体外蛋白质合成的改进方法

专利名称：体外蛋白质合成的改进方法
背景技术：
生物大分子的定向合成是生物化学的伟大成就之一。随着重组DNA(rDNA)技术的进展，使得利用细胞催化手段产生所需蛋白质成为可能。这可使用来自细胞的提取物在细胞环境内或体外实现。
无细胞蛋白质合成对于常规体内蛋白质表达方法具有几种优点。无细胞系统使得大多数(如果不是所有)细胞的代谢来源定向于唯一产生一种蛋白质。此外，由于可控制合成环境，体外缺乏细胞壁和膜成分是有利的。例如，可改变tRNA水平以反映表达所基因的密码子使用。由于我们不关心细胞生长或生存力，相比于体内，也可以更大的灵活性改变氧化还原电势、pH或离子强度。另外，易于定向回收纯化的、适当折叠的蛋白质产物。
也认识到体外翻译能掺入非天然和同位素标记的氨基酸以及产生体内不稳定、不溶解或细胞毒性的蛋白质。此外，无细胞蛋白质合成在改革蛋白质工程和蛋白质组筛选技术中有作用。无细胞方法避免了体内表达新基因产物的克隆和转化细胞所需的费力的方法，并且成为本领域的技术平台。
虽然无细胞蛋白质合成具有所有有希望的特性，它的实际应用和大规模实施受到几种障碍的限制。其中很重要的是反应时间短和蛋白质生率低从而使得蛋白质合成的产量差且试剂成本过大。此外，还需要昂贵的试剂并且常规方法在使用这些昂贵试剂时效率低下。
特别有用的反应结合了体外转录和翻译，从而直接联系了DNA编码序列和蛋白质产物。然而，需要其它试剂来产生mRNA增加了反应的总成本。近来的出版物讨论了许多不同的降低体外转录反应成本的策略，包括重复使用DNA模板和利用补料分批方案。例如，参见Kern和Davis(1997)“溶液平衡分析在体外RNA转录中的应用”(Application of Solution Equilibrium Analysis to in-Vitro RNATranscription)Biotechnology Progress 13747-756；Kern和Davis(1999)“补料分批系统在经体外转录生产RNA中的应用”(Application of a Fed-Batch System toProduce RNA by In-Vitro Transcription)B iotechnology Progress 15174-184。
需要改进来优化体外转录/翻译系统。持续除去抑制性副产物以及持续提供合成底物可使得连续或半连续反应系统支持长反应时间的合成。然而，这些方法也可导致底物使用效率低从而增加成本。解释抑制性产物以及防止其合成是开发体外合成系统最感兴趣的。降低试剂成本也重要。在当前技术下，主要的试剂成本包括化学能源、酶、DNA模板和NTP的来源。降低这些成本而可提高产量的方法是很感兴趣的。
相关文献Swartz等的美国专利6,337,191B1；Kim和Swartz，(2000)Biotechnol Prog.16385-390；Kim和Swartz，(2000)Biotechnol Lett.221537-1542；Kim和Choi，(2000)J Biotechnol.8427-32；Kim等，(1996)Eur J Biochem.239881-886；Kim和Swartz，(2001)Biotechnol Bioeng74309-316；Davanloo等，Proc.Nat’l Acad Sci USA812035-2039(1984)；Datsenko等，Proc Nat′l Acad Sci USA976640-6645(2000)；Jewett等，(2002)《体外表达、基因克隆和表达技术中的原核系统》(Prokaryoticsystems for in vitro expression，in Gene Cloning and Expression Technologies)(Weiner，M.P.和Lu，Q.编)，Eaton Publishing，Westborough，MA.，391-411页；Spirin等，Science 2421162-1164(1988)。
Cunningham和Ofengand(1990)Biotechniques9713-714建议加入无机焦磷酸酶经水解积累的焦磷酸盐导致较大的反应产量。由于焦磷酸盐与游离的镁离子的复合物较少为转录反应利用，焦磷酸盐是抑制性的。
Breckenridge和Davis(2000)Biotechnology Bioengineering69679-867建议可通过从固定于固体支持物，例如琼脂糖珠的DNA模板转录产生RNA，其产量与传统液相转录相差不大。固定化DNA的优点是可从反应中回收模板并重复使用多轮、消除不需要的配置并显著降低DNA模板的成本。
美国专利号6,337,191描述了使用糖酵解中间体作为能源的体外蛋白质合成；美国专利号6,168,931描述了使用新颖的ATP再生系统增强生物大分子的体外合成。
发明概述本发明提供了用于体外合成生物分子、改善产率、降低成本并提高利用率的改进方法。改进的无细胞蛋白质合成反应利用无磷酸化合物的ATP产生能源，例如葡萄糖、谷氨酸盐(glutamate)、丙酮酸等。核苷三磷酸任选为核苷单磷酸取代。这些改进极大降低了成本并增加了无细胞蛋白质合成反应的可靠性。通过加入外源性磷酸化合物(phosphate)基本上改进了反应。
附图简述

图1是比较利用本发明组分系统(component system)体外合成的蛋白质水平的柱状图，所述系统使用丙酮酸作为能源和核苷单磷酸加上不同浓度的磷酸化合物。从14C-亮氨酸掺入量确定CAT表达。误差棒表示来自两个独立实验的范围。
图2是比较利用本发明组分系统体外合成的蛋白质水平的柱状图，所述系统使用葡萄糖作为能源与核苷三磷酸和不同量的磷酸化合物。从14C-亮氨酸掺入量确定CAT表达。误差棒表示来自3个独立实验的标准偏差。
图3是比较利用本发明组分系统体外合成的蛋白质水平的柱状图，所述系统使用葡萄糖作为能源和用于成功的无细胞反应的各种成分。从14C-亮氨酸掺入量确定CAT表达。误差棒表示来自3个独立实验的标准偏差。
图4加入10mM磷酸化合物对使用葡萄糖作为能源和NTP或NMP的无细胞蛋白质合成反应的作用。误差棒表示来自9个实验(n＝9)的标准偏差。
图5使用葡萄糖作为能源和NTP或NMP的无细胞反应的ATP浓度。误差棒表示来自3个实验(n＝3)的标准偏差。
图6.使用Cytomim系统(加或不加磷酸化合物)表达CAT。反应(15μl)进行6小时，通过14C-亮氨酸掺入量确定CAT表达。误差棒表示来自7个单独实验的标准偏差。所有反应使用Cytomim系统(不加丙酮酸钠，加NTP)进行。磷酸化合物浓度表示于x轴。
图7.使用Cytomim系统(w/NTP)(不加丙酮酸，加10mM磷酸化合物)的时间-CAT表达图。反应于37℃进行6小时并通过14C-亮氨酸掺入量和酶活性分析确定CAT表达。每个时间点在不同的试管中制备15微升反应混合物。在每个时间点，使用一支试管检测表达蛋白质的量。误差棒表示7个独立实验的标准偏差。(■)通过Cytomim系统中14C-亮氨酸掺入量监测的CAT总产量。(●)通过Cytomim系统中14C-亮氨酸掺入量监测的CAT的可溶产量。(▲)通过酶测定确定的CAT活性产量。
图8.在1mL泡罩塔(bubble column)中使用Cytomim系统(不加丙酮酸，加10mM磷酸化合物)的CAT表达。反应(1mL)于37℃进行5小时。通过14C-亮氨酸的掺入量确定CAT表达。误差棒表示两个单独实验的高(high)和低(low)。在约3.5小时，反应器开始起泡，接着加入1×10-4(V/V)的Sigma0-30消泡剂控制此问题。
图10.基于相对总CAT表达的Cytomim系统的磷酸化合物最优化研究。所有实验使用Cytomim系统(不加丙酮酸钠，加NMP)的条件进行。15微升的反应于37℃孵育6小时。使用磷酸钾(二元，MallinckrodtPhillipsburg，NJ)和用冰醋酸调节pH至7.25。
实施方案详述改进方法提供生物大分子的体外合成，增加了产量、降低了成本和提高了利用率。结合反应条件提高了产量并降低了成本，所述条件包括，但不限于使用无磷酸化合物的能源、不存在外源性核苷三磷酸、存在核苷单磷酸和外源性有机磷酸。
无细胞反应需要用于蛋白质合成的ATP。出于此目的惯常将具有高能磷酸键的化合物，例如烯醇丙酮酸磷酸(PEP)加入反应。然而，由于细胞提取物中也存在糖酵解酶可使用葡萄糖和其它代谢中间物，例如谷氨酸盐、丙酮酸等以低得多的成本和用于AT产生的较高势能来驱动无细胞反应，所述ATP产生利用也激活氧化磷酸化的方法。组合下述因素得到产生更天然环境的反应条件。该系统能在体外分批反应中显著产生蛋白质达6小时。模拟细胞环境提高了合成能力。
在本发明优选的实施方案中，通过使用葡萄糖、谷氨酸盐、丙酮酸等作为能源和用核苷单磷酸替代常规的外源性核苷三磷酸将本文所述的反应混合物用于体外合成生物大分子。
通过加入外源性磷酸化合物，例如有机磷酸化合物等提高了产量。磷酸化合物一般以至少约1mM、优选至少约5mM和不大于约20mM、通常不大于约15mM并且优选约10mM的浓度提供。有用的磷酸化合物(PO4)源包括各种与生物反应相容的盐和酸，例如磷酸钾、磷酸镁、磷酸铵等。在其它实施方案中，通过加入合适量的含有磷酸根的化合物来提供磷酸化合物，从而使得在反应期间释放(例如通过酶释放)少量磷酸根。
反应优选基本上无聚乙二醇。在基本上无聚乙二醇的情况下进行合成可激活氧化磷酸化并改进折叠；并且还可结合如美国专利号6,548,276所述的方法，该专利引作参考。
本发明方法允许在向合成补加能源的条件下产生蛋白质，其中能源是无磷酸化合物的，例如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酸盐等。能源包括氨基酸，例如谷氨酸，三羧酸循环(TCA)中的化合物，柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸、乙醛酸、甘油和其它可引入中心代谢的化合物，例如乙酸等。能源可以至少约10mM、至少约20mM、更常见以至少约30mM浓度提供。这些化合物通常以不大于约250mM，更常见以不大于约150mM的浓度加入。例如，能源可是谷氨酸钾、谷氨酸铵等。在一些实施方案中，使用混合能源，例如谷氨酸钾和谷氨酸铵的混合物；或葡萄糖和谷氨酸源的组合。为延长反应时间，在蛋白质表达期间可向反应混合物中加入额外量的能源。或者，先用较低的起始浓度再连续或间歇地补加。
本文使用的体外合成指在含有生物提取物和/或确定的试剂的反应混合物中无细胞合成生物大分子。反应混合物可含有生产大分子的模板，例如DNA、mRNA等；待合成的大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等；和合成所需的辅因子、酶和其它试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。这种合成反应系统是本领域熟知的，并且描述于参考文献中。无细胞合成反应可以本领域已知的分批、连续流动或半连续流动方式进行。生物大分子的体外合成可包括mRNA翻译来产生多肽或可包括从DNA模板转录mRNA。
反应优选利用来自生长在含有葡萄糖和磷酸化合物的培养基中的细菌细胞提取物，其中葡萄糖以至少约0.25％(重量/体积)、更常见以至少约1％；并且通常以不大于约4％、更常见以不大于约2％的浓度存在。这种培养基的例子是2YTPG培养基，然而本领域的技术人员可理解的是，由于使用确定和不确定营养源的许多公布的培养基适合于生长细菌，例如大肠杆菌，出于此目的可使用许多培养基，特别是成分确定培养基(含葡萄糖的培养基的例子参见Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，冷泉港大学出版社，冷泉港，纽约)。
可优化用于开发此新技术的特定细菌菌株，例如大肠杆菌。特别是可遗传修饰菌株来提高蛋白质合成。例如，从染色体删除用于上述实验的菌株的speA、tnaA、sdaA、sdaB、tonA和endA基因。前4种突变有助于在反应中稳定精氨酸、色氨酸和丝氨酸浓度。后两种突变防御噬菌体感染并稳定系统中的DNA。或者，可向反应混合物中加入不良酶活性的代谢抑制剂。
常规反应混合物(例如，参见Kim和Swartz，2001)含有约2％聚乙二醇8000，但发现这降低产量。本方法用亚精胺和腐胺分子替代PEG。精胺和亚精胺的浓度至少约0.5mM、通常至少约1mM、优选约1.5mM和不大于约2.5mM。腐胺的浓度是至少约0.5mM、优选至少约1mM、优选约1.5mM和不大于约2.5mM。这些浓度极其依赖于用于无细胞反应中的总提取物浓度。本领域的技术人员应理解，改变提取物浓度后，亚精胺和腐胺的浓度也可改变为超出本文所述典型反应条件的范围。
反应混合物中镁的浓度影响总的合成。细胞提取物中常存在镁，可通过加入额外的镁来调节以优化浓度。这些方法中用的镁盐来源是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，镁的来源可是谷氨酸镁。优选镁的浓度是至少约5mM，通常至少约10mM，优选至少约12mM并且不大于约20mM，通常不大于约15mM。使用谷氨酸镁造成谷氨酸盐浓度的轻微变化不影响产量。
系统可在需氧和厌氧条件下运行。为增加合成产量，可对反应，特别是对大于15μl的反应供氧。反应室的顶室可充满氧；氧可输入反应混合物等。可连续供氧或为延长反应时间，可在蛋白质表达期间对反应室的顶室再次充满氧。其它电子受体，例如硝酸盐、硫酸盐或延胡索酸盐也可结合制备细胞提取物提供，从而使细胞提取物中的所需酶是活性的。
无需加入外源性辅助因子。诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD+或辅酶A的化合物可用于补充蛋白质合成产量，但不是必需的。
无细胞蛋白质合成的模板优选DNA。通常用于大肠杆菌系统的偶连的转录和翻译连续地从具有可识别启动子的DNA模板产生mRNA。可用外源性RNA聚合酶，或者向反应混合物直接加入外源性噬菌体RNA聚合酶，通常是T7或SP6。或者，可通过将信息插入QB复制酶(RNA依赖性RNA聚合酶)的模板来连续扩增mRNA。可从提取物中除去核酶来帮助稳定mRNA水平。模板可编码任何感兴趣的特定基因。
也可加入其它盐，特别是生物相关的，例如锰。钾的浓度通常是至少约50mM并且不大于约250mM。铵的浓度通常是不大于200mM，更常见的是不大于约100mM并且优选不大于约20mM的浓度。反应一般维持于约pH5-10和约20-50℃；更常见的是约pH6-9和约25-40℃。这些范围可扩展至感兴趣的特定条件。从宿主机体纯化(参见Muller和Blobel(1984)“细菌蛋白质穿过大肠杆菌质膜的体外转运”(In vitro translocation of bacteria proteins across the plasma membrane of Escherichiacoli)，PNAS 817421-7425)或合成的囊泡也可加入系统。这些可用于提高蛋白质合成和折叠。本文所述的技术显示激活利用细胞质膜组分的氧化磷酸化过程。激活氧化磷酸化必须有含呼吸链组分和F1F0ATP酶的反向膜囊泡。本方法也可用于无细胞反应以激活其它组的膜蛋白；例如插入或转运蛋白质或转运其它化合物。
在葡萄糖系统中，缓冲液对稳定pH是重要的。例如，葡萄糖反应中的bis-tris缓冲液可是约10-150mM，通常约50mM。只要其它缓冲液的Pka适合反应(或许在6.8和7.2之间)，也可使用。也可在反应期间直接加入碱来稳定pH。
用于提高体外合成的方法感兴趣的合成系统包括复制生物聚合物的系统，包括扩增DNA、从DNA或RNA模板转录RNA、将RNA翻译为多肽与从单糖合成复合糖。合成的增强包括在系统中合成的多肽的总量或相对量增加；每单位时间合成的多肽的总量或相对量增加；在系统中合成的生物活性多肽的总量或相对量增加；在系统中合成的可溶多肽的总量或相对量增加等。
反应可使用大规模反应器，小规模反应器或可多路(multiplexed)以同时进行多个合成。连续反应使用加料机理来引入试剂流，并可分离作为过程一部分的终产物。分批系统也是感兴趣的，其中可引入额外试剂来延长活性合成的时间。反应器可根据应用目的以任何方式运行，例如分批、延长分批、半分批、半连续、补料-分批和连续反应。
反应可以是任何体积，可以是小规模的，通常至少约1μl并且不大于15μl，或是规模放大的反应，其中反应体积至少约15μl、通常至少约50μl、更常见至少约100μl，并且可以是500μl、1000μl或更大。虽然可同时进行多个反应，在大多数情况中，单个反应不大于约10ml。然而，只要供氧(或电子受体)充足，原则上反应可以任何规模进行。
翻译mRNA产生蛋白质是特别感兴趣的，其中翻译可与体外从DNA模板合成mRNA相结合。这种无细胞系统含有翻译mRNA所需的所有因子，例如核糖体、氨基酸、tRNA、氨酰基合成酶、延伸因子、起始因子和核糖体循环因子。本领域已知的无细胞系统包括可用合适的核酶处理以去除活性内源性mRNA的大肠杆菌提取物等。
除了上述成分，例如无细胞提取物、遗传模板和氨基酸以外，蛋白质合成特别需要的材料可加入反应。这些材料包括盐、亚叶酸、环AMP、蛋白质或核酸降解酶的抑制剂、蛋白质合成的抑制剂或调节剂、氧化/还原电位调节物、非变性表面活性剂、缓冲成分、精胺、亚精胺、腐胺等。
盐优选包括钾盐、镁盐和铵盐(例如，乙酸或硫酸的盐)。这些盐的一种或多种可具有氨基酸，例如谷氨酸作为反荷阴离子。最佳浓度的离子种类之间有相互依赖性。通常根据蛋白质生产优化这些离子种类。当改变反应介质的特定成分的浓度时，另一成分的浓度可相应变化。例如，可根据其它成分浓度的变化同时控制几种成分，如核苷酸和能源化合物的浓度。也可随时间改变成分的浓度水平。氧化/还原电位调节物可以是二硫苏糖醇、抗坏血酸、谷胱甘肽和/或它们的氧化形式。也可任选含有浓度不大于约500Mm，更常见不大于约250mM的非变性表面活性剂，例如Triton X-100。
当以连续操作模式使用蛋白质分离装置时，来自反应器的产物输出流过膜并进入蛋白质分离装置。在半连续操作方式中，膜的外侧或外表面与以预定顺序循环变化的预定溶液接触。这些溶液含有诸如氨基酸和核苷酸的底物。此时，反应器以透析、渗滤分批或补料-分批模式操作。加料溶液可通过同一膜或独立的注入单元提供给反应器。合成的蛋白质在反应器中累积，然后在系统操作完成后根据用于蛋白质纯化的常规方法分离和纯化。
在有试剂流的地方，液流方向可垂直于膜和/或与膜相切。切向流动可有效地循环ATP和防止膜堵塞，并且可加到垂直流动上。可通过正压泵或真空抽吸泵造成或实现垂直于膜的流动。与膜的外表面接触的溶液可循环变化，并且可以相对于膜的稳定切向流动。反应器可通过合适的搅拌装置进行内部或外部搅拌。
蛋白质在反应器中的合成期间，选择性分离所需蛋白质的蛋白质分离装置可包括用吸附合成的所需蛋白质的组件固定的充满颗粒的单元和具有合适大小的孔的膜，所述颗粒包衣有抗体分子或其它分子。蛋白质分离装置优选包括用于交替使用的两列。翻译反应中产生的蛋白质的量可以各种方式检测。一种方法取决于检测翻译的特定蛋白质活性的测定的有效性。检测蛋白质活性的测定的例子是荧光素酶测定系统或氯霉素乙酰转移酶测定系统。这些测定检测翻译反应产生的功能活性蛋白质的量。活性测定不检测由于不恰当的蛋白质折叠或缺乏其它蛋白质活性所需翻译后修饰导致失活的全长蛋白质。
检测在偶联的体外转录和翻译反应中产生蛋白质的量的另一种方法是进行以下反应，该反应使用已知量的放射性标记氨基酸，例如35S-甲硫氨酸、3H-亮氨酸或14C-亮氨酸，然后检测掺入新翻译蛋白质中的放射性标记氨基酸的量。掺入测定检测在体外翻译反应中产生的所有蛋白质中(包括截短的蛋白质产物)放射性标记氨基酸的量。放射性标记的蛋白质还可在蛋白质凝胶上分离和通过证实产物大小合适和未产生次级蛋白质产物的放射自显影术分离。
应该理解的是，本发明不受所述具体方法、策略、细胞系、动物种类或属、构建物和试剂的限制，因为这些当然可变化。也应该理解的是，本文使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，并非要限制本发明的范围，本发明的范围仅受附加的权利要求的限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。虽然与本文所述相似或等价的任何方法、装置和材料可用于实施或测试本发明，优选的方法、装置和材料仍是本文所述的。
本文述及的所有出版物出于描述和公开的目的纳入本文作为参考，例如出版物中所述可能与本文所述发明联合使用的细胞系、构建物和方法。提供以上和全文中讨论的出版物仅是因为它们的公开早于本申请的提交日期。本文没有什么可认为是由于在先发明而使本发明人不具先于这些公开的资格。
提供以下实施例是为向本领域的普通技术人员完全公开并描述如何制造和使用本发明，而非要限制本发明的范围。我们努力保证使用数值(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但应该允许有一些实验失误和偏差。除非另有指出，部分是以重量计的部分，分子量是平均分子量、温度是摄氏度、压力是大气压或接近大气压。
实验实施例1葡萄糖作为能源方法和材料用于合成的标准Cytomim环境含有以下组分1.2mM ATP、0.85mM的各种GTP、UTP和CTP、1mM DTT、130mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、8mM谷氨酸镁、34μg/ml亚叶酸、170.6μg/ml大肠杆菌tRNA混合物、13.3μg/ml质粒、100μg/ml T7RNA聚合酶、2mM的20种未标记的氨基酸、11μM[14C]亮氨酸、1.5mM亚精胺和1mM腐胺、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.26mM辅酶A、2.7mM草酸钠和0.24体积的S30提取物。使用大肠杆菌K12(Michel-Reydellet等，(2004)Met Eng(6)197-203中所述的菌株KCl，基因型A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaB met+)的粗S30提取物，用稍作改进的Pratt，J.M.1984所述方案(“原核无细胞系统中偶联的转录-翻译”(Coupled transcription-translation in prokaryoticcell-free systems)，刊于《转录和翻译实际方法》(Transcription and translationapractical approach)，Hanes，B.D.和S.J.Higgins编，179-209页，IRL Press，New York)进行原核无细胞蛋白质合成。用于提取物的细胞生长于成分确定培养基(Zawada等，(2003)，“用于生产大肠杆菌细胞提取物的高密度、成分确定培养基”(High-density，defined media culture for the production of Escherichia coli cellextracts)，刊于Saha B编《发酵生物技术》(Fermentation Biotechnology)，Washington，DCACS Press，142-156页)。按照Davanloo等，1984所述方法从大肠杆菌菌株BL21(pAR1219)制备T7 RNA聚合酶(“噬菌体T7 RNA聚合酶的基因克隆和表达”(Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase)，Proc Nat′lAcad.Sci.USA812035-2039)。可加入33mM丙酮酸钠来提高该系统，虽然这不是必需的。在每次从细胞提取物开始的反应中有约额外的3.3mM镁、14.4mM钾、2.4mM TRIS和23.5mM乙酸。
根据本发明的方法，用于合成的改进的Cytomim系统是加入10mM磷酸钾和50mM Bis-Tris(pH7.0)，使用5μM[14C]亮氨酸而非11μM。此外，加入30mM葡萄糖，1.2mM AMP替代1.2mM ATP，0.85mM的各种GMP、UMP和CMP替代0.85mM的各种GTP、UTP和CTP。另外，省去草酸。
反应于37℃孵育3-6小时。从用液体闪烁计数仪(Beckman LS3801)检测的TCA-不溶放射性估计合成的蛋白质的量。(Kim等，1996)。如上述测定可溶性蛋白质的产量(Kim和Swartz，2000)。
结果Kim和Swartz(2001)描述了偶联的转录-翻译反应的标准反应混合物。标准反应中的能源是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)。以前用葡萄糖直接取代PEP实际上导致无蛋白质合成。然而，当用葡萄糖-6-磷酸(G6P)替代PEP时，观察到228±13μg/mL的显著蛋白质产量(Kim and Swartz 2001)。葡萄糖-6-磷酸在糖酵解反应途径中离葡萄糖仅一步，这表明最初的磷酸化步骤是限制性的。进行了几个实验来缓解该限制，包括向反应加入己糖激酶或葡萄糖激酶，或者缓慢加入葡萄糖。两种方法均不成功。
通过改进标准反应混合物继续优化G6P反应直至使用该能源的蛋白质平均产量超过700μg/mL。为得到这些蛋白质产量，使用新的pH缓冲液并除去草酸。此外，G6P反应显示可用NMP代替NTP得到类似的产量。这种替代显著降低了反应成本。尽管有这些进展，当用葡萄糖替代GF6P时，优化的条件仍未显著提高蛋白质合成。
当用天然阳离子腐胺和亚精胺替代聚乙二醇，向优化的反应中加入额外磷酸化合物并省去草酸钠时，葡萄糖作为能源并使用NMP获得成功。磷酸化合物对糖酵解的起始步骤(葡萄糖到G6P)和NMP到NTP的磷酸化均重要。当使用葡萄糖作为能源时，无细胞反应是磷酸化合物限制的。该限制在通常使用磷酸化能源，例如PEP、磷酸肌酸或甚至G6P的传统无细胞反应中不存在。与使用G6P的实验(产生超过800μg/mL的蛋白质产量)相比，发现使用葡萄糖加磷酸化合物的实验得到超过400μg/mL的蛋白质产量。由于降低了成本并增加了这些试剂的稳定性，葡萄糖和NMP反应是有利的。
仅当加入额外磷酸化合物时，丙酮酸，另一种非磷酸化的能源和NMP也成功地用于无细胞的蛋白质合成。用丙酮酸替代葡萄糖，NMP替代NTP后，上述混合物进行3小时分批反应。磷酸优化得到的蛋白质产量接近使用NTP的，但成本仅是使用NTP的几分之一(图1)。无任何额外的磷酸化合物，蛋白质合成产量基本上较低。
为进一步确定该新反应的要求，分别研究反应组分。使用NTP和葡萄糖作为能源的反应也确定从额外的磷酸化合物获益(图2)，获得类似于NMP反应的产量。也进行了其它实验来确定对成功反应重要的其它步骤。发现除去PEG和草酸以及用合适的缓冲液仔细地控制pH对蛋白质产量有显著影响(图3)。
无细胞蛋白质合成反应以前限于使用磷酸化的能源和核苷酸三磷酸。这些化合物在无细胞反应中是较贵的试剂。此外，磷酸化的分子更易于降解并产生与无机磷酸化合物浓度有关的易变反应环境。使用葡萄糖和核苷一磷酸增加反应的可靠性和稳态同时也显著降低了成本。事实上，当比较能源和核苷酸成本时，葡萄糖和NMP比PEP和NTP便宜将近两个数量级(表1，第1行)。
使用葡萄糖作为能源和NMP的体外合成反应的蛋白质合成产量是传统反应的约60％。然而，使用葡萄糖和NMP的巨大成本优势抵消了产量的稍微降低，从而使得相对产物产量在成本基础上几乎好90倍(表1，行3)。
表1比较使用各种能源和核苷酸的无细胞反应
使用大肠杆菌KC1作为提取物来源按照上述进行了关于反应条件的其它无细胞反应(Michel-Reydell等所述，(2004)Metab Eng 6(3)197-203)。在无细胞反应期间各种时间取样获得ATP浓度的数据。样品用等体积(1∶1)的5％三氯乙酸(TCA)沉淀并以14000g离心10分钟。收集上清液并通过萤火虫荧光素酶测定分析确定ATP浓度(Kim和Swartz，(2001)，同上)。
图4比较了有或没有磷酸化合物的上述葡萄糖系统和NMP与NTP。图4的数据证实10mM磷酸化合物对葡萄糖系统有利。此外，这些数据显示NMP可替代NTP而对蛋白质合成产量无影响。
图5的数据显示使用NMP的无细胞系统可再生转录/翻译所需的ATP。事实上，使用NMP的ATP浓度快速达到在葡萄糖/NTP反应中观察到的相同水平。
实施例2谷氨酸盐作为能源下述转录-翻译联合反应的反应混合物含有以下组分1.2mM ATP、0.85mM各种GTP、UTP和CTP、130mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、10mM谷氨酸镁、1.5mM亚精胺、1mM腐胺、34μg/ml亚叶酸、170.6μg/ml大肠杆菌tRNA混合物、13.3μg/ml质粒、100μg/ml T7RNA聚合酶、2mM20种未标记的氨基酸、5μML-[U-14C]亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.26mM辅酶A、4.0mM草酸钠和0.24体积的S30提取物。
省去作为能源的丙酮酸。在这种情况中，补充10mM磷酸钾，pH7.2(用冰乙酸)有利于蛋白质表达。除了用NTP(ATP、GTP、UTP和CTP)以外，也可用上述相同起始浓度的NMP(AMP、GMP、UTP和CMP)进行反应。起始于细胞提取物的每个反应中有约3.3mM镁、14.4mM钾、2.4mM TRIS(pH8.2)和23.5mM乙酸。提取物占反应体积的24％并用由镁、钾和tris乙酸盐构成的自身缓冲液配制。因此，该缓冲液加入反应增加了这些物质的浓度。以上浓度(3.3mM、14.4mM等)是已加入提取物后的终浓度。大肠杆菌总的tRNA混合物购自Roche MolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)。L-[U-14C]-亮氨酸得自Amersham PharmaciaBiotechnology(Uppsala，Sweden)。所有其它试剂得自Sigma(St.Louis，MO)。
使用大肠杆菌K12(菌株KCl，基因型A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaB met+)的粗S30提取物进行无细胞蛋白质合成反应。按照以前所述制备提取物(Swartz等，(2004)，“使用原核的偶联转录-翻译的无细胞蛋白质合成”(Cell-freeprotein synthesis with prokaryotic coupled transcription-translation)，刊于Balbas P，Lorence A编《重组蛋白质方案分子生物学方法》(Recombinant Protein ProtocolsMethods in Molecular Biology)，系列第267卷，Totowa，NJHumana Press Inc.，第169-182页)。质粒pK7CAT用作蛋白质合成的模板。pK7CAT使用T7启动子和终止子编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的序列。按照Swartz等，(2004)制备的T7聚合酶加入反应。从用液体闪烁计数仪检测的TCA-不溶放射性和酶活性(Shaw，(1975)Methods Enzymol.43737-755)估算合成的蛋白质的量。
本文显示补充磷酸化合物在由谷氨酸代谢和氧化磷酸化激发的Cytomim系统中明显有利于蛋白质生产的产量。这描述于使用NTP或NMP的内容中。就NTP而言，与不加磷酸化合物的反应相比，我们观察到表达6小时后氯霉素乙酰转移酶(CAT)产生明显增加(通过14C-亮氨酸掺入评价)(图6)。当使用核苷酸三磷酸时，加入磷酸化合物也增加了产量。
为优化谷氨酸盐/磷酸化合物系统中的CAT表达，测试了磷酸化合物浓度对Cytomim无细胞反应(无丙酮酸钠)的作用。在初始磷酸化合物浓度范围上表达6小时后通过14C-亮氨酸掺入来评价氯霉素乙酰转移酶(CAT)产生。加入10mM磷酸化合物观察到最佳CAT产量(表2)。
表2
表1-Cytomim系统中基于相对总CAT表达的磷酸化合物优化研究。使用Cytomim系统的条件(不用丙酮酸钠和用NTP)进行所有实验。15微升反应于37℃孵育6小时。使用以冰醋酸调节pH至7.25的磷酸钾(二元，MallinckrodtPhillipsburg，NJ)。
为进一步鉴定利用谷氨酸盐代谢、NTP和补充磷酸化合物的该新方法，通过TCA可沉淀放射性和酶活性测定来定量CAT随时间的累积。6小时孵育后，CAT的最终产量是802±48μg/mL(图7)。CAT的可溶和活性部分约是70±3％(图2)。由于加入磷酸钾的成本低(10mM磷酸钾为0.00016美元/mL反应体积)，补充10mM磷酸化合物的蛋白质生产产量增加了33％而不影响反应的原料成本。
为证实新谷氨酸盐和磷酸化合物系统的效用，进行1mL夹套气泡柱反应。除了向反应补充0.007％(v/v)Sigma0-30消泡剂以外，维持于37℃的转录和翻译联合反应使用Cytomim条件(不用丙酮酸，用NTP并补充10mM磷酸化合物)进行5小时。该试剂用于控制起泡。此外，向无细胞反应室的底部以每秒2个气泡的速度提供直径约0.25cm的纯氧气泡以递送ATP再生所需的氧。在每个时间点取样通过14C-亮氨酸掺入测定来定量总CAT的量。图8显示了两个独立实验的平均CAT累积(～900μg/mL)。与15μl分批反应相比(图7)，气泡柱形式具有较快的蛋白质合成速度。
为定量用NMP替代NTP的影响，检测在以标准起始浓度使用NMP或NTP的新系统中(谷氨酸盐/10mM磷酸化合物)的CAT表达。蛋白质合成反应进行6小时并取样定量CAT累积。与使用NTP相比，使用NMP观察到CAT产量降低了22％(图9)。与使用NTP的反应相比，尽管总蛋白质产量降低，但使用核苷一磷酸的成本益处导致明显较高的生产产量(每一美元能源和核苷酸的毫克蛋白)(表3)。
也检测了NMP反应中磷酸化合物浓度范围对蛋白质表达产量的作用。与以前的数据一致证实使用NMP的无细胞蛋白质合成反应是磷酸化合物限制的，补充磷酸化合物对高产量至关重要。最佳的磷酸化合物浓度是10mM。与无磷酸化合物的无细胞反应相比，加入10mM磷酸化合物后使产量增加超过400％(图10)。
表3-1用当前价格更新这些数值。现在它们与表1匹配。
表3-PANOx-SP(用NTP)、Cytomim(不用丙酮酸，用磷酸化合物和NTP)和Cytomim(不用丙酮酸，用磷酸化合物和NMP)系统的产物产量(mg蛋白质/美元能源与核苷酸成本)。
在本文中，补充磷酸化合物显示在由谷氨酸盐激发的无细胞蛋白质合成反应中增加了33％的蛋白质合成产量。除了通过增加产量提高该系统的效用之外，这增加产量而不影响原料(试剂成本)的总经济效益。特别是，与不用磷酸化合物的反应相比，谷氨酸盐代谢激发的无细胞反应增加超过4倍。
补充磷酸化合物导致产量增加的结果是通过使用由谷氨酸代谢和氧化磷酸化激发的无细胞反应，补充适度的磷酸化合物浓度和用NMP替代NTP使得与无细胞试剂相关的两种主要试剂的成本(能量基质与核苷酸)比常规PANOx-SP方法降低超过两个数量级(增加160倍(59/0.37))(表3)。这些结果证实了无细胞rDNA蛋白质合成的经济可行性。该新技术无需加入外源性辅因子。诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD+或乙酰辅酶A的化合物可用于补充蛋白质合成产量，但不是必需的。
权利要求
1.一种提高生物大分子体外合成的方法，该方法包括在存在外源性磷酸化合物时，在含有无磷酸化合物的能源的反应混合物中合成所述生物大分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无磷酸化合物的能源是葡萄糖。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无磷酸化合物的能源是谷氨酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无磷酸化合物的能源是丙酮酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物的浓度是约1mM-20mM。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物以磷酸钾、磷酸镁或磷酸铵的形式提供。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物以在反应期间释放的来源提供。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物含有核苷一磷酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述合成在没有外源性核苷酸三磷酸时进行。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成包括翻译mRNA以产生多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述合成还包括从DNA模板转录mRNA。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成以分批反应进行。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成以连续反应进行。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物含有在含葡萄糖培养基中生长的大肠杆菌E.coli的提取物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌E.coli在含有葡萄糖和磷酸化合物的培养基中生长。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物含有浓度为约5mM-20mM的镁。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物基本上不含聚乙二醇。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述反应混合物含有精胺、亚精胺和腐胺中的一种或多种。
全文摘要
提供了体外合成生物分子的改进方法，该方法提高了产量、降低了成本并增加了效用。通过在有外源性磷酸化合物，并且任选没有外源性核苷酸三磷酸时使用无磷酸化合物的能源来提高产量和降低成本。
文档编号C12P19/34GK101014716SQ200480033981
公开日2007年8月8日 申请日期2004年11月18日 优先权日2003年11月20日
发明者K·卡尔霍恩, M·C·朱伊特, J·R·斯沃茨 申请人:利兰·斯坦福青年大学托管委员会