专利名称：：α-乳清蛋白基因构建物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组的基因构建物，该构建物可表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。人乳相对牛乳、绵羊乳、驼乳、山羊乳等其他类型的乳有更优越的营养价值，有助于人类婴幼儿生长。然而许多母亲认为乳房喂乳困难或不便。在婴幼儿食品需求量极大的国家，也极其需要提供一种有人乳营养价值的乳制品。人乳相对其他哺乳动物(例如牛或绵羊)乳的主要区别之一在于，它含α-乳清蛋白作为主要乳清蛋白。尽管α-乳清蛋白也存在于其他种类的乳中，但其浓度相对较低，主要乳清蛋白为β-乳球蛋白。α-乳清蛋白水平在种与种之间不同，人乳含量约为2.5mg/ml，牛乳0.5-1.0mg/ml，鼠乳0.1-0.8mg/ml。编码牛α-乳清蛋白及人α-乳清蛋白的基因序列已得到阐明；有类序列信息分别由Vilotte等在Biochemie69609-620(1987)和Hall等在BiochemJ242735-742(1987)发表。本发明寻求利用基因工程技术构建重组的基因，使得这种重组基因构建物在哺乳类细胞中表达时即可在乳中产生含量高于1.0mg/ml，如1.2mg/ml或更高的α-乳清蛋白。所述构建物一般适于在非人类的动物细胞尤其是牛细胞中表达。一方面，本发明提供了一种适于在非人类动物细胞优选牛细胞中表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分的重组表达系统。优选地，本发明的重组表达系统适于表达人类α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。本文使用的术语“表达系统”是指包括蛋白编码区并连结到所有对蛋白表达必要的遗传信号的基因序列。任选地，表达系统也包括诸如启动子、增强子等调节元件以增强蛋白编码区域的转录和/或翻译，或者控制表达。调节元件可位于蛋白编码区域的上游或下游，或者位于蛋白编码区的内含子(非编码部分)中。蛋白编码区域序列自身具有调节能力也是可能的。术语“功能等价物”指任何与参考序列或蛋白功能实质等价的衍生物。“功能等价物”尤其包括那些核苷酸和/或氨基酸序列被插入、缺失或替换但对生物学功能尤其是产乳生物学功能没有明显不利影响的衍生物。基因工程对研究或是对商业目的均是有力的技术。使用基因工程技术(见Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982和“PrincipleofGeneticEngineening”，OldandPrimrose，第5版，1994，两文均引为文献)可将外源遗传物质转入宿主细胞，在其中复制和/或表达由该外源遗传物质编码的蛋白或多肽。为了操作简便，遗传工程通常用原核微生物如E.coli等作宿主，但也使用真核生物尤其如酶母、藻类等。在一些应用中也使用真核细胞培养。Brinster等在Cell27223-231，1981中描述了将基因显微注入单细胞胚胎原核中所引起的哺乳类基因改变。这里外源遗传物质引入动物受精卵中，该受精卵在植入养母体内后进一步以正常方式发育成胚胎。真正的转基因动物在每一细胞中均含有外源DNA拷贝。一旦注入的遗传物质成功整合到宿主染色体，该动物即称为“转基因动物”并且转移的基因以正常的孟德尔方式遗传，但基因转移操作成功率较低，尤其是对大型饲养动物如猪、羊、牛等。至今还不可能控制转移的基因整合进入宿主染色体的位置。一定条件下仅产生“镶嵌型”的供体动物对于本发明的目的来说已经是很充分的。此时转移的基因整合到仅仅一定器官的染色体中。镶嵌型动物一般通过将外源DNA引入发育较晚期的胚胎而得到。牲畜转基因的最具前景的应用之一是，利用哺乳动物乳房作为“生物反应器”生产含药用及营养价值重组蛋白的乳。对表达外源蛋白而言，哺乳动物乳房因其以分泌方式大量生产蛋白而颇具吸引力。重组DNA技术可用来改变用于人或动物消费的牛乳的蛋白成份，如在牛乳中表达人乳蛋白可增加其作为婴幼儿食品的营养价值。(Strijker等，HarnessingBiotechnologyforthe21stCentury，LadischandBoser编辑，美国化学协会，38-21页(1992))。用普通和高级饲养技术繁殖多产动物从而较便宜地增加产量对上述重组技术应用是有益的。在哺乳动物乳房表达转基因的第一步是克隆感兴趣蛋白的基因。为了使蛋白表达到乳中，一般使用在乳中表达主要乳蛋白基因的启动子。乳蛋白基因受到严格调节，在非乳房组织中不表达，以使对其它组织负面影响的可能性降到最小。用来在乳房中表达异源蛋白的调节基因有α-S1-酪蛋白(Strijkeret.，1992，上述文献)，β-乳球蛋白(Wright等，生物技术9831-834(1991))，乳清酸性蛋白(Ebert和Schindler，转基因农用动物进展报告(1993))和β-酪蛋白(EbertSchindler，1993，上述文献)。新的基因构建物在用于牛之前一般先在转基因小鼠中检验。对得自转基因小鼠的乳作重组蛋白定量分析，如果乳量充足，可分离蛋白检查其结构特征和生物活性。对用于牛的特定构建物的选择主要考虑表达水平和所产生的重组蛋白的真实程度。牛的转基因通常始自注射数百拷贝的基因构建物到合子两个原核中的一个。合子取自体内输卵管(Roschlau等，ArchTierz，Berlin313-8(1988)；Roschlau等，繁殖与受精杂志(Suppl38)，哺乳动物卵操作的细胞生物学，Greve等编辑(1989)；Hill等，Theriogenology37222(1992)；Bowenetal.生物繁殖50664-448(1994))或对体外成熟的卵作体外受精(Krimpenforth等，生物技术9844-847(1991)；Hill等，1992，上述文献；Bowen等，1993上述文献)。牛的合子需在15,000×g离心数分钟从中除掉不透明的脂类，以便用相差显微镜，Nomarski和Hoffman干涉相差显微镜观察原核。将2-4pl含数百个DNA构建物拷贝的缓冲液注入原核。转基因被认为是整合进入到染色体DNA的随机断点，该断点由显微注射中机械裂解产生。最理想的是，转基因在合子阶段DNA复制前整合，确保成体中每个细胞含有转基因。一般转基因的数个“拷贝”成线状连结，整合到单个染色体的单个位点。整合位点是随机的。整合可能在第一轮DNA复制后发生，也可能晚至2或4细胞阶段发生(WallandSeidel，1992)，产生转基因镶嵌型的动物。高至30％的可在体细胞组织检查到转基因的动物不向后代传递该转基因(或传递率低于预期的50％)。显微注射后，胚胎直接转移到受体的输卵管内或者培养数天后转移到受体牛的子宫内。通过对初生牛犊组织样品的Southern印迹分析，证明转基因的整合。而转基因的表达通过分析适当组织中的基因产物来测定，本发明是分析乳中的基因产物量。显微注射后胚胎存活率，转基因整合频率，表达频率和水平，配子系传递频率，均因注射的DNA构建物的量和质、所使用的小鼠品系(Brinster等，ProcNatlAcadSciUSA824438-4442(9185))及操作人员的技术技巧不同而相异。此基本方法已用于生产转基因绵羊(Wright等，1991，上述文献)，转基因山羊(EbertandSchinder，1993，上述文献)，转基因猪(Rexroad和Purcel，第11届动物繁殖国际会议A.I.Dublin529-35(1988))和转基因牛(Krimpenfort等，1991，上述文献；Hill等，1992，上述文献；Bowen等，1994，上述文献)。WO-A-88/01648(Immunex公司)，WO-A-88/00239和WO-A-90/05188(均为药物蛋白质有限公司所有)也作为参考文献，其描述了重组基因构建，整合重组基因的转基因动物生产，在哺乳期成年雌性哺乳动物乳房中表达编码蛋白表达所采用的合适的技术和方法。这些及上述文献均引入本文作参考。Stacey等在分子及细胞生物学14(2)1009-1016(1994年2月)的文章也引为参考文献，该文描述了小鼠α-乳清蛋白基因被人α-乳清蛋白基因代替的剔除实验。然而该论文未报道α-乳清蛋白的表达。在一个实施方案中，本发明提供了一种表达系统，该系统是用不同于替换天然存在基因的技术的其它技术来产生。另一方面，本发明提供了一种转基因哺乳动物，该动物的细胞整合了适于表达α-乳清蛋白(优选人α-乳清蛋白)或其功能等价物或其部分的重组表达系统。重组表达系统一般整合入转基因动物的基因组中，可以遗传，因此其后代也含有转基因并因此也包括在本发明内。合适的转基因动物包括(但不限于)绵羊、猪、牛、山羊，尤其优选牛。另外，本发明包括含这种重组表达系统的载体，还包括用这种重组表达系统转化的宿主细胞(任选地以载体形式转化)。另一方面，本发明提供了通过重组表达系统表达生产的α-乳清蛋白，希望的是在转基因哺乳动物中生产这种α-乳清蛋白。α-乳清蛋白基因在哺乳期雌性哺乳动物乳房中自然活化，因此本发明重组表达系统表达的蛋白将在此期间生产并作为乳的成分分泌。也可通过激素或其他方法诱导乳分泌而生产感兴趣的蛋白。含α-乳清蛋白的加工过的乳制品也在本发明范围内。在一优选实施方案中，重组表达系统包括如下构建物，命名为pHA1，pHA2，pBBHA，pOBHA，pBAHA，pBova-A或pBova-B。构建物pHA1，pHA2，pBBHA，pOBHA和pBAHA表达人α-乳清蛋白因此优选，尤其优选pHA2。构建物pHA2于1995年2月15日保藏于NCIMB，保藏号NCIMB40709。含上列特定构建物的类似转基因哺乳动物是优选的。进一步发现，本发明获得的乳除了每单位体积中α-乳清蛋白浓度增加外，产乳量也增加。这个发现是未曾预料的，因此，含人α-乳清蛋白基因(或功能等价物或其部分)的构建物和转基因动物(特别是牛)均为本发明的优选实施方案。尽管我们不希望受理论束缚，但据信人α-乳清蛋白基因的启动子区域仅对α-乳清蛋白在人体内增强的天然表达有部分作用。据信增强表达可通过将蛋白编码区3’和/或5’旁侧序列包括在本发明重组表达系统中而获得。人α-1ac基因蛋白编码区的3’和5’旁侧序列已首次测序。3’旁侧区的部分序列(核苷酸1-264，1331-2131，2259-2496，2519-2680和3481-3952)示于SEQIDNOS.16至20，同时5’旁侧的全序列示于SEQIDNO.21。实验中观察到，包含任一或两者序列均会使α-乳清蛋白的表达水平大大增加。表达的增加也会在蛋白编码区域为非人α-乳清蛋白时观察到。序列SEQIDNOS.16-20和21据信都对α-乳清蛋白在人乳中高水平表达有用，因此组成本发明的另一方面。另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，具有与SEQIDNOS.16-20中任一个或SEQIDNO.21或其一部分或其功能等价物基本相同的序列。这种多核苷酸形式多样(如DNA或RNA，双链或单链)，但一般双链DNA最为方便。本发明的多核苷酸可作为重组基因构建物的一部分存在，而后者包括在载体之中(如表达载体)或整合入转基因动物的染色体内。任何包括上述多核苷酸的载体或转基因动物构成本发明的一另个方面。从再一方面看，本发明提供了一种重组表达系统(优选适于表达α-乳清蛋白(优选人α-乳清蛋白)或其部分或其功能等价物)，所述重组表达系统包括选自野生型α-乳清蛋白基因的EcoRI与XhoI限制位点间的多核苷酸和野生型人α-乳清蛋白基因的BamHI和EcoRI位点间的多核苷酸的多核苷酸，或者其部分或其功能等价物。在一优选的实施方案中，本发明的重组表达序列包括上述多核苷酸，其部分和其功能等价物。本发明还包括含上述重组表达系统的载体和用这种载体转化的细胞。本发明进一步包括转基因动物，其中的转基因包含重组表达系统。图1，如实施例1中所述，示出牛α-乳清蛋白PCR引物序列。图2，如实施例1和实施例4所述，示出牛α-乳清蛋白PCR引物的位置及其产物。图3，如实施例2所述，表明人α-乳清蛋白基因的两个重叠的基因组λ克隆的限制性图谱(pHA-2和pHA-1)。图4，如实施例3所述，表明牛β-乳球蛋白基因的三个重叠的基因组λ克隆的限制性图谱。图5，如实施例4所述，示出对转入牛α-乳清蛋白基因的转基因小鼠的脱脂乳和非转基因小鼠乳比较分析而作的SDS-PAGE。图6，如实施例5所述，示出人α-乳清蛋白转基因构建物。图7，如实施例5所述，示出对转入人α-乳清蛋白基因的转基因小鼠的脱脂乳和非转基因小鼠乳比较分析而作的SDS-PAGE。图8，如实施例5所述，示出人α-乳清蛋白转基因小鼠乳的Western分析，以人α-乳清蛋白标准作对照。图9，如实施例6所述，示出转基因构建物PKU1至PKU4的PCR克隆策略。图10，如实施例6所述，示出PKU引物1至10的序列。图11示出无效的和人源化的α-乳清蛋白等位基因的结构。图12为α-乳清蛋白缺陷的哺乳期乳腺的总RNA的Northern分析。图13，示出靶鼠的α-乳清蛋白的Western分析。图14为野生型α-lac-哺乳期乳腺的组织学分析。图15A示出RNase保护分析，用以区分人的替换型α-乳清蛋白mRNA与小鼠的α-乳清蛋白的mRNA。图15B示出小鼠和人的替换型α-乳清蛋白mRNA的RNase保护分析。图16示出用疏水作用层析定量分析α-乳清蛋白。SEQIDNOS16-20给出从BamHI位点到载体限制位点(包括EcoRI位点)的部分序列，其位于内源性人α-乳清蛋白基因的蛋白编码区域的3’一侧，如下所示SEQIDNO16核苷酸1至264(包括两端点)SEQIDNO17核苷酸1331至2131(包括两端点)SEQIDNO18核苷酸2259至2496(包括两端点)SEQIDNO19核苷酸2519至2680(包括两端点)SEQIDNO20核苷酸3481至3952(包括两端点)SEQIDNO.21给出了从EcoRI位点到XhoI位点的序列，位于内源性人α-乳清蛋白基因的蛋白编码区域5’一侧。具体地，图11上部分表明了野生型鼠α-乳清蛋白的位点，转录区的位置与方向由箭头所示。翻译终止位点和RNA多聚腺苷酸位点也已标明，中间部分示出了无效的等位基因的结构。带条纹区表明了HPRT可选择盒(Cassette)。下部分表明人的替换等位基因的结构。方格区表明人α-乳清蛋白片段。转录起始，翻译终止和多聚腺苷酸位点均已标明。所示限制性酶切位点为HindIII(H)；BamHI(B)；XbaI(X)。图12中所示两个放射自显影图为使用人α-乳清蛋白探针，随之使用大鼠β-酪蛋白探针对同一滤膜作重复杂交的结果。所用探针在每一放射自显影图下标明。各条道中RNA的来源在其上标记处说明。图13中A道含纯化的人α-乳清蛋白。B至F道为来自靶小鼠的乳样品，基因型在其上方标明。G和H道为C和D道的短时间曝光物。图14中所示光镜照片为乳房组织的苏木精/曙红染色切片(原始放大倍数100X)。各乳腺基因型已表明。图15A中，小鼠与人DNA在α-lach等位基因的3’连结位于翻译终止位点和多聚腺苷酸信号间。人α-乳清蛋白mRNA3’未翻译末端含120bp的小鼠序列。小鼠和人的替换的α-乳清蛋白mRNA用小鼠RNA探针通过杂交检测，并由核糖核酸酶消化保护所产生的RNA片段大小区别。人的序列由方格表明，小鼠序列由阴影区表明。所示限制酶切位点为HindIII(H)；BaI(B)；XbaI(X)。图15B中所示放射自显影是5％的聚丙烯酰胺尿素薄层凝胶。RNA的来源在各道上方标明。A道示出与小鼠RNA探针杂交的野生型RNA，该探针未被核糖核酸酶消化。D道至J道示出来自α-lacm/α-lach杂合子的RNA样品；数字表明具体的小鼠，是图15中所给定量估计的来源。保护片段的预测大小也被标明。图16上部分给出三种乳样的Phenyl-Sepharose洗脱曲线。1，α-lach/α-lach同合子(小鼠#22)；2，α-lacm/α-lach杂合子(小鼠#76)；3，α-lacm/α-lacm野生型。下部分示出用已知的人α-乳清蛋白量对积分峰区所作的标准曲线。本发明参照如下非限制性实施例作进一步描述。实施例1牛α-乳清蛋白基因的克隆已知有三种不同的牛α-乳清蛋白，其中B型最普遍。来自Bos(Bos)nomadicusf.d.indicus的A型不同于B型，表现在10号位残基A为Glu，而B中则为Arg取代。来自Bos(Bibos)javanicus的C型其序列差异尚不清楚(McKenzie&White，AdvancesinProteinChemistry41，173-315(1991)。牛α-乳清蛋白基因(编码B型)可用图1中标明的PCR引物从基因组DNA克隆。引物已给出如下序列号Ba-2SEQIDNO1Ba-7SEQIDNO2Ba-8SEQIDNO3Ba-9SEQIDNO4所有PCR反应中的DNA来源是来自Holstein-Friesian牛的血。使用引物Ba-9结合引物Ba-8扩增的启动子区长度为0.72kb。这-BamHI/EcoRI片段克隆到Bluescript(pBA-P0.7)。使用引物Ba-7结合引物Ba-8扩增的启动子区长度为2.05kb。这-BamHI/EcoRI片段克隆到Bluescript(pBA-P2)。整个牛α-乳清蛋白基因，包括5’0.72kb和3’0.3kb的旁侧序列区，可用引物Ba-9结合引物Ba-2加以扩增。这些引物包括BamHI限制酶识别位点，可将扩增的3kb片段直接亚克隆到pUCI8的BamHI位点，产生pBova-A构建物(见图2)。将来自克隆pBA-P2的BamHI/EcoRV片段连到pBOVA-a的EcoRV/BamHI片段，产生构建物pBOVA-b(见图2)。因为TAQ多聚酶缺乏校正活性，因此检验扩增的牛α-乳清蛋白DNA与发表的牛α-乳清蛋白基因是否一致是必要的。序列分析在所有外显子及两个引物片段中进行。比较牛α-乳清蛋白外显子与Vilotte发表的结果，表明了3个改变(i)外显子I在+759位由C变为A；成为5’非编码区(ii)外显子I在+792位由CTA变为CTG；均编码亮氨酸(iii)外显子II在+1231位由GCG变为ACG；丙氨酸变为亮氨酸这表明蛋白B型更为常见。尽管不能排除PCR扩增中序列错读，但以上错配可能系由于牛DNA来源不同。实施例2人α-乳清蛋白基因的克隆人α-乳清蛋白的DNA序列已发表(Halletal.，Biochem.J.，242735-742，(1987))。使用人的序列设计PCR引物以克隆两个来自人基因组DNA的小片段，其中一个位于基因的5’端，另一个在3’端。它们被亚克隆到pUC18载体，作为探针检测商购(Stratageme)λ基因组文库。两个含有α-乳清蛋白基因的重组细菌噬菌体，即4a和5b.1，已用现成方法分离(Sambooketal，分子克隆实验手册，第2版，ColdSpringHarborLaboratory(1989))。限制酶切图谱证明两个克隆均含人α-lac基因的完整的编码序列，但存在的5’及3’端序列长短不一(图3)。克隆5b.1外显子序列分析及克隆4a外显子和5’旁侧区域序列分析结果表明它们与发表序列一致。3’序列的一些部分示于SEQIDNOS.16至20。5’序列示于SEQIDNO.21。实施例3克隆牛β-乳球蛋自基因(bBLG)牛BLG(bBLG)的DNA序列已发表(Jamiesonetal；Gene，61；85-90，(1987)；Wagner，unpublished，EMBLDataLibraryBTBLACEX(1991))。使用牛序列设计PCR引物以克隆牛BLG基因从5’端开始的片段。该片段亚克隆到pUC18载体，作为探针使用，检查商购的牛(Stratagene)λ基因组文库。分离了3个基因组λ克隆作了限制酶切分析定性(见图4)。其中两个克隆(BB13，BB17)含有完整的bBLG编码区，外加不同长短的旁侧区域，而克隆BB25缺少编码区域，完全由5’旁侧区域组成，序列分析表明这个克隆的终点位于ATG翻译起始点的上游12bp。包含整个BB13和BB17的Sal片段亚克隆到pUC18，来自克隆BB25的EcoRI片段克隆到pBluescript(图4)。实施例4牛α-乳清蛋白构建物的组装与表达转基因构建物(图2)pBova-A由牛α-乳清蛋白编码区，0.72kb的5’旁侧及0.3kb的3’旁侧区域组成，作为3Kb的BamHI片段克隆到Bluescript载体。pBova-B含3个片段1、来自克隆pBA-P2的1.47kb大小的BamHI-EcoRV片段。2、来自克隆pBova-A的2.78kb大小的EcoRV-BamHI片段。3、BamHI消化的克隆载体Bluescript。牛α-乳清蛋白在转基因小鼠中的表达将两个构建物pBova-A和pBova-B(图2)注入小鼠胚胎，产生转基因动物。通过SDS-PAGE电泳结合考马斯蓝染色分析乳并与α-乳清蛋白标准量比较，表明了α-乳清蛋白表达水平的变动情况，其中PBova-A检测不到，PBova-B表达水平高至0.5-1mg/ml(见图5和表1)。表1转基因小鼠中牛α-乳清蛋白的表达小鼠考马斯蓝染色244.12BOVA-a-244.14BOVA-a-244.15BOVA-a-245.23BOVA-b-245.8BOVA-b-245.4BOVA-b-245.7BOVA-b+245.21BOVA-b-245.13BOVA-b+249.13BOVA-b-246.15BOVA-b-249.18BOVA-b++249.23.1BOVA-b++249.23.5BOVA-b++249.25.3BOVA-b-249.25.7BOVA-b-249.30.3BOVA-b--＝＜0.5mg/ml249.30.4BOVA-b-+＝＝0.5-1mg/ml249.33.2BOVA-b+/++++＝＝1-2mg/ml249.33.3BOVA-b+/++表1表明转基因小鼠乳中牛α-乳清蛋白的相对水平，通过比较经考马斯蓝染色的胶上蛋白标准而估算得到。实施例5人α-乳清蛋白基因构建物的装配与表达α-乳清蛋白是人主要乳清蛋白，而绵羊与牛的主要乳清蛋白为β-乳球蛋白。α-乳清蛋白的表达水平种与种不同，人乳含大约2.5mg/ml，牛乳含0.5-1.0mg/ml，小鼠乳含0.1-0.8mg/ml。为了弄清使α-乳清蛋白基因高水平表达的序列，设计了不同的构建物。它们含有a)不同长度的来自人α-乳清蛋白基因座的5’和3’旁侧区域。b)来自牛α-乳清蛋白位点的5’旁侧区域，或c)来自牛或鸟β-乳球蛋白基因的5’旁侧区域。鸟β-乳球蛋白基因启动子已被成功地用于在小鼠乳中高效表达(＞10mg/ml)异源基因。转基因构建物(图6)pHA-1由人α-乳清蛋白编码区域和来自λ克隆5b.1的约1.8kb的5’旁侧及3kb的3’旁侧区域组成，其作为7kb的EcoRI/SalI片段克隆到pUC18。pHA-2由人α-乳清蛋白编码区域和来自λ克隆4a的约3.7kb的5’旁侧和13kb的3’旁侧区域组成，其作为约19kb的SalI片段克隆到pUC18。pOBHA(鸟β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于4个DNA片段1、一个4.2kb的SalI/ECoRV片段，包含鸟β-乳球蛋白启动子(见WO-A-90/05188)；2、一个74bp的合成寡核苷酸，对应于一个8bp的BClI接头和人α-乳清蛋白序列的15-77位碱基，作为一个平末端/BglI片段使用；3、一个6.2kb的BglI/PstI人α-乳清蛋白片段，它源自λ克隆4a，包括位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的区域。4、用PstI和SalI酶切的pSL1180(Phamacia)。pBBHA(牛β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于以下4个DNA片段1、一个3.0kb的ECoRI片段，含来自克隆BB25-3的牛β-乳球蛋白启动子，作为EcoRI/EcoRV片段使用；2、一个74bp的合成寡核苷酸，对应于一个8bp的BClI接头和人α-乳清蛋白序列15-77位碱基，作为平末端/BglI片段使用；3、一个6.2kb的BglI/PstI人α-乳清蛋白片段，来自克隆4a，包括位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的区域；4、用EcoRI和PstI酶切的Bluescript载体。pBAHA(牛β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于以下4个DNA片段1、一个0.72kb的BamHI-StuI片段，含来自克隆pBA-P0.7的牛α-乳清蛋白启动子；2、一个62bp的合成寡核苷酸，对应于人α-乳清蛋白序列15-77位碱基，作为平末端/BglI片段使用；3、一个6.2kb的人α-乳清蛋白基因BglI/PstI片段，来自λ克隆4a，含位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的序列；4、用BamHI和PstI酶切的Bluescript载体。人α-乳清蛋白在转基因小鼠中的表达将5种构建物注入小鼠胚胎，产生转基因动物。所有构建物在小鼠乳中均表达人α-乳清蛋白。含人α-乳清蛋白基因和不同长短的旁侧区域的pHA-1和pHA-2在大多数动物中表达水平介于1至18mg/ml(213.5pHA-2)。含由鸟或牛BLG启动子启动的人α-乳清蛋白基因的pOBHA和pBBHA有稍低的表达水平。含由0.72kb牛α-乳清蛋白启动子驱动的人α-乳清蛋白基因的pBAHA有与pHA-1或pHA-2相似的表达水平，但表达可检水平蛋白的转基因动物的百分数较低。这个发现令人惊讶的，因为同样的牛启动子序列驱动牛α-乳清蛋白基因，结果表现极差(见实施例4和Vilotteetal；FEBS，Vol.197，1.2.13-18(1992))。表2总结出转基因蛋白相对量。来自这些动物的脱脂乳用SDS-PAGE结合考马斯蓝染色、等电点聚焦、Western印迹(使用商购的抗人α-乳清蛋白抗体(Sigma)进行)和色谱聚焦技术分析。这些分析的结果表明，与人α-乳清蛋白标准(Sigma)比较，转基因蛋白的分子量、等电点和抗原性正确。表2转基因小鼠中人α-乳清蛋白表达小鼠考马斯蓝染色Western印边205.19pHA1--204.10pHA1++++204.7pHA1++++++230.15.3pHA1+++n.d.230.15.5pHA1+++n.d.230.15.6pHA1+++n.d.230.21.5pHA1+++n.d.230.21.1pHA1++n.d.211.18pHA2+++211.17pHA2--211.16pHA2++++++212.11pHA2+n.d.213.5pHA2++++++++212.13pHA2++n.d.212.19pHA2-n.d.213.4pHA2+++n.d.212.7pHA2-n.d.232.10BBHA--233.1BBHA--231.4BBHA++++232.9BBHA++231.9BBHA-n.d.232.5BBHA++231.3BBHA++232.6BBHA-n.d.237.6BBHA-n.d.235.15OBHA-n.d.235.19OBHA++++236.6OBHA++++234.1OBHA++234.4OBHA++++234.14OBHA++239.14BAHA++++++239.4BAHA-n.d.240.7BAHA-n.d.239.3BAHA-n.d.239.6BAHA++++239.12BAHA-n.d.243.1BAHA++n.d.242.9BAHA+++n.d.241.16BAHA+n.d.234.14BAHA-n.d.243.13BAHA+n.d.243.10BAHA-n.d.243.4BAHA-n.d.表2表明人α-乳清蛋白在转基因小鼠乳中的相对水平，其通过与标准蛋白在考马斯蓝染色的凝胶和Western印迹反应相比较而得到。-表示＜0.5mg/ml+表示＝0.5-1mg/ml++表示＝1-2mg/ml+++表示＝2-3mg/ml++++表示＞5mg/mln.d.表示未能断定来自几个小鼠的结果表示于图7和图8中。图7示出转基因小鼠脱脂乳的SDS-PAGE分析，以非转基因小鼠乳为对照；图8表明转基因乳的人α-乳清蛋白的Western印迹，以人的α-乳清蛋白标准作对照。实施例6在体内人α-乳清蛋白启动子控制下，诱变的牛α-乳清蛋白的表达人α-乳清蛋白转基因的表达与天然的牛α-乳清蛋白转基因相比是相对较高的，反应出内源牛和人基因表达水平的不同。因为这种不同可能由5’端控制区域的不同引起，因此，将牛α-乳清蛋白转录起始点的5’区域用人α-乳清蛋白基因的相应序列即代。构建了PKU-5和PKU-1H两种构建物，它们包含了显示于表3中的氨基酸取代。下列SEQIDNOS给于所用的PCR引物PKU-1SEQIDNO.5PKU-2SEQIDNO.6PKU-2LSEQIDNO.7PKU-3SEQIDNO.8PKU-4SEQIDNO.9PKU-5SEQIDNO.10PKU-6SEQIDNO.11PKU-7SEQIDNO.12PKU-8SEQIDNO.13PKU-9SEQIDNO.14PKU-10SEQIDNO.15PKU-5在克隆的第一步有三个片段亚克隆到pUC18的EcoRI/BamHI位点(1)来自使用PKU-引物7结合引物8的PCR扩增的EcoRI至PvuI片段(见图10)；(2)来自使用PKU-引物9结合引物10的PCR扩增的PvuI至BsaBI片段(见图10)；和(3)来自pBA的BsaBI至HindIII片段。最终的构建物包括6个DNA片段(1)3.7kb的SalI至KpnI片段，含来自λ克隆4a的人α-乳清蛋白启动子(图3)；(2)152bp的合成寡核苷酸，含有KpnI位点到AUG的人α-乳清蛋白基因序列和从AUG到HapI位点的牛α-乳清蛋白基因序列；(3)来自第一步亚克隆的1.25kb大小的HpaI至HindIII片段；(4)来自pBA的0.95kb的HindIII至BglII片段。(5)来自λ克隆4a(图3)的人α-乳清蛋白基因3’侧的3.7kb大小的BamHI至XhoI片段，作为BamHI片段使用；(6)用SalI和BamHI酶切处理过的BluescriptKS-载体。PKU-1H以与PKU-5同样的方式构建，只是片段(3)来自PKU-1。PKU-1由6个DNA片段构建(见图9)(1)一个2.04kb大小的来自pBOVA-6的SstI至HpaI片段；(2)一个0.46kb大小的来自PCR产物A的HpaI至PvuI片段(PKU-引物对1和2；见图10)；(3)一个0.60kb大小的来自PCR产物B的PvuI至BsaBI片段(引物对3和4；见图10)；(4)一个0.22kb大小的来自pBOVA-6的BsaBI至HindIII片段；(5)一个0.95kb大小的来自pBOVA-6的HindIII至BglII片段。(6)用SstI和BglIII消化的载体pSL1180。表3存在于转基因构建物中的氨基酸取代取代人启动子质粒人3′旁侧位置9305380Tyr，Tyr，Tyr，Tyr+pPKU-1HSer，Tyr，Leu，Leu+pPKU-5转基因小鼠中的表达情况构建物PKU-1H和PKU-5已注入小鼠胚胎中。目前转基因动物均来自PKU-5构建物。喂养这些动物以便分析其乳。实施例7破坏α-乳清蛋白缺陷和将人α-乳清蛋白基因替换物插入到小鼠中对哺乳的影响材料与方法小鼠品系携带α-乳清蛋白无效等位基因和人源化α-乳清蛋白替换等位基因的小鼠，是通过分别饲养来自靶胚干细胞克隆M2和F6与Balb/c交配所得嵌合体而得到，如前所述(Fitzgeraldetal.J.Biol.Chem2452103-2108)。饲养这些品系过程中，α-乳清蛋白的基因型通过对尾部活组织中制备的基因组DNA作Southern分析而决定。RNA分析总RNA用Auffray和Rougeon的方法从产后506天的雌性小鼠腹部乳腺制得(Eur.J.Biochem107303-14)。Northern检测依标准程序进行(Sambooketal，MolecularCloning)。用于杂交的探针为一个3.5kb大小的含完整的小鼠α-乳清蛋白基因的BamHI片段，和一个1.1kb大小的大鼠β-酪蛋白cDNA(BlackburnetalNucl.AcidsRes102295-2307)。RNAse保护分析32P-CTP标记的反义RNA用T7RNA聚合酶(Promega)从一个克隆于BluescriptKS的455bp的HindIII-BalI小鼠α-乳清蛋白基因片段转录得到(图15A)，转录反应、溶液杂交和RNAse消化的条件均按Promega推荐进行。被保护的片段用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影观察。乳组分及产量分析乳样在哺乳期3-7天于Hypnorm(Roche)/Hypnovel(Janssen)麻醉状态下收集。通过腹膜注入150mU的催产素(Intervet)并轻轻按摩挤发。乳脂肪含量用Fleet和Linzell方法计算(J.Physiol17515)。去脂肪的乳用于分析蛋白(BradfordAnalyt.Biochem72248-54)，乳糖用酶法检测，将乳样依次与β-半乳糖苷酶(Boehringer)，葡萄糖氧化酶和过氧化酶(Sigma)保温，该法来自Bergmeyer和Bernt(MethodsinEnzymeAnalysis31205-1212)。产乳量是用滴定水技术计算，如Knight等所述(Comp.Biochem.Physiol84A127-133)，测定一般选在哺乳期3至6天小鼠哺乳完毕48小时后。乳中α-乳清蛋白的分析和定量乳样在16％的SDS-PAGE凝胶(Novex)上分析，并转移到ImmobilonP膜作Wester印迹反应。先用兔抗人α-乳清蛋白的抗血清(Dako)吸附，继而用羊抗兔的IgG过氧化酶抗体偶联物吸附，并用增强的化学发光系统观察(Amersham)从而检测α-乳清蛋白。乳样中α-乳清蛋白用Lindahl等的方法的改进方法定量(AnalytBiochem140394-402)，该法用依赖钙的苯基-琼脂糖层析纯化α-乳清蛋白。乳样用27％(W/V)的硫酸铵按1∶10稀释，在室温保温10分钟，然后离心。上清与等体积100mMTris/Cl，pH7.5，70mMEDTA混合，装于已用50mMTris/Cl，pH7.5，1mMEDTA预平衡的苯基-琼脂糖(Pharmacia)柱上(200μl填充体积)。用同样缓冲液洗柱子，α-乳清蛋白用50mMTris/Cl，pH7.5，1mMCaCl2洗脱出。检测柱子在280nm的光吸收，并对α-乳清蛋白部分的峰面积求积分。使用已知量的纯化的人α-乳清蛋白从零至2.46mg/ml建立了标准曲线(图16)。组织学分析将幼仔从产后第六天正处于哺乳期的母鼠处移走，两小时后处死母鼠，分解胸部乳腺，贮存于中性缓冲的福尔马林中，用石蜡包埋并用标准方法用苏木精/曙红染色。结果小鼠α-乳清蛋白基因缺失如Stacey等(1994年，上述文献)所述，建立了一株小鼠品系，其包含完整小鼠α-乳清蛋白编码区的2.7kb片段及0.57kb的启动子已缺失，并用2.7kb的含次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)选择标记基因替换(见图11)。携带此等位基因的动物命名为α-lac-。野生型小鼠α-乳清蛋白等位基因命名为α-lacm。对取自哺乳期第5天的乳腺RNA所作的Northern分析表明，α-乳清蛋白mRNA在α-lac-/α-lac-同合子中不存在(见图12)，证明α-乳清蛋白基因已被除去，无别的α-乳清蛋白mRNA源存在。在所有样品中同样RNA与样品β-酪蛋白RNA杂交(见图12)。α-乳清蛋白缺陷除对哺乳期外对小鼠其它时期没有明显的影响。两种性别的α-lac-/α-lac-同合子和α-lacm/α-lac-杂合子外表，行为和繁殖均正常。然而，α-lac-/α-lac-同合子雌鼠不能成功地哺育幼仔，其幼仔在出生后5-10天内死去。同合子雌鼠α-lac-/α-lac-的后代转移给野生型母鼠喂养能正常存活。相反，野生型母鼠的后代转移给同合子α-lac-/α-lac-母鼠喂养，不能生存。表4说明α-lac-/α-lac-母鼠喂养的幼仔大约是α-lacm/α-lacm野生型鼠喂养幼仔重量的一半。产乳量的计算结果与此一致。α-lacm/α-lac-杂合子产乳量与野生型相近，但α-lac-/α-lac-同合子的产乳量急剧下降(表4)。表4靶小鼠品系中，乳成分，幼仔重量，乳房组织重量和产乳量</tables>不成对t-测试统计分析，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；数据是平均值±SE括号中数字表明分析的母鼠个数n.t.，未检测乳通过人工挤乳由各基因型取得，并对其中关键成分作了分析。取自α-lacm/α-lac-杂合子的乳与野生型乳外观没有不同，脂肪、蛋白含量与野生型的也相似(表4)。尽管乳糖含量在α-lacm/α-lac-杂合子中略微减少，统计分析表明区别并不明显。相反，取自α-lac-/α-lac-同合子的乳粘稠，难以从乳头挤出并在组成上与野生型明显不同，脂肪含量比野生型高约60％，蛋白含量高约88％，而乳糖明显缺乏。在α-lac-/α-lac-母鼠中检测到的0.7mM乳糖表观浓度代表乳中葡萄糖含量，因为所用的乳糖分析法涉及乳糖至葡萄糖的酶法转化。野生型乳的葡萄糖的直接分析表明其浓度为1.8mM。来自α-lac-/α-lac-同合子的乳中，乳蛋白的Western分析未检查到α-乳清蛋白(见图13，F道)。苯基-琼脂糖层析进一步证明了这一点。该技术可特异鉴别α-乳清蛋白，适于对乳α-乳清蛋白含量定量计算(表5；也见图16)。当用于取自α-lac-/α-lac-同合子的乳时，未检测到α-乳清蛋白。而α-lacm/α-lac-杂合子的乳中α-乳清蛋白浓度为0.043mg/ml，约是野生型的一半(表5)。表5乳α-乳清蛋白含量来源α-乳清蛋白(mg/ml)人2.9±0.1(2)α-lacm/α-lacm小鼠0.09±0.005(2)α-lac-/α-lac-小鼠0(3)α-lacm/α-lac-小鼠0.043±0.004(5)α-lacm/α-lach小鼠0.65±0.07(4)α-lach/α-lach小鼠1.38±0.12(5)乳样品中α-乳清蛋白含量由苯基-琼脂糖层析估算数值是平均值±SE括号中数字表明分析的母鼠数目。α-乳清蛋白缺陷对乳腺发育无明显影响。表4说明野生型、杂合子α-lacm/α-lac-和同合子α-lac-/α-lac-泌乳期小鼠的乳腺总重无明显不同。乳腺的光镜分析(图14)表明杂合子与同合子的乳腺在组织学上正常。但同合子乳腺的小泡与乳腺管扩张，充满脂滴等物质。人α-乳清蛋白基因替换小鼠α-乳清蛋白基因我们已得到在小鼠α-乳清蛋白基因位点携带人α-乳清蛋白基因的小鼠。在α-lac-无效等位基因缺失的2.7kb小鼠α-乳清蛋白基因片段被2.97kb的含完整人α-乳清蛋白编码区和5’侧序列的片段所取代。这种人的基因片段从人转录起始位点上游0.77kb处延伸到翻译终止位点3’端136bp处的EcoRI位点，与小鼠序列的连结发生在小鼠转录起始位点上游0.57kb处的BamHI位点和小鼠翻译终止位点3’端147kbp处的XbaI位点(见Staceyetal，1994，上述文献，也见图11)，我们描述了对携带此等位基因即α-lach的小鼠的分析。小鼠α-乳清蛋白基因缺失表明，α-乳清蛋白缺陷阻碍乳糖合成，严重破坏乳产量。我们使用α-lach等位基因检测人α-乳清蛋白在小鼠α-乳清蛋白缺乏时恢复产乳的能力。α-lacm/α-lach杂合子和α-lach/α-lach同合子小鼠外表、繁殖力、行为均正常。相比α-lac-/α-lac-小鼠，α-lach/α-lach同合子母鼠产乳表观正常，能成功养育后代。表4表明由α-lacm/α-lach杂合子和α-lach/α-lach同合子母鼠养育的幼仔与野生型母鼠所育幼仔重量相似。我们观察到这些动物能完全正常地连续哺育幼子，由此得到证明。这些证据清楚表明，人的基因能有功能地替换小鼠的基因。乳组分分析(表4)表明乳糖浓度在所有基因型中均相似。尽管α-lach/α-lach同合子动物中蛋白和脂肪浓度有所降低，但仅脂肪减少被统计学的不成对t-测试证明为显著。相比野生型，这些动物产乳量上升(表4)。人和小鼠α-乳清蛋白RNA的相对定量人乳比小鼠乳(0.1mg/ml)含相对多的α-乳清蛋白(2.5mg/ml)。我们希望确定人的α-乳清蛋白基因片段在小鼠位点是否保持高水平的表达，或是比小鼠基因表达还低。α-lacm/α-lach杂合子小鼠为说明这个问题提供了理想途径，其中在同一动物中人基因的表达可与小鼠基因表达直接比较。图15A说明了比较小鼠和人α-乳清蛋白mRNA水平的方法。因为人与小鼠α-乳清蛋白基因序列的连结位于多聚腺苷酸位点的上游，所以α-lacmRNA含有位于3′端的120个碱基的不翻译的小鼠序列。统一放射标记的小鼠RNA探针用于核糖核酸酶保护分析，以检测区分同一RNA样品中人和小鼠α-乳清蛋白mRNA。每种mRNA相对丰度由已受到人和小鼠mRNA保护的片段的标记量计算得出。核糖核酸酶保护分析结果见图15B。A道示出未消化的455碱基探针，K道表明酵母tRNA不保护任何片段。野生型小鼠RNA保护了一条305碱基的RNA片段，该片段与内源小鼠α-乳清蛋白RNA一致(见B道)。同源α-lach/α-lach腺体RNA保护一条较小的条带，与人α-乳清蛋白mRNA所保护的120碱基的RNA一致(见C道)。D-J道表明与系列杂合子α-lacm/α-lach动物相一致的结果。每种样品中小的与大的被保护片段表明人和小鼠α-乳清蛋白mRNA均存在。被保护的片段从胶上切下，测定放射同位素含量并依大小不同调整，并估算了人与小鼠α-乳清蛋白mRNA的比率。表6示出存在于从图15B中D至J道切下的305碱基和120碱基片段的放射同位素量，从及杂合子α-lacm/α-lach中人与小鼠α-乳清蛋白mRNA的比例。尽管不同个体鼠间有所波动但人α-乳清蛋白mRNA比小鼠mRNA含量明显丰富。平均7个α-lacm/α-lach杂合子，人α-乳清蛋白mRNA比小鼠表达高15倍。表6α-lacm/α-lach乳腺中人和小鼠α-乳清蛋白mRNA相对量泳道鼠号120碱基305碱基人/小鼠片段a片段aRNA比率bD25957100015∶1E3577054726∶1F4482581015∶1G766018107714∶1H98520614529∶1I995481111712∶1J7926858356119∶1各泳道命名表明被保护片段的来源并与图15B相对应a.数字单位为每分钟计数(c.p.m)b.120碱基片段的c.p.m乘以2.54(以调整大小不同)与305碱基片段的c.p.m的比率人α-乳清蛋白表达对靶小鼠品系中α-乳清蛋白作了Western分析。人α-乳清蛋白因其快速的泳动率而可与小鼠α-乳清蛋白区分开(见A、B道)。α-lach/α-lach同合子与α-lacm/α-lach杂合子小鼠中一条明显的低分子量条带可被观察到(见C、D、G、H道)，它相应于人α-乳清蛋白标准的位置，并仅能在表达人α-乳清蛋白的小鼠中观察到。该小鼠通过基因寻靶或原核微注射得到(数据未示出)。这一点被苯基-琼脂糖层析(见图16)及溴化氰分解释放的肽分析(数据未示出)所证实。有较低泳动率的带，与小鼠α-乳清蛋白相似，也是人α-乳清蛋白基因产物，其性质未知，它随α-lach基因剂量不同而强度有所变化(见G、H道)，也存在于通过原核微注射产生的人α-乳清蛋白转基因小鼠乳中。乳样品的α-乳清蛋白含量用苯基-琼脂糖层析作定量。图16说明图13中所显示的三种乳样，包括α-lacm/α-lach杂合子和α-lach/α-lach同合子的柱洗脱的重叠吸光值曲线。相应于洗脱的α-乳清蛋白的峰已标记出。α-乳清蛋白含量通过比较积分的峰面积与人α-乳清蛋白标准曲线估算得到。积分的峰面积与α-乳清蛋白量之间呈线性关系，可高度重复。图16中的样品中α-乳清蛋白含量估算如下α-lacm/α-lacm野生型，0.1mg/ml；α-lacm/α-lach杂合子#76，0.45mg/ml；α-lach/α-lach同合子#22，0.9mg/ml。表5示出来自目标靶小鼠品系和哺乳期妇女的乳样品中α-乳清蛋白浓度。十分明显，乳中α-乳清蛋白浓度与基因剂量直接相关，如α-lacm/α-lach杂合子仅为野生型α-乳清蛋白浓度的一半。因为这些小鼠的产乳量相类似(表4)，所以α-乳清蛋白的浓度提供了一个表明其合成数量的合理指标。杂合子α-lacm/α-lach乳中人与小鼠α-乳清蛋白成分的相对比例通过假定从单一的小鼠等位基因表达的α-乳清蛋白量是0.043mg/ml，而其余代表人α-乳清蛋白。这一点与由α-Lacm/α-Lac-杂合子和野生型小鼠表达的α-乳清蛋白量相一致。因此，α-lacm/α-lac-杂合子估计表达0.61mg/ml人α-乳清蛋白和0.043mg/ml小鼠α-乳清蛋白。因此，α-lacm/α-lach杂合子乳中人α-乳清蛋白约是小鼠α-乳清蛋白的14倍。这与相对mRNA比率一致。实施例8异源基因的增强表达这些数据证明，包含在pHA-2构建物中的上游启动子区(AUG到-3.7kb)增强了异源基因的表达。表7示出对来自pHA-2转基因建立者母鼠的乳分析结果。10个母鼠中的6个表达了高水平的人α-lac，3只母鼠未能表达可检测水平的人α-lac(在此分析中少于0.2mg/ml)，也不能传递转基因。我们不能肯定它们是低表达者或是不能转基因。表8构建物PKU-0至BALT-B均含牛α-lac启动子(约2kb)，构建物PKU-1H至PKU-16均含人α-lac启动子(3.7kb)。使用人α-lac启动子，增加转基因表达至几乎100％。数据表明使用人α-lac启动子，比用牛启动子表达效率高，而且能在更多的动物体内诱导表达。ND＝未测到TBA＝待分析TBO＝继续饲养C＝拷贝数TRANS.＝传递MIFREQ.＝整合频率表8</tables>n.t.＝未测试*估算序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称PPL治疗学(苏格兰)有限公司(B)街道罗斯岭(C)城市爱丁堡(E)国名英国(F)邮码EH259PP(ii)发明名称α-乳清蛋白基因构建物(iii)序列数目21(iv)计算机可读形式(A)媒介类型；软盘(B)计算机IBPPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.30(EPO)版本(2)序列SEQIDNo1的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo1GCGGATCCACAACTGAAGTGACTTAGC27(2)序列SEQIDNo2的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo2GATGGATCCTGGGTGGTCATTGAAAGGACTGATGC35(2)序列SEQIDNo3的信息(i)序列特征(A)长度43碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo3GCAGGCGAATTCCTCAAGATTCTGAAATGGGGTCACCACACTG43(2)序列SEQIDNo4的信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo4GAGGATCCAATGTGGTATCTGGCTATTTAGTGG33(2)序列SEQIDNo5的信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo5GCTGAATTCGTTAACAAAATGTGAGGTGTATCGGGAGCTGAAAGAC46(2)序列SEQIDNo6的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo6CCGGATCCGATCGCTTGTGTGTCATAACCACTGGTATGGTACGCGGTACAGACCCTG58(2)序列SEQIDNo7的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo7GCGGATCCGATCGCTTGTCTGTCATAACCACTGCTATGGAGCGCGGTACAGACCCCTG58(2)序列SEQIDNo8的信息(i)序列特征(A)长度69碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo8GCGGATCCGATCGTACAAAACAATGACAGCACAGAATATGGACTCTACCAGATAAATAAT60AAAATTTGG69(2)序列SEQIDNo9的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo9GCTCTAGATCATCATCCAGGTACTCTGGCAGGAG34(2)序列SEQIDNo10的信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo10GCTGAAGCTTCACTTACTTCACTC24(2)序列SEQIDNo11的信息(i)序列特征(A)长度65碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo11GCGGATCCAAAGACAGCAGGTGTTCACCGTCGACGACGCCTACGTAACTTCTCACAGAGC60CACTG65(2)序列SEQIDNo12的信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo12GCTGAATTCGTTAACAAAATGTGAGGTGAGCCGGGAGCTGAAAGAC46(2)序列SEQIDNo13的信息(i)序列特征(A)长度54碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo13GCGGATCCGATCGCTTGTGTGTCATAACCACTGGTATGATACGCGGTACAGACC54(2)序列SEQIDNo14的信息(i)序列特征(A)长度69碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo14GCGGATCCGATCGTACAAAACAATGACAGCACAGAATATGGACTCCTCCAGATAAATAAT60AAAATTTGG69(2)序列SEQIDNo15的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型；核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo15GCTCTAGATCATCATCCAGCAGCTCTGGCAGGAG34(2)序列SEQIDNo16的信息(i)序列特征(A)长度264碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo16GGATCCAAAGTTGGCTAAACACTGGCCGGGTGCAGTGCTTCCACCTGTAATTCCAGCACT60TTGGAAGGCTGAGGTGGGCAGATTGCTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCTTGGCTAAC120AGCAAAACCCTGTCTCTACCAAAAGTACAAAAATTATCTGGGTGTGGTGGCAGGCGCCTG180TAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGAAGAATTGTTTGAACCTGGGAGGCAGAGGT240TGTAGTGAGCTGAGATCGCTCATT264(2)序列SEQIDNo17的信息(i)序列特征(A)长度803碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo17TCTTTTTCAATTATTCATTTGTTACAGTGGGTTATGATACAAATGTTTATAGATGCCTAC60TCTGTACTAGTACTACAGAGCAGTTTTTCTGTGTTTATATTCAGTTCAATTGTAGTGTGT120TGAGTTGTATWWTAATCCATGTATTAAATCAAATAAACAAACAAAATGCCATGTTCTTTG180GTACAAGCAACACTCACCAAAGGCATTTGGGGTCTGCATTTGGAATTCTCAGGCAAACTC240TCTCTTGTTCCTAGTCTGTACTTATTTTCCCCACACTAGCTTATGTATATATATTTTTGA300GATTGGAGTTGCCCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATTCTTGGCTCACGAG360ACCTCCACGTCTTGGGTTAAAGCGTTTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGACTACTGGGATTAC420AGGCGCCTGCCACCATGCCCGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGCTTTCACCA480TGTTGCTCAGGCTGGTCTTGAAACTCCCCACCTCGGCCCTTCCCAAATGCGCTGGGATTA540CAGGTGTGAGCCACAGTGCCTGGCCTGTACATTTTTTAAATTTCAATGTCTAATATGGTG600TCCACTGAATTAAGAATTCTTTTGAGAAAATGAATCAATAAATCTATACACTGCCTCCTT660TATCCAGTGAGGTATGGCTGGATCAGCTTCATGACATACATGCCAGTAGTTCTCCTCCTC720CTCCTTTTTTACAAATAAAAATTGTATATGTTGAAGGTGTACAACTTGATGTTTGTTATA780TGTATACACTTAAATGTCACCAC903(i)序列特征(A)长度238碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo18TTTGGGTAGAAGCAGACAGTAAACTTGCTGTTCTCTTCCTGAGATCTTTTGTTGAGATGC60TGAATAGGAGGCAGCATGGCAGCTGAGCTATCTGTTCTGCTTTCTCTACCTCTGTCTCTT120TCCCTTAGGCCTAAAATGAAGCTCTAAGCCAAGCAAAGGTCTGAAGTCATCCAGACTAAT180TGGGAAGCGGGTAGGCTCCAGGGAGTGGCTCTCAGAGAGCAGACCATTTACTGAGCTC238(2)序列SEQIDNo19的信息(i)序列特征(A)长度162碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo19AATACAGAGTTTTGTTCTCTACTCTTATCCTGCTTTCTCCTCCCTGCTACTTTTCCCTGA60CACCTATCTTGTTGTGAAGACAGGAATTGCATTAGATAAAATCAAATCTTTTTTATTTTT120TTTTGAGATGGAATCTTGCTCTGTTTCCAGGCTGGAGTGCTG162(2)序列SEQIDNo20的信息(i)序列特征(A)长度472碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo20ATCTGGTCAGCAGTGAAGCTCAGTGTACACATTCATTCCTTCCTTCACTGCTTGATTTGT60CACCAAGTGGTTATTGAGGATATGCTGTTTGCTAGGTACTACTTTACTTATTTATTTGTT120TATTTAGAGATGGGGTCTCACAATGTTGCCCAGTCTACAGGACAGTGGCTATTCACAGGT180GTGAGCACAGCACACTACAGCCTCAAACTCCTGAGTTCAAGAGATCCTCCTGCCTCAGTC240TCTCGAGTAGCTGGGACTACAGGGATGTGCCACCACACATGGCTTAGGCTCTACTTTAGC300TGCTACTTGAAGGATGAAGATAGGAGGAGACACTCTTATTTTATTTGATTTCTTTTTTTT360TTTTTTTTTTTTGACAGAGTTTTGCTCTGTTGCCAGGCTGGAGTGCTCACTGCAACCTCC420ACCTCCAGGTCAAGCAATTCTCCTGCTCAGCCTCCGAGTAGTCGGACCAAGG472(2)序列SEQIDNo21的信息(i)序列特征(A)长度2119碱基对(B)类型；核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNo21GGAATTCCCATTCCTGTCGTGTACCCTTGCAGTGCCTCTGGGTGGAATGCGGAGAAATGG60AGTGGCTCCACTTCTGTTGTGTTTCTGAACATGTATCTCTTGCTATCAGAACTTTCTGCT120CATCCCTTCTGGCACACCAAGATCCTCCACATTCCCTTCACTCATGCCACTTCATATACT180GGTTATCCATGGTACAGAAGACAGGATTTAACTGAGAGGACTTTTCCCTGACTCTGAATA240CATGTAGGAGATAACGATATGGAAGACCTTCAGTATGTAAGTCTTAAATAGATTGGTTGG300GATAAATGTTCCCTGAAACATAAGAAACAGCGCAGCGGCTCCTGTCTGTAATCTAGCACT360TTGGGAGGGCCGAGGCCAGGCAGGCAAATTGCCTGAGCTCAGAAGTTTGAGACCAGCCTG420GCCAACATGCAGAAACTCCGTCTCTACTAAAAATACATAAATTAACCGGGCATGGTAACA480CGTGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAGCCTGGGAG540GCAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCGCCACTGCATTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAG600ACTTGGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAGAAGAAGAAGAAATCAGGTTTA660GAGATGAGGACAAAGAAGACGAATCGGTGGCATGAAGGAGCTAAGAGCTACTTGTCACCA720TGACATGAAGCTTCATGCCAGCAAATTAAAGGAGCTATTCAGAACTAGTATCCTCAACTC780TACTTGCTCAGGGGCACTGACCTTATAGAGATTCCAGACATAAGCTTGTTCAGCCTTAAG840TCCAATCTTTCCACTGGCTTGGTCCTTCCCACTTTCTGTGGCCAACTCTGAGGTTGTCTA900CAAGTTATTGGTCTTAGATTTATGTAATGTCTCAATGCCAGTGTAGTATTTGGTTATTTA960CGGTAGGAGTGGTTAGGGGTGGGGAATCTGATAATAGCTCGTAGGATAGCTAGATTCTTT1020TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGATAGGGTCTCACTTTGTCTCCCAGGATGGATGGATGGA1080GTGCAGTGGAGTGAACATGGCTCACTGCAGCCTCGACCTCCTGTGCTCAAGTGTTCCTCC1140TGCCTCAGCCCCTCAAGTAGCTGGGACTACAGGCACATGTCACCATGCCCAGCTAATTTT1200TTTTGTAGAGATGGGATTTTACCATGTTGCCCAGGCTGGTCTCGAGCTCCTGGGCTCAAG1260TGATCCACCAGACTCGGCCTCCCAAAATGCCGGGATTACAGGTGTGAGCCACTGTGCCTG1320GCCTAGATGCTTTCATACAGGCTTTTCAATTATGCATTTTCCTTAAGTAGGAAGTCTTAA1380GATCCAAGTTATATCGGATTGTTGTAGTCTACGTTCCCATATTCTATTCCTATTTCTGAG1440CCTTCAGTCATGAGCTACCATATTAAAGAACTAATTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGAT1500TGGTTGGACAAGTGCCAGCTCTGATCCTGGGACTGTGGCATGTGATGACATACACCCCCT1560CTCCACATTCTGCATGTCTCTAGGGGGGAAGGGGGAAGCTCGGTATAGAACCTTTATTGT1620ATTTTCTGATTGCCTCACTTCTTATATTCCCCCCATGCCCTTCTTTGTTCCTCAAGTAAC1680CAGAGACAGTGCTTCCCAGAACCAACCCTACAAGAAACAAAGGGCTAAACAAAGCCAAAT1740GGGAAGCAGGATCATGGTTTGAACTCTTTCTGGCCAGAGAACAATACCTGCTATGGACTA1800GATACTGGGAGAGGGAAAGGAAAAGTAGGGTGAATTATGGAAGGAAGCTGGCAGGCTCAG1860CGTTTCTGTCTTGGCATGACCAGTCTCTCTTCATTCTCTTCCTAGATGTAGGGCTTGGTA1920CCAGAGCCCCTGAGGCTTTCTGCATGAATATAAATAAATGAAACTGAGTGATGCTTCCAT1980TTCAGGTTCTTGGGGGTAGCCAAAATGAGGTTCTTTGTCCCTCTGTTCCTGGTGGGCATC2040CTGTTCCCTGCCATCCTGGCCAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTGTCCCAGCTGCTCAAA2100GACATAGATGGTTATGGAG2119</tables>PCT/RO/134表(1992年7月)权利要求1.一种重组基因构建物，该构建物适于在牛细胞中表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。2.权利要求1所述的构建物，适于表达人α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。3.权利要求1所述的构建物，适于表达牛α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。4.一种含有权利要求1所述的重组基因构建物的载体。5.一种含有权利要求4所述的载体的宿主细胞。6.一种将权利要求1所述的构建物整合到其基因组的转基因动物。7.权利要求6所述的转基因动物，所述动物能将构建物传给后代。8.权利要求6所述的转基因牛。9.一种生产具有增加的α-乳清蛋白含量的乳的方法，该方法包括从权利要求6所述的哺乳期雌性转基因动物中抽取乳。10.根据权利要求9生产的乳。11.从权利要求10的乳中提取的α-乳清蛋白。12.一种适于表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分的重组基因构建物，所述构建物有选自如下一组的旁侧序列a、SEQIDNOS.16至20中任何一个的3’旁侧序列；b、SEQIDNO.21的5’旁侧序列；c、这些序列的一部分。13.权利要求12所述的构建物，其3’旁侧序列选自由SEQIDNOS.16至20的任一个序列和其实质部分组成的一组的一个序列，其5′旁侧序列选自SEQIDNO.21或其实质部分。14.权利要求12所述的构建物，适于表达人α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。15.权利要求12所述的构建物，适于表达牛α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。16.一种含权利要求12所述的重组基因构建物的载体。17.一种含权利要求16所述的载体的宿主细胞。18.一种将权利要求12所述的构建物整合到其基因组的转基因动物。19.权利要求18所述的转基因动物，所述动物能将构建物传给后代。20.如权利要求18所述的转基因牛。21.一种生产具有增加的α-乳清蛋白含量的乳的方法，该方法包括从权利要求18所述的哺乳期雌性转基因动物中抽取乳。22.根据权利要求21生产的乳。23.根据权利要求21从乳中提取的α-乳清蛋白。24.一种选自由pBBHA，pOBHA，pBAHA，pBova-A，pBova-B，pHA1，pHA2和由其衍生的构建物组成的一组的重组基因构建物。25.一种将权利要求24所述的构建物整合到其基因组的转基因动物。26.权利要求25所述的转基因动物，所述动物能将构建物传给后代。27.权利要求25所述的转基因牛。28.一种生产具有增加的α-乳清蛋白含量的乳的方法，该方法包括从权利要求25所述的哺乳期雌性转基因动物抽取乳。29.根据权利要求28生产的乳。30.根据权利要求28从乳中抽取的α-乳清蛋白。31.具有选自如下一组的序列的多核苷酸a、SEQIDNO.16的序列；b、SEQIDNO.17的序列；和c、上述序列的部分。32.一种含权利要求31所述多核苷酸的重组基因构建物。33.含权利要求32所述构建物的转基因动物。34.权利要求33所述的转基因牛。全文摘要本发明提供了重组基因构建物用于在牛细胞中表达α-乳清蛋白，尤其是人α-乳清蛋白。为增强表达α-乳清蛋白，提供了新的基因构建物，载体，转化细胞以及遗传工程化的转基因动物。已证明人α-乳清蛋白对人婴幼儿营养有优越性，本发明能够廉价有效地在人乳中生产主要乳清蛋白。文档编号A01K67/027GK1157635SQ95194129公开日1997年8月20日申请日期1995年7月12日优先权日1994年7月13日发明者朱利安·库普尔,安琪莱克·施涅克申请人:Ppl治疗学(苏格兰)有限公司