本发明涉及一种小白菜游离小孢子诱导培养基配方，具体涉及一种可以大大提高小白菜游离小孢子胚性愈伤组织诱导效率、具有重要应用价值的小白菜游离小孢子诱导培养基配方，属于蔬菜培育高新技术领域。
背景技术：
小白菜（Brassica campestris L.ssp. chinensis）属于十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，又称不结球白菜、青菜、小油菜，包括白菜（普通白菜）、菜心、乌塌菜、薹菜等多个变种，原产我国，是我国各地普遍栽培的蔬菜作物。由于其食用性强，营养丰富，品质优良，风味各异，深受人们喜爱，而且小白菜生产期短，适应性强，生产成本低，可常年栽培，周年供应，生产采收方便，在各大中城市蔬菜市场上占有重要位置。近年来，东南亚及欧美的一些国家也广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜。
随着小白菜国际国内市场需求的紧俏，优质、抗病、丰产的小白菜良种培育成为蔬菜培育科研人员的研究主题之一。小白菜是异花授粉植物，杂交优势非常明显，目前主要采用杂交育种方法进行小白菜新品种培育。传统杂交育种方法存在周期长、效率低等突出问题，育成一个稳定优良自交系一般需要6-8年，甚至更长时间，选育自交系非常费事、费工。近年来随着人工成本的增加，常规育种的不足在实际工作中日渐明显。因此，迫切需求小白菜育种的新途径和新方法。
近几年来随着单倍体育种在芸苔属农作物上的应用研究, 充分证明单倍体育种与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。游离小孢子培养是单倍体育种技术中快速获得纯系的一种有效方法，同单倍体育种技术中的花药培养相比，游离小孢子培养消除了小孢子和花药壁、级链层细胞之间可能存在的营养竞争，往往培养成功的基因型多，胚状体诱导频率也高，同时去除了花药壁、级链层细胞等体细胞再生植株的干扰，从而可以提高选择的准确性，提高育种效率和品种质量。
在芸薹属作物中，先后对油菜、芥菜、甘蓝、大白菜、小白菜和花椰菜等进行了游离小孢子培养并获得了再生植株。国内外学者对影响芸薹属作物游离小孢子培养的一些因素进行了研究，取得了显著的进展，通过优化培养基和改进培养方法，使部分材料小孢子胚诱导率有了提高。小白菜游离小孢子培养最早见于曹鸣庆等的报道，通过游离小孢子培养首先获得了小白菜小孢子胚状体，李岩等和蒋武生等获得了类似的结果，此后相关报道甚少。但是近年来小白菜游离小孢子培养研究进展缓慢，利用这项技术进行小白菜育种的研究鲜见报道，主要原因是小孢子胚性愈伤诱导率低而不稳定，直接限制了小白菜游离小孢子培养技术在育种上的应用。
培养基是游离小孢子培养的物质基础，直接关系到小孢子的生长与分化，培养基组分对小孢子的刺激和启动，是游离小孢子能否诱导成功的最关键的因素。培养基组分的合适配比，可显著影响小孢子诱导效率，一些有机和无机添加物，可以显著提高小孢子诱导效率。目前有研究发现，相对于禾本科和茄科作物，低离子浓度的基本培养基配方对十字花科小孢子诱导更加有利，活性炭等一些添加物可以显著提高小白菜游离小孢子的诱导能力。因此，继续优化组合基本培养基配比，发掘和试验针对于提高小白菜游离小孢子成胚诱导能力的有机无机添加物，是建立小白菜游离小孢子高效诱导培养体系的关键。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可以大大提高小白菜游离小孢子胚性愈伤组织诱导效率、具有重要应用价值的小白菜游离小孢子诱导培养基配方。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种小白菜游离小孢子诱导培养基配方，其特征在于：该培养基的配方如下：
KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 15-19mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 130～150mg/L，L-谷氨酰胺 450-550mg/L，维生素B1 0.45-0.55mg/L，维生素B6 0.45-0.55mg/L，烟酸 4.5-5.5mg/L，叶酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 140-180mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，L-谷胱甘肽 27-33mg/L，甲基亚硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝胶 3.0-3.5g/L，6-BA 0.15-0.25mg/L，NAA 0.3-0.4mg/L，聚乙二醇 0.14-0.18g/L，水解蛋白 1.3-1.7g/L，活性炭 0.015-0.025g/L，植物硫化激动素PSK-α 40-50pmol/L，pH 5.3-5.5。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明根据禾本科和茄科小孢子诱导培养基配方，针对于小白菜游离小孢子的孢子体发育特性，继续优化并组合基本培养基配比，低离子浓度基本培养基的组配，有利于小白菜游离小孢子的诱导；采用低含量的植物凝胶，使配制成的培养基半固体化，对小白菜游离小孢子的诱导更有利；发掘和试验针对于提高小白菜游离小孢子成胚诱导能力的有机添加物和无机添加物，AgNO3、氯化2-羟乙基三甲铵、L-谷氨酰胺、叶酸、生物素、L-谷胱甘肽、甲基亚硝基脲、聚乙二醇、水解蛋白、活性炭、植物硫化激动素PSK-α等物质的合适浓度的添加，均不同程度的提高了小白菜游离小孢子的诱导率；6-BA和NAA植物激素的复配，显著提高了小白菜游离小孢子的诱导能力。
本发明所提供的小白菜游离小孢子诱导培养基，是在现有研究发现基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高游离小白菜小孢子胚性愈伤组织的诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种小白菜游离小孢子诱导培养基配方，其特征在于：该培养基的配方如下：
KNO3 56-64mg/L，MgSO4∙7H2O 60-65mg/L，KH2PO4 65-70mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 200-250mg/L，Na2-EDTA 11-14mg/L，FeSO4∙7H2O 12-15mg/L，MnSO4∙4H2O 23-27mg/L，AgNO3 15-19mg/L，H3BO3 8.0-8.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5-9.5mg/L，KI 0.4-0.45mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2-0.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02-0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02-0.03mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 130～150mg/L，L-谷氨酰胺 450-550mg/L，维生素B1 0.45-0.55mg/L，维生素B6 0.45-0.55mg/L，烟酸 4.5-5.5mg/L，叶酸 0.04-0.06mg/L，生物素 0.04-0.06mg/L，肌醇 140-180mg/L，甘氨酸 3.5-4.5mg/L，L-谷胱甘肽 27-33mg/L，甲基亚硝基脲 1.2-1.8g/L，蔗糖 120-140g/L，植物凝胶 3.0-3.5g/L，6-BA 0.15-0.25mg/L，NAA 0.3-0.4mg/L，聚乙二醇 0.14-0.18g/L，水解蛋白 1.3-1.7g/L，活性炭 0.015-0.025g/L，植物硫化激动素PSK-α 40-50pmol/L，pH 5.3-5.5。
将待试验小白菜种子在前一年秋季播于大田，自然越冬后于第2年春季3-4月小白菜初花期进行取材，选择2.2mm-3.2mm的花蕾带回实验室，置于4℃冰箱内低温预处理1-2d。接种前，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗三次以充分除去氯化汞残毒。沥干水分后，在B5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子。悬浮液经40μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，800rpm下离心3min，沉淀物加5mL B5洗涤培养基，摇匀，800rpm下离心2min，重复两次，所得沉淀物即为小白菜游离小孢子。将小白菜游离小孢子转移入本发明的小白菜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。
实施例
配制本发明所述的一种小白菜游离小孢子诱导培养基，培养基配方具体如下：
KNO3 60mg/L，MgSO4∙7H2O 62.5mg/L，KH2PO4 67.5mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 225mg/L，Na2-EDTA 12.5mg/L，FeSO4∙7H2O 13.5mg/L，MnSO4∙4H2O 25mg/L，AgNO3 17mg/L，H3BO3 8.25mg/L，ZnSO4∙7H2O 9mg/L，KI 0.425mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.25mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl2∙6H2O 0.025mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 140mg/L，L-谷氨酰胺 500mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 5mg/L，叶酸 0.05mg/L，生物素 0.05mg/L，肌醇 160mg/L，甘氨酸 4mg/L，L-谷胱甘肽 30mg/L，甲基亚硝基脲 1.5g/L，蔗糖 130g/L，植物凝胶 3.25g/L，6-BA 0.2mg/L，NAA 0.35mg/L，聚乙二醇 0.16g/L，水解蛋白 1.5g/L，活性炭 0.02g/L，植物硫化激动素PSK-α 45pmol/L，pH 5.4。
2013年秋季将待试验小白菜品种常州长白梗和合肥小叶菜的种子大田播种，自然越冬后于第2年春季3-4月小白菜初花期进行取材，选择2.2mm-3.2mm的花蕾带回实验室，置于4℃冰箱内低温预处理1-2d。接种前，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗三次以充分除去氯化汞残毒。沥干水分后，在B5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子。悬浮液经40μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，800rpm下离心3min，沉淀物加5mL B5洗涤培养基，摇匀，800rpm下离心2min，重复两次，所得沉淀物即为小白菜游离小孢子。将小白菜游离小孢子转移入本发明的小白菜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。胚性愈伤组织形成后分别统计常州长白梗和合肥小叶菜的小孢子愈伤组织诱导率。小孢子愈伤组织诱导率=愈伤块数/接种花蕾总数×100%。
为了比较本发明所提供的小白菜游离小孢子诱导培养基与前人采用的培养基对小白菜游离小孢子胚性愈伤组织诱导效率的差异，我们另外选择了2种前人采用过的小白菜游离小孢子诱导培养基，试验品种亦采用常州长白梗和合肥小叶菜，游离小孢子的分离方法、组培操作方法、培养方法均相同，胚性愈伤组织形成后分别统计常州长白梗和合肥小叶菜的小孢子在该2种培养基内的小孢子愈伤组织诱导率。
其它2种小白菜游离小孢子诱导培养基配方为：
大量减半改良B5培养基+0.8g/L活性炭+0.3g/L谷氨酰胺，pH为5.8（对比文件来自于刘如娥等《小白菜花药培养胚诱导和植株再生》）；
NLN-13培养基+0.5g/L活性炭，pH为5.8（对比文件来自于蒋武生等《活性炭对小白菜小孢子培养的影响》）。
培养基对比实验
将采用本发明所提供的培养基诱导常州长白梗和合肥小叶菜游离小孢子统计所得的小孢子愈伤组织诱导率与对比实施例的常州长白梗和合肥小叶菜小孢子愈伤组织诱导率进行比较，比较的结果如下表1所示。
由表1可以发现，本发明所提供的小白菜游离小孢子诱导培养基对小白菜品种常州长白梗和合肥小叶菜的小孢子愈伤组织诱导率平均值达到了16.7个/蕾，而前人所采用的两种培养基对小白菜品种常州长白梗和合肥小叶菜的小孢子愈伤组织诱导率平均值分别仅为2.9个/蕾和5.1个/蕾，可以发现本发明所提供的小白菜游离小孢子诱导培养基对小白菜游离小孢子的诱导能力做出了显著的提升。
本发明所提供的小白菜游离小孢子诱导培养基，是在现有研究发现基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高游离小白菜小孢子胚性愈伤组织的诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。