专利名称：一种l－亮氨酸高产菌及用其发酵法生产l－亮氨酸的制作方法
技术领域：
一种L-亮氨酸高产菌及用其发酵法生产L-亮氨酸，涉及一种抗磺胺胍和支链氨基酸结构类似物的L-亮氨酸高产菌及其选育方法和用该菌株发酵法生产L-亮氨酸，属于生物工程技术领域。
背景技术：
L-亮氨酸是常见18种氨基酸中的一种，也是人体8种必需氨基酸之一，在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。目前国内L-亮氨酸生产方法以蛋白水解提取法为主，如CN1056830C所公开的技术，其采用毛发水解制备胱氨酸，再从废液中制备L-亮氨酸。由于天然蛋白质原料氨基酸组成复杂，提取工艺复杂，污染严重，收率较低，产品安全性差，极大的刺激了生物发酵法生产L-亮氨酸工艺技术的研究热情。小野由纪子(小野由纪子，CN1072721C)在培养基中培养埃希氏菌属和棒杆菌属，使所产生的细胞在反应液中同糖和醋酸或其盐反应生成并积累L-亮氨酸27g/L。中野哲郎(中野哲郎，CN1100146C)利用对5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的埃希氏菌属发酵生产L-亮氨酸，产酸率为3.9g/L。马科维奇(马科维奇，CN1222576A)选育出埃希氏菌属的突变株(Valr，Alr，Hleur，Leur)的L-亮氨酸的产量为1.5～1.7g/L。张素珍(微生物学通报，1989，16(5)264～267)等选育的钝齿棒状杆菌突变株，产酸20g/L。宫锦芗(微生物学杂志，1988，8(1)22～25)利用亚硝基胍诱变处理黄色短杆菌，摇瓶发酵产酸达13.5g/L。齐秀兰等(沈阳药学院学报，1993，10(4)，279～285)利用紫外线、利福平、氯化锂诱变黄色短杆菌的原生质体，筛选得到L-亮氨酸产生菌株，摇瓶产酸可达24.5g/L。刘党生(沈阳药学院学报，1993，10(1)41～44)筛选到一株α-氨基β-羟基戊酸和利福平抗性菌株，16升发酵罐中产酸可达21.8g/L。宋超先等(食品与发酵工业，2004，30(3)61-65)选育的黄色短杆菌的突变株TK0303的摇瓶产酸可达28.3g/L。以上报道的L-亮氨酸的生产菌的产酸水平距工业化生产还有一定的距离，目前我国的氨基酸生产厂家尚无用发酵法生产的L-亮氨酸产品，国内市场销售的L-亮氨酸全部是用提取法生产的。因此选育优良的L-亮氨酸生产菌仍然是L-亮氨酸发酵的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提出一种磺胺胍和支链氨基酸结构类似物抗性的L-亮氨酸高产菌极其选育方法和用该菌发酵法生产L-亮氨酸。
本发明技术方案本发明提出生产L-亮氨酸的菌株，其名称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，本菌株是以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032为出发菌株，分别经硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)诱变处理，在基本培养基中添加支链氨基酸的结构类似物，在完全培养基中添加磺胺胍，经培养筛选和复筛而得。对其进行抗性验证，确证本菌株具有以下遗传特性亮氨酸氧肟酸盐抗性(LeuHxr)，抗性浓度为5～10g/L；2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)，抗性浓度为5～10g/L；α-氨基丁酸抗性(α-ABr)，抗性浓度为20～40g/L；、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)，抗性浓度为10～15g/L；磺胺胍抗性(SGr)，抗性浓度为15～25g/L。
出发菌株出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
诱变处理和筛选过程中所用的各种培养基组成为斜面和种子培养基葡萄糖1g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2。
完全培养基葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2。
基本培养基(MM)葡萄糖20g，硫酸铵10g，KH2PO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O0.4g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，VH200μg，VB1200μg，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2。
筛选培养基(CM)在MM培养基加支链氨基酸的结构类似物；在完全培养基的基础上加磺胺胍。
发酵法生产L-亮氨酸所用的培养基组成为种子培养基葡萄糖20g，玉米浆25ml，硫酸铵2g，KH2PO4·3H2O1.5g，VH200μg，VB1300μg用自来水定容至1L。pH7.0～7.2。
发酵培养基葡萄糖130～170g，玉米浆20～40ml，硫酸铵20～40g，KH2PO4·3H2O0.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.2～0.6g，MnSO4·H2O0.05～0.15g，VH25～75μg，VB1250～350μg，CaCO320～40g，用自来水定容至1L，pH7.0～7.2。
将菌株以10～15％(W/W)接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或发酵罐通风培养，pH6～8；培养温度30～35℃，培养时间为50～65小时，摇瓶培养转速为200rpm，或发酵罐培养通气量为3L/min，搅拌转速为600rpm，L-亮氨酸在发酵罐中积累。
本发明的有益效果从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032选育的磺胺胍和支链氨基酸结构类似物的抗性突变株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，表现出积累高水平L-亮氨酸的能力，这是由于相对于出发菌株来说解除了三支链氨基酸的反馈阻遏。用该菌已通过摇瓶水平和5L发酵罐水平的发酵法生产L-亮氨酸的试验，L-亮氨酸的产量分别达到30～32g/L、40g/L，具有工业实用性价值。
图1选育谱系图。
生物材料样品保藏一种生产L-亮氨酸的菌株，该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)JH-27，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.1378，保藏日期为2005年5月24日。
具体实施例方式
实施例1 制备对亮氨酸氧肟酸盐有抗性的突变株。
将出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032用硫酸二乙酯(1％，30℃，30分钟)进行常规诱变处理，然后涂布在含5-10g/L的亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对亮氨酸氧肟酸盐有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸的发酵试验，在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)L1-68，其L-亮氨酸的产量为8.9g/L。
实施例2 制备对2-噻唑丙氨酸有抗性的突变株。
将实施例1获得的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L1-68用硫酸二乙酯(1％，30℃，25分钟)进行常规诱变处理，然后涂布在含5-10g/L的2-噻唑丙氨酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对2-噻唑丙氨酸有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸的发酵试验，在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)L2-132，其L-亮氨酸的产量为13g/L。
实施例3 制备对α-氨基丁酸有抗性的突变株。
将实施例2获得的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L2-132用亚硝基胍(0.3％，30℃，45分钟)进行常规诱变处理，然后涂布在含20-40g/L的α-氨基丁酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对α-氨基丁酸有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸的发酵试验，在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)L3-206，其L-亮氨酸的产量为18g/L。
实施例4 制备对β-羟基亮氨酸有抗性的突变株。
将实施例3获得的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L3-206用亚硝基胍(0.3％，30℃，30分钟)进行常规诱变处理，然后涂布在含10-15g/L的β-羟基亮氨酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对β-羟基亮氨酸有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸的发酵试验，在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)L4-89，其L-亮氨酸的产量为25g/L。
实施例5 制备对磺胺胍有抗性的突变株。
将实施例4获得的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)L4-89先用紫外(15W，30cm，6分钟)进行常规诱变处理，再用亚硝基胍(0.2％，30℃，20分钟)进行常规诱变处理，然后涂布在含15-25g/L的磺胺胍的完全培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对磺胺胍有抗性的突变株，然后进行L-亮氨酸的发酵试验，在这些突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株称为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，其L-亮氨酸的为量为30～32g/L。
实施例6 以JH-27发酵法生产L-亮氨酸。
从新鲜斜面上接种一环JH-27菌种入种子培养基(25ml/500ml三角瓶)，在30℃，200rpm下培养14小时后，以10-15％接种量(V/V)接入发酵培养基中。种子培养基和发酵培养基的组成如本说明书所述。
摇瓶培养500ml三角瓶内发酵培养基的装液量为20ml，转速200rpm，发酵时间为60小时，L-亮氨酸的产量为30～32g/L。
实施例7 以JH-27在5L发酵罐合成L-亮氨酸。
斜面种子培养和发酵接种条件均同实施例6，5L发酵罐中发酵培养基体积为3L。通气量为3L/min，搅拌转速为600rpm，发酵温度为30-35℃，发酵时间为50-55小时。L-亮氨酸产量为40g/L。
权利要求
1.一种生产L-亮氨酸的菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)JH-27，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.1378。
2.一种生产L-亮氨酸的菌株的选育方法，其特征是由谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，分别经硫酸二乙酯、亚硝基胍和紫外诱变处理，再分别在基本培养基中添加支链氨基酸的结构类似物和在完全培养基中添加磺胺胍选育得到，(1)制备对亮氨酸氧肟酸盐有抗性的突变株将出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032用1％硫酸二乙酯30℃，30分钟进行常规诱变处理，然后涂布在含5-10g/L的亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对亮氨酸氧肟酸盐有抗性的突变株；(2)制备对2-噻唑丙氨酸有抗性的突变株将步骤(1)所获突变株再用1％硫酸二乙酯30℃，25分钟进行常规诱变处理，然后涂布在含5-10g/L的2-噻唑丙氨酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对2-噻唑丙氨酸有抗性的突变株；(3)制备对α-氨基丁酸有抗性的突变株将步骤(2)所获突变株用0.3％亚硝基胍30℃，45分钟进行常规诱变处理，然后涂布在含20-40g/L的α-氨基丁酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对α-氨基丁酸有抗性的突变株；(4)制备对β-羟基亮氨酸有抗性的突变株将步骤(3)所获突变株用0.3％亚硝基胍30℃，30分钟进行常规诱变处理，然后涂布在含10-15g/L的β-羟基亮氨酸的基本培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对β-羟基亮氨酸有抗性的突变株；(5)制备对磺胺胍有抗性的突变株将步骤(4)所获突变株先用紫外15W，30cm，6分钟进行常规诱变处理，再用0.2％亚硝基胍30℃，20分钟进行常规诱变处理，然后涂布在含15-25g/L的磺胺胍的完全培养基上，30℃培养2～4天，挑取在此培养基上生长的菌落，作为对磺胺胍有抗性的突变株；在诱变处理和筛选过程中所用的培养基组成为完全培养基葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2；基本培养基(MM)葡萄糖20g，硫酸铵10g，KH2PO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O0.4g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，VH200μg，VB1200μg，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2。
3.一种用权利要求1所述方法培养得到的生产L-亮氨酸的菌株，其特征是该项菌株具有以下遗传特性亮氨酸氧肟酸盐抗性，抗性浓度为5～10g/L；2-噻唑丙氨酸抗性，抗性浓度为5～10g/L；α-氨基丁酸抗性，抗性浓度为20～40g/L；β-羟基亮氨酸抗性，抗性浓度为10～15g/L；磺胺胍抗性，抗性浓度为15～25g/L。
4.一种用权利要求1所述方法培养得到的生产L-亮氨酸的菌株发酵法生产L-亮氨酸的方法，其特征是发酵培养基为葡萄糖130～170g，玉米浆20～40ml，硫酸铵20～40g，KH2PO4·3H2O 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，MnSO4·H2O0.05～0.15g，VH25～75μg，VB1250～350μg，CaCO320～40g，用自来水定容至1L，pH7.0～7.2；将菌株以10～15％接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或发酵通风培养，pH6～8；培养温度30～35℃，培养时间为50～65小时，摇瓶培养转速为200rpm，或发酵罐培养通气量为3L/min，搅拌转速为600rpm，L-精氨酸在发酵液中积累。
全文摘要
一种L－亮氨酸高产菌及用其发酵法生产L－亮氨酸，属于生物工程技术领域。本发明的菌种为一种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)JH－27，它由谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，分别经硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)诱变处理，再分别在基本培养基中添加支链氨基酸的结构类似物和在完全培养基中添加磺胺胍选育得到，是一株抗磺胺胍和支链氨基酸结构类似物的L－亮氨酸高产菌，用该菌株发酵法生产L－亮氨酸，与出发菌株相比较，表现出积累高水平L－亮氨酸的能力。JH－27摇瓶培养60h，L－亮氨酸产量为30～32g/L。5L发酵罐发酵55小时，L－亮氨酸产量为40g/L。
文档编号C12N1/20GK1702168SQ20051004043
公开日2005年11月30日 申请日期2005年6月6日 优先权日2005年6月6日
发明者蔡立明, 宁健飞 申请人:无锡晶海氨基酸有限公司