制备出的萝卜硫素生成率高、操作简单、产品纯度高达98％以上，绿色无污染等特点。采用本方法制备的产品可广泛应用于医药、保健品行业中，有防癌抗癌等功能。
【专利说明】-种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的新方 法 一、
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学的【技术领域】，具体涉及从萝卜籽或西兰花或油菜种子中提取 1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的方法。 二、
【背景技术】
[0002] 流行病学及药理学的广泛研究表明，癌症发病率低的地方，人们饮食中蔬菜、水果 所占比例较大，原因在于这些蔬菜水果中存在能阻止或减缓癌症发展的活性成分，如十字 花科蔬菜中的萝卜硫素、吲哚类物质，大豆中的大豆异黄酮等，均被证实有良好的防癌抗癌 作用。
[0003] 现代研究表明，萝卜籽中含有大量挥发油、油脂、多糖、蛋白质、生物碱和硫代葡 萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶。西兰花又名绿花菜、青花菜，是十字花科芸苔属甘蓝种中以绿 色花球为产品的一个变种，其种子中含有丰富的硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷可以在硫代 葡萄糖苷酶或酸的催化下，生成萝卜硫素等异硫氰酸盐。萝卜硫素的化学名为1-异硫氰 酸-4-甲磺酰基丁烷或1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烧，是迄今为止蔬菜中发现的 最强抗癌成分之一，它可诱导机体产生Phase II型解毒酶-谷胱甘肽转移酶和醌还原酶， 该酶能解除亲电子致癌物质的毒性作用，干扰其对DNA的结合及破坏，同时抑制Phase I酶 的产生，从而影响致癌终产物的形成。所以，从十字花科蔬菜中分离纯化萝卜硫素具有重要 的科学价值和广阔的市场前景。
[0004] 目前提取萝卜硫素的步骤分为杀酶，脱脂，萃取，水解，纯化。从十字花科蔬菜中 提取萝卜硫素的方法有：①申请号为200910098197. 6、名称为"一种萝卜硫素的提取方法" 的发明专利，该专利公开的方法是：用干燥西兰花种子或新鲜西兰花球为原料，粉碎加入 水，调节pH 4. 1?4. 5,加入粗芥子硫苷酸酶水解后冷冻干燥成粉末；加入丙酮，浸提，过 滤，将滤液真空浓缩成萝卜硫素粗品；然后将其通过硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合 液梯度洗脱，收集馏分，真空浓缩；用甲醇溶解，再经〇. 22 μ m微孔滤膜过滤后，用C18硅胶 装柱，采用甲醇水梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，真空干燥，得到萝卜硫素。该方法存在的 主要问题是：1.未对种子进行脱脂，由于油脂的阻挡，西兰花种子中的芥子苷和芥子硫苷 酸酶难以有效接触，导致萝卜硫素的生成率低；2.未对提取的芥子硫苷酸酶进行固定化， 游离酶的半衰期短，易失活；3.使用的有机溶剂-丙酮致酶蛋白变性能力强，导致芥子硫 苷酸酶大量变性而失活；4.在较高温度下真空干燥，萝卜硫素不稳定，易重排生成多种异 构体，产品纯度低。由于存在上述诸多缺陷，因此，该方法原料利用率低、萝卜硫素生成率 低,产品杂质多且含量高，丙酮回收率低而污染大，生产成本高，缺乏竞争力。②申请号为 201410253792. 3、名称为"一种制备高纯度萝卜硫素的方法"的发明专利，其公开的方法为： 以风干萝卜籽为原料，破碎后先用超临界C02脱脂；脱脂萝卜籽柏再用甲醇在70?75°C的 温度下提取硫代葡萄糖苷，浓缩，水溶解，乙酸乙酯萃取得到硫代葡萄糖苷提取液；将脱脂 萝卜籽柏用缓冲溶液溶解分散后同硫代葡萄糖苷提取液混合，控制温度、时间进行水解，得 到萝卜硫素粗提液；用SP850或聚酰胺吸附树脂从萝卜硫素粗提液中吸附萝卜硫素，先用 5?15 %的脱氧充氮甲醇-水洗脱液洗去杂质，再用60?80 %的脱氧充氮甲醇-水洗脱液 洗脱萝卜硫素，然后将萝卜硫素洗脱液进行反渗透浓缩、真空浓缩；液相色谱柱制备萝卜硫 素，真空浓缩，冷冻干燥，制备出纯度高达98%以上的产品。该方法存在的主要问题有：① 超临界C0 2脱脂效果差，仅能脱出萝卜籽中1/3的油脂，大部分油脂仍停留在脱脂萝卜籽柏 中，阻碍硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶的释放，影响水解效率和产品的质量；并且超临界 C02设备投资大，装置复杂，操作难度大；②0)2和夹带剂难以全部回收，甲醇-水洗脱液等 还需脱氧充氮，生产成本高；仅对萝卜籽进行了破碎处理，存在于细胞中的硫代葡萄糖苷和 硫代葡萄糖苷酶并未充分释放出来，在水解反应时，扩散的速率慢，扩散出来的量有限，导 致水解反应时间增加，相对的水解效率就降低了；③萝卜籽中的硫代葡萄糖苷含量较少，该 专利中并未外加硫代葡萄糖苷，所以水解得到的萝卜硫素产率较低。 三、
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有制备萝卜硫素的方法的不足之处，提供一种制备高纯度 萝卜硫素的新方法，该方法具有充分利用资源，萝卜硫素生成率高、操作简单、产品纯度高 达98 %以上，绿色无污染等特点。
[0006] 本发明的原理是：十字花科植物细胞中含有硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶， 在细胞处于完整状态时，两者分布于不同细胞器中，不能接触而发生反应；当细胞受到破 坏，两者即从细胞器中游离出并接触，发生水解反应。西兰花种子中硫代葡萄糖苷主要有 4-甲基亚磺酰基丁烯基硫代葡萄糖苷和3-甲基亚磺酰基丙烯基硫代葡萄糖苷，含量高达 40um 〇l/g，但其硫代葡萄糖苷酶专一性差，催化硫代葡萄糖苷水解反应产生多种异硫氰酸 盐、硫代氰酸盐、腈类化合物、噁唑烷硫酮等，且萝卜硫素生成率低，不宜用来发酵生产萝卜 硫素；萝卜籽中硫代葡萄糖苷含量虽不及西兰花种子，但细胞中的硫代葡萄糖苷酶专一性 强，水解硫代葡萄糖苷主要产物为萝卜硫素，是发酵生产萝卜硫素的优良素材；而且不同来 源的硫代葡萄糖苷会显著刺激宿主细胞硫代葡萄糖苷酶的活性，显著提高萝卜硫素的生成 率。因此，控制适当条件，以萝卜籽柏的硫代葡萄糖苷酶为催化剂，水解自身及来源于西兰 花或油菜种子的硫代葡萄糖苷，可显著提高萝卜硫素生成率。
[0007] 胶体磨通过转齿与定齿间的相对高速旋转，使物料受到强大剪切力、摩擦力、高频 振动、高速旋涡等物理作用，被有效粉碎、分散、均质、乳化，达到超细粉碎等效果。将灭酶西 兰花粉末和萝卜粉末分散液分别进行胶体磨处理，分别高效破坏两者的细胞结构，使硫代 葡萄糖苷及硫代葡萄糖苷酶充分释放，显著增加两者接触几率，增加萝卜硫素生成率；细胞 中的油脂和蛋白质随着其结构破坏而丧失附着场所，处于游离状态；油脂密度小于水溶液， 可用高速离心分离除去；蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最小，因此控制发酵液pH 值至蛋白质等电点，即可使蛋白质沉淀析出，再经离心分离，从体系中分离；萝卜硫素与其 它溶质存在结构差异，在反相C18硅胶上的吸附力不同，可用适当的洗脱液进行洗脱分离； 由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离效率高，可将其它杂质一一分离，制备出高纯度的 萝卜硫素；含有高纯度萝卜硫素的洗脱液经过低温真空浓缩和冷冻干燥，即获得纯度高达 98 %的萝卜硫素冻干物。
[0008] 本发明的目的是这样实现的：一种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷 的方法，以风干萝卜籽和西兰花种子或油菜籽为原料，经制备萝卜籽粉碎液、灭酶西兰花或 油菜籽分散液、脱脂精磨液、发酵液、脱蛋白发酵液、浓缩液、多糖干粉、高纯度萝卜硫素，制 备出纯度高达98%以上的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。其具体 的工艺步骤如下：
[0009] 1.制备萝卜籽粉碎液
[0010] 分别取水分含量低于4%的风干萝卜籽，以萝卜籽质量：冰水体积之比为 lkg : 1?5L的比例，将风干萝卜籽分散于冰水中，在搅拌下放料于旋片式粉碎机中粉碎。 粉碎完成后收集粉碎液，就得到萝卜籽粉碎液，用于制备脱脂精磨液。2.制备灭酶西兰花或 油菜籽分散液
[0011] 取西兰花种子或油菜籽，先用中药粉碎机粉碎，再用20?60目的不锈钢筛网进行 筛分，分别收集过筛物和未过筛物。对于未过筛的西兰花种子粉或油菜籽，返回破碎机进 行再次破碎；对于过筛的西兰花种子粉或油菜籽，送入流化床干燥机中，通入温度为110? 120°C、压力0. 14?0. 20Mpa的湿热水蒸汽，进行灭酶处理3?6min。灭酶处理完成后，按 西兰花种子粉或油菜籽质量：冰水体积之比为lkg : 1?4L的比例，将西兰花种子粉或油 菜籽加入冰水中，搅拌使其分散，获得灭酶西兰花或油菜籽分散液，用于制备脱脂精磨液。
[0012] 3.制备脱脂精磨液
[0013] 按照萝卜籽粉碎液体积：灭酶西兰花或油菜籽分散液体积之比为1L : 1. 5? 4. 5L，将第1步和第2步制备出的萝卜籽粉碎液和灭酶西兰花或油菜籽分散液混合均匀后 用胶体磨进行精磨，胶体磨定、转齿之间的间隙为60?150微米。精磨完成后收集精磨液， 送入碟式分离机中，在6000?lOOOOr/min的转速下进行脱脂分离。分别收集油脂层和脱 脂层悬浊液，对收集的油脂层，送入油脂精炼车间进行精炼，制备食用油；对收集的脱脂悬 浊液，即为脱脂精磨液，用于制备发酵液。
[0014] 4制备发酵液
[0015] 将第3步制备出的脱脂精磨液送入发酵罐中，先用稀柠檬酸酸溶液调节pH值至 4. 5?5. 5,再分别控制温度为25?35°C，搅拌速度为60?120r/min进行发酵处理1. 5? 4h。发酵处理完成后，将发酵物用160?250目的振动筛进行筛分分离。分别收集振动筛 分过滤液和振动筛分滤渣，对于收集的滤渣，再进行真空压榨过滤，分别收集压榨过滤液和 压榨滤渣。对收集的压榨过滤液，与收集的振动筛分过滤液合并，即为发酵液，用于制备脱 蛋白发酵液；对收集的压榨滤渣，与第5步制备的离心沉淀混合后进行气流干燥，用作饲料 添加剂。
[0016] 5制备脱蛋白发酵液
[0017] 将第4步收集的发酵液送入沉淀罐中，用稀盐酸调节pH至3. 5?4. 0,静止放置 10?30min后送入管式离心机，在12000?18000r/min的转速下进行离心分离，分别收集 离心清夜和离心沉淀，对收集的离心清夜，即为脱蛋白发酵液，用于制备浓缩液；对于收集 的离心沉淀，与第4步制备的压榨滤渣混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0018] 6制备浓缩液
[0019] 将第5步制备出的脱蛋白发酵液，泵入反渗透器中，在压力低于0.4MPa下进行反 渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20?30%时为止。分别收集反渗透截留 液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，即为萝卜硫素浓缩液，用于制备多糖干粉，对于收 集的反渗透滤过液，进行生化处理，达标后排放.
[0020] 7制备多糖干粉
[0021] 将第6步制备出的萝卜硫素浓缩液搅拌分散于多糖粉中，如食品级支链淀粉、精 制魔芋粉、玉米淀粉。萝卜硫素浓缩液体积：多糖质量之比为1L : 2?5kg，搅拌均匀后在 低温下真空干燥，控制干燥温度为35?45°C，干燥时间为10?15h，收集干燥后的萝卜硫 素多糖干粉，用于下步制备高纯度萝卜硫素冻干粉。
[0022] 8制备高纯度萝卜硫素
[0023] 将第7步制备出的萝卜硫素多糖干粉置于溶解罐中，加入无水甲醇，搅拌处理 20?30min后过滤。收集滤过液进行真空浓缩，控制真空度为0. 07?0. 09Mpa，温度35? 45°C，浓缩成膏状。浓缩完成后，再用甲醇浓度为3?6%的冰水将膏状物溶解，膏状物质 量：冰水体积之比为lkg : 5?10L，得到萝卜硫素冰水溶解液。
[0024] 将萝卜硫素冰水溶解液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜 硫素冰水溶解液体积：C18硅胶填料质量之比为1L : 50?80kg，控制条件分离萝卜硫素， 具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为700. OmL · min-1 ;A组分为甲 醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上 升至25%，B组分由95%下降至75% ;在15min?75min区间，流动相中的A组分由25% 上升至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?4lmin区间的洗脱液，在35?45°C下 进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30?50%时，就制备出萝卜硫素浓缩 液，收集的甲醇回收液进行再次蒸馏回收甲醇。
[0025] 将该萝卜硫素浓缩液置于冷冻干燥机中，在25?45Pa真空度、-50?_60°C温度 下，进行冷冻干燥24?36h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机 和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯） 丁烷。
[0026] 本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
[0027] 1.本发明方法在生产过程中使用胶体磨精磨、反渗透浓缩、制备色谱纯化及冷冻 干燥等简单工艺，操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低，便于推广应 用。在整个过程未添加有毒化学试剂处理，使得产品不会受到加入溶剂的影响，提高了产品 的纯度。
[0028] 2.本发明方法在生产过程中，选取含硫代葡萄糖苷多西兰花种子或油菜籽，硫代 葡萄糖苷酶含量高多且专一性强的萝卜籽，选择性的利用萝卜籽含有的专一性强的硫代葡 萄糖苷酶，水解来自于自身或西兰花种子或油菜种子中的硫代葡萄糖苷，显著提高酶的利 用率并极显著增加萝卜硫素的生成率。采用胶体磨精磨使物料充分破碎，硫代葡萄糖苷和 硫代葡萄糖苷酶、脂肪、蛋白质都从细胞中充分释放出来，增加了硫代葡萄糖苷和硫代葡萄 糖苷酶的反应几率，显著缩短了发酵所需要的时间。
[0029] 3.本发明方法在生产过程中，通过胶体磨研磨、油脂和蛋白质除杂、反渗透浓缩、 液相制备及真空浓缩的纯化步骤，其中由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离效率高，因 此制备出的产物纯度极高，达98%以上。
[0030] 4.萝卜硫素在水溶液中不稳定，本发明在生产过程中，使用了醇不溶的多糖作为 分散剂，然后再将水分在低温下蒸干，使得萝卜硫素与水分分开，采用低温真空干燥机和冷 冻干燥机两种仪器配合使用，不仅萝卜硫素不易氧化，而且也易于保存样品。
[0031] 5、对收集的油脂层进行精炼得到高纯的食用油，对收集的滤渣进行干燥后用作饲 料添加剂，这使得生产的产品和中间产物都得到了充分的利用，有效的节约了能源的同时 也降低了污染，整个生产过程安全、绿色无污染。
[0032] 本发明方法是节能减排、安全生产且成本低，便于推广应用的理想的方法。采用本 发明方法制备出的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷产品，可广泛应用 于医药、保健品行业中，有防癌抗癌等功能。 四、【具体实施方式】
[0033] 下面结合【具体实施方式】，进一步说明本发明。
[0034] 实施例1
[0035] -种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的方法，其具体步骤如下。1.制 备萝卜籽粉碎液
[0036] 分别取水分含量低于4%的风干萝卜籽，以萝卜籽质量：冰水体积之比为 lkg : 1L的比例，将风干萝卜籽分散于冰水中，在搅拌下放料于旋片式粉碎机中粉碎。粉碎 完成后收集粉碎液，就得到萝卜籽粉碎液，用于制备脱脂精磨液。
[0037] 2.制备灭酶西兰花或油菜籽分散液
[0038] 取西兰花种子或油菜籽，先用中药粉碎机粉碎，再用20目的不锈钢筛网进行筛 分，分别收集过筛物和未过筛物。对于未过筛的西兰花种子粉或油菜籽，返回破碎机进行再 次破碎；对于过筛的西兰花种子粉或油菜籽，送入流化床干燥机中，通入温度为ll〇°C、压 力0. 14Mpa的湿热水蒸汽，进行灭酶处理3min。灭酶处理完成后，按西兰花种子粉或油菜籽 质量：冰水体积之比为lkg : 1L的比例，将西兰花种子粉或油菜籽加入冰水中，搅拌使其 分散，获得灭酶西兰花或油菜籽分散液，用于制备脱脂精磨液。
[0039] 3.制备脱脂精磨液
[0040] 按照萝卜籽粉碎液体积：灭酶西兰花或油菜籽分散液体积之比为1L : 1. 5L，将 第1步和第2步制备出的萝卜籽粉碎液和灭酶西兰花或油菜籽分散液混合均匀后用胶体磨 进行精磨，胶体磨定、转齿之间的间隙为150微米。精磨完成后收集精磨液，送入碟式分离 机中，在6000r/min的转速下进行脱脂分离。分别收集油脂层和脱脂层悬浊液，对收集的油 脂层，送入油脂精炼车间进行精炼，制备食用油；对收集的脱脂悬浊液，即为脱脂精磨液，用 于制备发酵液。
[0041] 4制备发酵液
[0042] 将第3步制备出的脱脂精磨液送入发酵罐中，先用稀柠檬酸酸溶液调节pH值至 4. 5,再分别控制温度为25°C，搅拌速度为60r/min进行发酵处理4h。发酵处理完成后，将发 酵物用160目的振动筛进行筛分分离。分别收集振动筛分过滤液和振动筛分滤渣，对于收 集的滤渣，再进行真空压榨过滤，分别收集压榨过滤液和压榨滤渣。对收集的压榨过滤液， 与收集的振动筛分过滤液合并，即为发酵液，用于制备脱蛋白发酵液；对收集的压榨滤渣， 与第5步制备的离心沉淀混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0043] 5制备脱蛋白发酵液
[0044] 将第4步收集的发酵液送入沉淀罐中，用稀盐酸调节pH至3. 5,静止放置lOmin后 送入管式离心机，在12000r/min的转速下进行离心分离，分别收集离心清夜和离心沉淀， 对收集的离心清夜，即为脱蛋白发酵液，用于制备浓缩液；对于收集的离心沉淀，与第4步 制备的压榨滤渣混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0045] 6制备浓缩液
[0046] 将第5步制备出的脱蛋白发酵液，泵入反渗透器中，在压力低于0. 4MPa下进行反 渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20%时为止。分别收集反渗透截留液和 滤过液，对于收集的反渗透截留液，即为萝卜硫素浓缩液，用于制备多糖干粉，对于收集的 反渗透滤过液，进行生化处理，达标后排放.
[0047] 7制备多糖干粉
[0048] 将第6步制备出的萝卜硫素浓缩液搅拌分散于多糖粉中，如食品级支链淀粉、精 制魔芋粉、玉米淀粉。萝卜硫素浓缩液体积：多糖质量之比为1L : 2kg，搅拌均匀后在低温 下真空干燥，控制干燥温度为35°C，干燥时间为15h，收集干燥后的萝卜硫素多糖干粉，用 于下步制备高纯度萝卜硫素冻干粉。
[0049] 8制备高纯度萝卜硫素冻干粉
[0050] 将第7步制备出的萝卜硫素多糖干粉置于溶解罐中，加入无水甲醇，搅拌处理 20min后过滤。收集滤过液进行真空浓缩，控制真空度为0. 07Mpa，温度35°C，浓缩成膏 状。浓缩完成后，再用甲醇浓度为3%的冰水将膏状物溶解，膏状物质量：冰水体积之比为 lkg : 5L，得到萝卜硫素冰水溶解液。
[0051] 将萝卜硫素冰水溶解液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜 硫素冰水溶解液体积：C18硅胶填料质量之比为1L : 50kg，控制条件分离萝卜硫素，具体 的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为700. OmL · min-1 ;A组分为甲醇，B 组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上升至 25%，8组分由95%下降至75%;在1511^11?751^11区间，流动相中的4组分由25%上升 至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?41min区间的洗脱液，在35°C下进行真空 浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30%时，就制备出萝卜硫素浓缩液，收集的甲醇 回收液进行再次蒸馏回收甲醇。
[0052] 将该萝卜硫素浓缩液置于冷冻干燥机中，在25Pa真空度、-50°C温度下，进行冷冻 干燥24h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素冻干粉。经核磁共振、液质联机和旋光仪分 析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。
[0053] 实施例2
[0054] -种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的方法，其具体步骤如下。
[0055] 1.制备萝卜籽粉碎液
[0056] 分别取水分含量低于4%的风干萝卜籽，以萝卜籽质量：冰水体积之比为 lkg : 3L的比例，将风干萝卜籽分散于冰水中，在搅拌下放料于旋片式粉碎机中粉碎。粉碎 完成后收集粉碎液，就得到萝卜籽粉碎液，用于制备脱脂精磨液。
[0057] 2.制备灭酶西兰花或油菜籽分散液
[0058] 取西兰花种子或油菜籽，先用中药粉碎机粉碎，再用40目的不锈钢筛网进行筛 分，分别收集过筛物和未过筛物。对于未过筛的西兰花种子粉或油菜籽，返回破碎机进行再 次破碎；对于过筛的西兰花种子粉或油菜籽，送入流化床干燥机中，通入温度为115°C、压 力0. 17Mpa的湿热水蒸汽，进行灭酶处理5min。灭酶处理完成后，按西兰花种子粉或油菜籽 质量：冰水体积之比为lkg : 2. 5L的比例，将西兰花种子粉或油菜籽加入冰水中，搅拌使 其分散，获得灭酶西兰花或油菜籽分散液，用于制备脱脂精磨液。
[0059] 3.制备脱脂精磨液
[0060] 按照萝卜籽粉碎液体积：灭酶西兰花或油菜籽分散液体积之比为1L : 3L，将第 1步和第2步制备出的萝卜籽粉碎液和灭酶西兰花或油菜籽分散液混合均匀后用胶体磨进 行精磨，胶体磨定、转齿之间的间隙为1〇〇微米。精磨完成后收集精磨液，送入碟式分离机 中，在8000r/min的转速下进行脱脂分离。分别收集油脂层和脱脂层悬浊液，对收集的油脂 层，送入油脂精炼车间进行精炼，制备食用油；对收集的脱脂悬浊液，即为脱脂精磨液，用于 制备发酵液。
[0061] 4制备发酵液
[0062] 将第3步制备出的脱脂精磨液送入发酵罐中，先用稀柠檬酸酸溶液调节pH值至 5. 0,再分别控制温度为30°C，搅拌速度为90r/min进行发酵处理2. 5h。发酵处理完成后， 将发酵物用200目的振动筛进行筛分分离。分别收集振动筛分过滤液和振动筛分滤渣，对 于收集的滤渣，再进行真空压榨过滤，分别收集压榨过滤液和压榨滤渣。对收集的压榨过滤 液，与收集的振动筛分过滤液合并，即为发酵液，用于制备脱蛋白发酵液；对收集的压榨滤 渣，与第5步制备的离心沉淀混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0063] 5制备脱蛋白发酵液
[0064] 将第4步收集的发酵液送入沉淀罐中，用稀盐酸调节pH至3. 5,静止放置20min后 送入管式离心机，在16000r/min的转速下进行离心分离，分别收集离心清夜和离心沉淀， 对收集的离心清夜，即为脱蛋白发酵液，用于制备浓缩液；对于收集的离心沉淀，与第4步 制备的压榨滤渣混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0065] 6制备浓缩液
[0066] 将第5步制备出的脱蛋白发酵液，泵入反渗透器中，在压力低于0. 4MPa下进行反 渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到25%时为止。分别收集反渗透截留液和 滤过液，对于收集的反渗透截留液，即为萝卜硫素浓缩液，用于制备多糖干粉，对于收集的 反渗透滤过液，进行生化处理，达标后排放.
[0067] 7制备多糖于粉
[0068] 将第6步制备出的萝卜硫素浓缩液搅拌分散于多糖粉中，如食品级支链淀粉、精 制魔芋粉、玉米淀粉。萝卜硫素浓缩液体积：多糖质量之比为1L : 3. 5kg，搅拌均匀后在低 温下真空干燥，控制干燥温度为40°C，干燥时间为12h，收集干燥后的萝卜硫素多糖干粉， 用于下步制备高纯度萝卜硫素冻干粉。
[0069] 8制备高纯度萝卜硫素冻干粉
[0070] 将第7步制备出的萝卜硫素多糖干粉置于溶解罐中，加入无水甲醇，搅拌处理 25min后过滤。收集滤过液进行真空浓缩，控制真空度为0. 08Mpa，温度35?45°C，浓缩成 膏状。浓缩完成后，再用甲醇浓度为4. 5%的冰水将膏状物溶解，膏状物质量：冰水体积之 比为lkg : 7L,得到萝卜硫素冰水溶解液。
[0071] 将萝卜硫素冰水溶解液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜 硫素冰水溶解液体积：C18硅胶填料质量之比为1L : 65kg，控制条件分离萝卜硫素，具体 的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为700. OmL · min-1 ;A组分为甲醇，B 组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上升至 25%，B组分由95%下降至75% ;在15min?75min区间，流动相中的A组分由25%上升 至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?4lmin区间的洗脱液，在40°C下进行真空 浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到40%时，就制备出萝卜硫素浓缩液，收集的甲醇 回收液进行再次蒸馏回收甲醇。
[0072] 将该萝卜硫素浓缩液置于冷冻干燥机中，在30Pa真空度、-55°C温度下，进行冷冻 干燥30h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素冻干粉。经核磁共振、液质联机和旋光仪分 析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。
[0073] 实施例3
[0074] -种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的方法，其具体步骤如下。
[0075] 1.制备萝卜籽粉碎液
[0076] 分别取水分含量低于4%的风干萝卜籽，以萝卜籽质量：冰水体积之比为 lkg : 5L的比例，将风干萝卜籽分散于冰水中，在搅拌下放料于旋片式粉碎机中粉碎。粉碎 完成后收集粉碎液，就得到萝卜籽粉碎液，用于制备脱脂精磨液。
[0077] 2.制备灭酶西兰花或油菜籽分散液
[0078] 取西兰花种子或油菜籽，先用中药粉碎机粉碎，再用60目的不锈钢筛网进行筛 分，分别收集过筛物和未过筛物。对于未过筛的西兰花种子粉或油菜籽，返回破碎机进行再 次破碎；对于过筛的西兰花种子粉或油菜籽，送入流化床干燥机中，通入温度为120°C、压 力0. 20Mpa的湿热水蒸汽，进行灭酶处理3min。灭酶处理完成后，按西兰花种子粉或油菜籽 质量：冰水体积之比为lkg : 4L的比例，将西兰花种子粉或油菜籽加入冰水中，搅拌使其 分散，获得灭酶西兰花或油菜籽分散液，用于制备脱脂精磨液。
[0079] 3.制备脱脂精磨液
[0080] 按照萝卜籽粉碎液体积：灭酶西兰花或油菜籽分散液体积之比为1L : 4. 5L，将 第1步和第2步制备出的萝卜籽粉碎液和灭酶西兰花或油菜籽分散液混合均匀后用胶体磨 进行精磨，胶体磨定、转齿之间的间隙为60微米。精磨完成后收集精磨液，送入碟式分离机 中，在lOOOOr/min的转速下进行脱脂分离。分别收集油脂层和脱脂层悬浊液，对收集的油 脂层，送入油脂精炼车间进行精炼，制备食用油；对收集的脱脂悬浊液，即为脱脂精磨液，用 于制备发酵液。
[0081] 4制备发酵液
[0082] 将第3步制备出的脱脂精磨液送入发酵罐中，先用稀柠檬酸酸溶液调节pH值至 5. 5,再分别控制温度为35°C，搅拌速度为120r/min进行发酵处理1. 5h。发酵处理完成后， 将发酵物用250目的振动筛进行筛分分离。分别收集振动筛分过滤液和振动筛分滤渣，对 于收集的滤渣，再进行真空压榨过滤，分别收集压榨过滤液和压榨滤渣。对收集的压榨过滤 液，与收集的振动筛分过滤液合并，即为发酵液，用于制备脱蛋白发酵液；对收集的压榨滤 渣，与第5步制备的离心沉淀混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0083] 5制备脱蛋白发酵液
[0084] 将第4步收集的发酵液送入沉淀罐中，用稀盐酸调节pH至4. 0,静止放置30min后 送入管式离心机，在18000r/min的转速下进行离心分离，分别收集离心清夜和离心沉淀， 对收集的离心清夜，即为脱蛋白发酵液，用于制备浓缩液；对于收集的离心沉淀，与第4步 制备的压榨滤渣混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂。
[0085] 6制备浓缩液
[0086] 将第5步制备出的脱蛋白发酵液，泵入反渗透器中，在压力低于0. 4MPa下进行反 渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到30%时为止。分别收集反渗透截留液和 滤过液，对于收集的反渗透截留液，即为萝卜硫素浓缩液，用于制备多糖干粉，对于收集的 反渗透滤过液，进行生化处理，达标后排放.
[0087] 7制备多糖干粉
[0088] 将第6步制备出的萝卜硫素浓缩液搅拌分散于多糖粉中，如食品级支链淀粉、精 制魔芋粉、玉米淀粉。萝卜硫素浓缩液体积：多糖质量之比为1L : 5kg，搅拌均匀后在低温 下真空干燥，控制干燥温度为45°C，干燥时间为10h，收集干燥后的萝卜硫素多糖干粉，用 于下步制备高纯度萝卜硫素冻干粉。
[0089] 8制备高纯度萝卜硫素冻干粉
[0090] 将第7步制备出的萝卜硫素多糖干粉置于溶解罐中，加入无水甲醇，搅拌处理 30min后过滤。收集滤过液进行真空浓缩，控制真空度为0. 09Mpa，温度45°C，浓缩成膏 状。浓缩完成后，再用甲醇浓度为6%的冰水将膏状物溶解，膏状物质量：冰水体积之比为 lkg : 10L，得到萝卜硫素冰水溶解液。
[0091] 将萝卜硫素冰水溶解液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜 硫素冰水溶解液体积：C18硅胶填料质量之比为1L : 80kg，控制条件分离萝卜硫素，具体 的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为700. OmL · min-1 ;A组分为甲醇，B 组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上升至 25%，8组分由95%下降至75%;在1511^11?751^11区间，流动相中的4组分由25%上升 至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?41min区间的洗脱液，在45°C下进行真空 浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到50%时，就制备出萝卜硫素浓缩液，收集的甲醇 回收液进行再次蒸馏回收甲醇。
[0092] 将该萝卜硫素浓缩液置于冷冻干燥机中，在45Pa真空度、-60°C温度下，进行冷冻 干燥36h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素冻干粉。经核磁共振、液质联机和旋光仪分 析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。
【权利要求】
1. 一种制备1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的新方法，其特征在于具体方法 步骤如下： (1) 、制备萝卜籽粉碎液 分别取水分含量低于4%的风干萝卜籽，以萝卜籽质量：冰水体积之比为lkg : 1? 5L的比例，将风干萝卜籽分散于冰水中，在搅拌下放料于旋片式粉碎机中粉碎，粉碎完成后 收集粉碎液，就得到萝卜籽粉碎液，用于制备脱脂精磨液； (2) 、制备灭酶西兰花或油菜籽分散液 取西兰花种子或油菜籽，先用中药粉碎机粉碎，再用20?60目的不锈钢筛网进行筛 分，分别收集过筛物和未过筛物，对于未过筛的西兰花种子粉或油菜籽，返回破碎机进行 再次破碎；对于过筛的西兰花种子粉或油菜籽，送入流化床干燥机中，通入温度为110? 120°C、压力0. 14?0. 20Mpa的湿热水蒸汽，进行灭酶处理3?6min，灭酶处理完成后，按西 兰花种子粉或油菜籽质量：冰水体积之比为lkg : 1?4L的比例，将西兰花种子粉或油菜 籽加入冰水中，搅拌使其分散，获得灭酶西兰花或油菜籽分散液，用于制备脱脂精磨液； (3) 、制备脱脂精磨液 按照萝卜籽粉碎液体积：灭酶西兰花或油菜籽分散液体积之比为1L : 1. 5?4. 5L， 将第1步和第2步制备出的萝卜籽粉碎液和灭酶西兰花或油菜籽分散液混合均匀后用胶体 磨进行精磨，胶体磨定、转齿之间的间隙为60?150微米，精磨完成后收集精磨液，送入碟 式分离机中，在6000?lOOOOr/min的转速下进行脱脂分离，分别收集油脂层和脱脂层悬浊 液，对收集的油脂层，送入油脂精炼车间进行精炼，制备食用油；对收集的脱脂悬浊液，即为 脱脂精磨液，用于制备发酵液； (4) 、制备发酵液 将第3步制备出的脱脂精磨液送入发酵罐中，先用稀柠檬酸酸溶液调节pH值至4. 5? 5. 5,再分别控制温度为25?35°C，搅拌速度为60?120r/min进行发酵处理1. 5?4h， 发酵处理完成后，将发酵物用160?250目的振动筛进行筛分分离，分别收集振动筛分过 滤液和振动筛分滤渣，对于收集的滤渣，再进行真空压榨过滤，分别收集压榨过滤液和压榨 滤渣，对收集的压榨过滤液，与收集的振动筛分过滤液合并，即为发酵液，用于制备脱蛋白 发酵液；对收集的压榨滤渣，与第5步制备的离心沉淀混合后进行气流干燥，用作饲料添加 剂； (5) 、制备脱蛋白发酵液 将第4步收集的发酵液送入沉淀罐中，用稀盐酸调节pH至3. 5?4. 0,静止放置10? 30min后送入管式离心机，在12000?18000r/min的转速下进行离心分离，分别收集离心清 夜和离心沉淀，对收集的离心清夜，即为脱蛋白发酵液，用于制备浓缩液；对于收集的离心 沉淀，与第4步制备的压榨滤渣混合后进行气流干燥，用作饲料添加剂； (6) 、制备浓缩液 将第5步制备出的脱蛋白发酵液，泵入反渗透器中，在压力低于0. 4MPa下进行反渗透 浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20?30%时为止，分别收集反渗透截留液和 滤过液，对于收集的反渗透截留液，即为萝卜硫素浓缩液，用于制备多糖干粉，对于收集的 反渗透滤过液，进行生化处理，达标后排放； (7) 、制备多糖干粉 将第6步制备出的萝卜硫素浓缩液搅拌分散于多糖粉中，如食品级支链淀粉、精制魔 芋粉、玉米淀粉，萝卜硫素浓缩液体积：多糖质量之比为1L : 2?5kg，搅拌均匀后在低温 下真空干燥，控制干燥温度为35?45°C，干燥时间为10?15h，收集干燥后的萝卜硫素多 糖干粉，用于下步制备高纯度萝卜硫素冻干粉； (8)、制备高纯度萝卜硫素冻干粉 将第7步制备出的萝卜硫素多糖干粉置于溶解罐中，加入无水甲醇，搅拌处理20? 30min后过滤，收集滤过液进行真空浓缩，控制真空度为0. 07?0. 09Mpa，温度35?45°C， 浓缩成膏状，浓缩完成后，再用甲醇浓度为3?6%的冰水将膏状物溶解，膏状物质量：冰 水体积之比为lkg : 5?10L，得到萝卜硫素冰水溶解液；将萝卜硫素冰水溶解液泵入以反 相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素冰水溶解液体积：C18硅胶填料质量 之比为1L : 50?80kg，控制条件分离萝卜硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm, 柱温为25°C，流速为700. OmL · min-1 ;A组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在 〇111；[11?151]1；[11区间，流动相中的六组分由5(%上升至25 (%,13组分由95(%下降至75(%;在 15min?75min区间，流动相中的A组分由25 %上升至65 %，B组分由75 %下降至35 %，收 集37?41min区间的洗脱液，在35?45°C下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量 浓度达到30?50%时，就制备出萝卜硫素浓缩液，收集的甲醇回收液进行再次蒸馏回收甲 醇；将该萝卜硫素浓缩液置于冷冻干燥机中，在25?45Pa真空度、-50?-60°C温度下，进 行冷冻干燥24?36h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素冻干粉，经核磁共振、液质联机 和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯） 丁烷。
【文档编号】A23K1/14GK104152504SQ201410391946
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月3日 优先权日:2014年8月3日
【发明者】刘庆海, 颜李秀, 周小华, 蒋小琴, 王江, 杨志雄, 赵春花 申请人:重庆海巨农业发展有限公司, 重庆大学