专利名称：一种生物催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物催化制备(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物催化不 对称还原制备医药手性中间体技术领域。
技术背景手性(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Benzenebutanoic acid， a-hydroxy-, ethyl ester, (aR)-)，分子式为C12H1603，分子量为208. 25， CAS号:90315-82-5。 (R)-2-羟 基-4-苯基丁酸乙酯是合成众多血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利类药物的关键手 性中间体。由于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯在该类药物合成中的重要性，吸引了许多 人对其制备进行了广泛的研究，报道了大量的制备方法。目前，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的生产可以通过化学或生物拆分外消旋体、手性 源合成和不对称还原等方法来进行。1. 化学合成和化学拆分方法。此法需要手性助剂的成本比较高，副产物比较多，污 染较严重。2. 手性源合成方法。此方法需要较昂贵的手性源如D-苹果酸(EP0759424A)或者反 应条件苛刻，如L-丝氨酸在无水低温条件下反应(JP62212329A)，因而实用价值不大。3. 酶法或者微生物整细胞不对称还原方法。虽然酶法反应具有反应条件温和、立 体选择性高、环境友好等优点。但是，氧化还原酶反应需要价格昂贵的氧化还原辅酶〃汽0+ 或者NADP+的参与，与纯酶相比，利用微生物整细胞进行催化反应具有明显优势。基于上面的这些原因，利用微生物方法将a -羰基进行对映选择性还原是一种目前 比较有效的方法。在研究与实践的过程中发现，多种生物材料可以用于2-羰基-4-苯基 丁酸乙酯的转化。瑞士Ciba-Geigy公司曾研究用乳酸脱氢酶"a"We ^ 力j^n^e/7ase)和甲酸脱氢 酶，通过搅拌反应器的连续运作进行商品酶转化，获得了大于99M的ee值和大于9W的转 化率，但商品酶价格高昂，而且在反应中还必须添加昂贵的辅酶NAD+作为辅助因子，因 此该方法无法实际应用。还有利用野生胡萝卜(促"c"s 细胞催化，能获得较好的产率(90%)和ee值(99%)，但是却需要很长的反应时间(大约10天)(Chadha等，Tetrahedron: Asymmetry ， 7(6)， 1571-1572， 1996)。还有使用薄荷、烟草、栀子花等种类的细胞来进行催化还原的报道(Akakabe, Y. ;Naoshima, Y. ;Phytochem., 1994， 35， 661)。利用微生物整细胞进行催化反应如利用小红酵母W力oobtor"7a孤'/wte IFO 0920) 和假丝酵母(^/7必A力^肌7 KPY 124020)在水/有机相中转化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯， ee值分别达到95冗和94M，缺点是转化率不高，最高58% (Shinobu 0da等，Biosci. Biochem.62: 1762-1767， 1998);夏咏梅等利用面包酵母在水相和有机溶剂相中不对称 催化转化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯得到产物对映体值为82.25%，产率为75.82% (化学研 究与应用，2006， 18(4): 426-430;食品与生物技术学报，2006， 25(2): 66-69)。从目前生物催化合成(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的报道和研究来看，缺乏高对 映选择性和高产率的微生物酶源，因此，还需要对微生物进行筛选，找到一种稳定、催 化效率更高更经济的菌株，并选择适当的反应条件，最大限度地提高对映体选择性和单 位产率。发明内容本发明的目的是提供产高立体选择性羰基还原酶的微生物，提供一种新的能有效催 化不对称还原反应制备手性羟基丁酸酯的方法，并利用该类微生物菌株催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原，以获得高对映体值、高反应摩尔转化率、高产物浓度的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。本发明的制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法是以选择性羰基还原酶产生菌为 出发菌株，以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物进行制备，该方法以下步骤(1) 选择以下的选择性羰基还原酶产生菌菌株作为出发菌株粪产碱杆菌 (j〗cah^e"es /aecah's)AS 1. 1799 ，博伊丁假丝酵母(C朋必a^ 6a 'o^w7) AS 2. 2159、AS 2. 2160或AS 2. 2162 ，或赭色掷孢酵母(6^0roZ7020j777ces幼7/z o/H'co or) AS 2. 2110、 AS 2.2111、 AS 2.2113、 AS 2.2114、 AS 2.2115、 AS 2.2116、 AS 2.2117、 AS 2.2118、 AS 2.2119、 AS 2.2120、 AS2. 2121、或AS 2.2122;(2) 湿菌体的培养培养基组成以g/L计为蛋白胨10 30，葡萄糖10 30，酵 母膏5 20， pH5.5 7.5，温度20 4(TC，将步骤(l)所述菌株培养1 5天，发酵液过 滤获得湿菌体作为酶源；(3) 配制反应体系以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物，用0. 1 M、 pH5.5 pH7.5 的磷酸盐缓冲液配制成单一水相反应体系，底物浓度为lg/L 50g/L;或者用有机溶剂 与pH6.5的磷酸盐缓冲液配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物，底物浓度lg/L 50g/L;或者用大孔树脂与pH5. 5 pH7. 5的磷酸盐缓冲液配制成水/树脂两相体系，再 加入底物，底物浓度lg/L 50g/L;(4) 酶转化反应在反应体系中加入(2)所述湿菌体，于20 5(TC进行酶反应，反 应时间为1 48小时；(5) 转化液后处理转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂 用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，得到无色油状液 体(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。在上述方法中，其中博伊丁假丝酵母(^/7力Wa力o^/Z/7i力AS 2.2159的转化效果 较优,作为实例中进一步研究出发菌株。在上述方法的步骤(4)催化反应中在反应体系中加入的湿菌体量为10 60g/g底物。在上述方法的酶转化反应过程中可以补充添加底物，使其浓度为1 50g/L。在上述酶转化反应过程中，可以添加葡萄糖作为辅助底物，其浓度为10 100g/L。 并且在转化反应过程中，对所得的转化液进行手性气相色谱分析(GC)测定，检测反应 过程，确定反应完成时间。在上述步骤(3)中加入的大孔树脂是用来吸附底物、产物，以抑制底物、产物对菌 体的毒性。树脂与底物的质量比为0.6 6: 1，大孔树脂为DA201、 Hz816、 Hz803、 AB-8、 D4006、 HPD300、 HPD100A、薩-II、 X-5等大孔吸附树脂,D201GF、 D392、 D315、 D290、 D280、 D293大孔阴离子树脂，HD-2、 D61、 DOOl、 HD-1、 D001-CC 、 D113大孔阳离子树 脂，所述大孔树脂的孔径为100 180A。上述树脂均为市售，如上海华东理工大学华震 科技开发公司、南开大学化工厂等产品。在上述步骤(3)中配制水/有机溶剂两相体系时，用有机溶剂与pH5. 5 pH7. 5的磷 酸盐缓冲液，按体积比0.1: 1 1: 0.1配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度 1 g/L 50g/L，所用的有机溶剂为邻苯二甲酸二辛酯，或邻苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁 酯、乙酸正戊酯、环己烷、正己垸、正庚烷、正辛烷、异辛烷、癸烷、壬烷、辛醇、正 丁醇或异丁醇等，均为市售化学纯产品。在进行上述步骤(5)时，对产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯提取的具体操作为转 化反应结束后，将反应液离心(8,000 gX20 min， 4°C)，上清液用等体积的乙酸乙酯 进行萃取，例如萃取三次，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并乙酸乙酯萃取液和洗脱液， 再向其中加入1% 5% (w/v)的无水硫酸钠，搅匀后静置过夜，干燥除去残余的水份。必要时进行脱色处理。将有机相用滤纸过滤，收集有机相。4(TC水浴旋转蒸发回收溶剂， 得到无色油状液体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。取(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS 进行定性分析，样品与标准品(Sigma Co.)质谱图对照，确定为同一物质。另外，在上述方法中，也可以将底物直接加入到含有湿菌体培养发酵液中进行酶转 化反应。因此，本发明还提供了以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物生物催化制备(R)-2-羟基-4-丁基丁酸乙酯的进一步方法，该方法包括以下步骤(1) 选择以下的选择性羰基还原酶产生菌菌株作为出发菌株粪产碱杆菌 "7cah'ge/ es/aecah^)AS 1. 1799 ，博伊丁假丝酵母(6k7&^ 6w'A'"/力AS 2. 2159、AS 2. 2160或AS 2. 2162 ，或赭色掷孢酵母(5^aro力a o/B7ces幼7/z o/L 'co7or) AS 2. 2110、 AS 2.2111、 AS 2.2113、 AS 2.2114、 AS 2.2115、 AS 2.2116、 AS 2.2117、 AS 2.2118、 AS 2.2119、 AS 2.2120、 AS2. 2121、或AS 2.2122;(2) 湿菌体的培养培养基组成以g/L计为蛋白胨10 30,葡萄糖10 30，酵 母膏5 20， pH5.5 7.5，温度20 40。C，将步骤(l)所述菌株培养1 5天，得到含湿 菌体的发酵液；(3) 在上述湿菌体培养发酵液中加入l 50g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯作为底 物；于20 50。C进行酶反应，反应时间为1 48小时；(4) 转化液后处理转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂 用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，得到无色油状液 体(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。分析方法产物(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映异构体过量值e.)测定采用手性气相色谱 法。手性色谱柱CP-Chirasil Dex CB 25 mXO. 25 mmXO. 25 u m;色谱条件为10°C 保留2 min，以2tVmin升温至14(TC保留2 min;进样量O. 5 u L;柱流速2. 0 mL/min; 载气H2流速30 raL/min，燃烧气仏流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，尾吹1^流速25 mL/min;进样口 27(TC,检测器27(TC，分流比50: 1。本发明的有益效果本发明筛选获得了高对映体选择性的博伊丁假丝酵母(Ca/7力'AZ^Ww7)等，在单一水相或者两相体系中催化不对称还2-羰基-4-苯基丁酸乙酯生成的产物(R) -2-羟基 -4-苯基丁酸乙酯对映体过量值达到98%e.e以上；同时，供给能量物质，添加高浓度 底物，可以获得高对映体值、高反应摩尔转化率、高产物浓度，更主要的是在整个反应 过程中不需要添加辅酶。本发明微生物转化法相对于传统的化学不对称合成法、常用的面包酵母氧化还原方 法或用添加辅酶NADH/NAD+的酶催化不对称还原方法具有以下优点①生成的(R)-2-羟 基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值高，达到98Xe.e以上；②生物催化剂为微生物菌体， 可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉；③在反应体系中添加树脂或者有机溶剂，供 给能量物质葡萄糖等，添加高浓度底物，可以获得高光学纯度、高反应转化率、高产物 浓度；④在整个反应过程中不需要添加辅酶；⑤反应条件温和，环境友好。生物材料样品说明本发明所用的粪产碱杆菌"7cah'g朋es /aec37is) AS 1. 1799 ，博伊丁假丝酵母 (Ca"力Va力w'A'加7) AS 2. 2159、 AS 2. 2160、 AS 2. 2162 ，赭色掷孢酵母(5^oro6W咖rces sa7迈頻W。r) AS 2. 2110、 AS 2. 2111、 AS 2. 2113、 AS 2. 2114、 AS 2. 2115、 AS 2. 2116、 AS 2.2117、 AS 2.2118、 AS 2.2119、 AS 2.2120、 AS2.212K AS 2. 2122等，均购自中 国微生物普通菌种保藏管理中心(CGMCC)。
具体实施方式
以下是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在单一水相体系或两相体系中，以 2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物，微生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的实施 例。但本发明并不限于所列出的几个实例。实施例l选取博伊丁假丝酵母(C朋o^/a AS 2.2159作为催化菌株斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼月旨2g， pH6.0， 121。C灭菌15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， pH6.5，装液量为250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的摇床，28。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将1.5g上述菌体转入5 mL含葡萄糖 (5%)的相同的磷酸钾缓冲液中，同时加入5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于3(TC， 180 rpm下反应。反应22小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸 乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱 手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为98. 7%与摩尔转化率80.1%。实施例2选取博伊丁假丝酵母(Ca/7(/y(/a 6ojVj'/j/力AS 2, 2160作为催化菌株斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121。C灭菌 15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L， pH6.0，装液量为 250 mL三角瓶装液50 raL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8, 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0. 1 M， pH 6.7)清洗两次，将1.2克上述菌体转入5 mL含葡萄 糖(6%)的相同的磷酸钾缓冲液中，同时加入8g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于28'C, 180 rprn下反应。反应40小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸 乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入1% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱 手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为95. 9%与摩尔转化率80%。实施例3选取赭色掷孢酵母(Spo/"oZ o7o迈yces幼7历o加'co7or)AS 2. 2121作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 12FC灭菌15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， p朋.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28r培养48小时，作为种子或发酵酶液。得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.0)清洗两次，将1.5g上述菌体转入5 mL含葡萄糖(7%)的相同的磷酸钾缓冲液中，同时加入7g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于19。C， 180 rpm下反应。反应48小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸 乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱 手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为85. 4%与摩尔转化率72.1%。实施例4选取赭色掷孢酵母(&oro力a oyz^ces 5a7/z o/w'co7or) AS 2. 2120作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 12FC灭菌15分钟，灭菌后冷却接种，2『C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， p朋.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，2『C培养48小时，作为种子或发酵酶液。得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将1.0g上述菌体转入5 mL含葡萄糖 (5%)的相同的磷酸缓冲液中，同时加入8g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于2(TC， 180 rpm下反应。反应5小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸乙酯萃 取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱手性柱 分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为85. 5%与摩尔转化率73. 5%。实施例5选取粪产碱杆菌(^cahje/7as /aeca7&)AS 1. 1799作为催化菌株斜面培养培养基为100 mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2 g， pH 6.0， 121。C灭菌15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L， p服.5，装液量为250 mL三角瓶装液50 mL， 120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8, 000转/分钟)收集菌体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将1.8g上述菌体转入5 mL含葡萄糖 (5%)的相同的磷酸缓冲液中，同时加入11g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于40'C，180 rpni下反应。反应36小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入3% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为84. 9%与摩尔转化率76. 2%。
选取博伊丁假丝酵母(C3/MWaAS 2.2159作为催化菌株
斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121'C灭菌 15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， pH6.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28-C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1> 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述2.0 g湿菌体加于100 mL 三角瓶装含葡萄糖(7%)的O.l M， pH 6. 5磷酸钾缓冲液10 raL，起始底物2-羰基-4-苯 基丁酸乙酯量为20g/L，反应体系中添加X-5树脂0.6g，于30。C， 180rpm下进行转化反 应。12小时后结束反应，滤纸过滤，收集树脂。将收集的树脂用10ml的乙酸乙酯萃取， 于3(TC， 180 rpm摇床振荡4h以上。离心去除树脂后，收集乙酸乙酯，加入2% (W/V) 无水NaS0^干燥、过滤后进行气相色谱分析(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为 98. 5%与摩尔转化率为82. 7%。
实施例7
选取博伊丁假丝酵母(Ca"c^/a 6az'c&n7) AS 2. 2159作为催化菌株
斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g),琼脂2g， pH6.0， 121'C灭菌 15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， PH6.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8, 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述1.7 g湿菌体加于100 mL 三角瓶装含5%葡萄糖的0.1 M， pH 6. 5磷酸钾-邻苯二甲酸二丁酯(体积比0.1: 1)缓 冲液5mL，起始底物2-羰基-4-苯基丁酸乙酯量为8g/L，于3(TC， 180rpm下进行转化 反应。32小时后结束反应。离心出去菌体和水相，得到邻苯二甲酸二丁酯、未反应完的少量底物、R构型和S构型产物的混合物，再加入2% (W/V)无水NaS04干燥、过滤后进 行气相色谱分析(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为98.88%与摩尔转化率为 83. 7%。
实施例8
选取赭色掷孢酵母(5DOi"oZ^7o迈yces sa7历o/ ico7or)AS 2. 2114作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121匸灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， pH6.5，装液量为 250 raL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述2.2 g湿菌体加于100 mL 三角瓶装含5%葡萄糖的0. 1 M， pH6.5磷酸钾-乙酸正丁酯(体积比h 0.1)缓冲液5mL， 起始底物2-羰基-4-苯基丁酸乙酯量为25g/L，于35'C， 180 rpm下进行转化反应。10小 时后结束反应。离心出去菌体和水相，得到乙酸正丁酯、未反应完的少量底物、R构型和 S构型产物的混合物，再加入2% (W/V)无水NaS04干燥、过滤后进行气相色谱分析(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为85. 2%与摩尔转化率为78. 3%。
实施例9
选取赭色掷孢酵母(5^o/Y Zw7o/^ces sa7历o/w'co7or)AS 2.2119作为催化菌株 斜面培养培养基为100 mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 12rC灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28"C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， pH6.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 120'C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8, 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述2. 5g湿菌体加于100 raL三 角瓶装含5%葡萄糖的0. 1 M， pH6.5磷酸钾-乙酸正丁酯(体积比0.9: 0.1)缓冲液5mL， 起始底物2 羰基-4-苯基丁酸乙酯量为40g/L，于27'C， 180 rpm下进行转化反应。6小 时后结束反应。离心出去菌体和水相，得到乙酸正丁酯、未反应完的少量底物、R构型和S构型产物的混合物，再加入2% (W/V)无水NaS04干燥、过滤后进行气相色谱分析((0-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为77. 2%与摩尔转化率为75%。
实施例10
选取赭色掷孢酵母(&oro6o7o/^ces幼ho加'co7or)AS 2.2118作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g, pH6.0， 12rC灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28i:培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， p朋.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8, 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将1.4g上述菌体转入5 raL含葡萄糖 (7%)的相同的磷酸钾缓冲液中，同时加入15g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于25。C， 180 rpm下反应。反应24小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸 乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱 手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为90 %与摩尔转化率72%。
实施例11
选取博伊丁假丝酵母(Ca/ 力Va 6w'A'"i力AS 2. 2162作为催化菌株
斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121'C灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28。C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L, PH6.5，装液量为
250 mL三角瓶装液50 mL, 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的
摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集
菌体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将2.3g上述菌体转入5 mL含葡
萄糖(5%)的相同的磷酸钾缓冲液中，同时加入45g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于
20°C， 180rpm下反应。反应28小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积
的乙酸乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，
气相色谱手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为88.5 %与摩尔转
化率81%。实施例12
选取博伊丁假丝酵母(Ca/ AVa Z^ Vi刀力')AS 2.2160作为催化菌株
斜面培养培养基为100 mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121'C灭菌 15分钟，灭菌后冷却接种，28。C培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， pH6.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 120。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述1. 3g湿菌体加于100 mL三 角瓶装含葡萄糖(5%)的O.l M， pH 6.5磷酸钾缓冲液10 mL，起始底物2-羰基-4-苯基 丁酸乙酯量为13g/L，反应体系中添加HD-1树脂0.8g，于30。C， 180 rpm下进行转化反 应。36小时后结束反应，滤纸过滤，收集树脂。将收集的树脂用10ml的乙酸乙酯萃取， 于30。C， 180 rpm摇床振荡6h以上。离心去除树脂后，收集乙酸乙酯，加入2% (W/V) 无水NaS04干燥、过滤后进行气相色谱分析(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为 89. 3%与摩尔转化率为84. 6%。
实施例13
选取博伊丁假丝酵母(C朋&'o^ ZwjVj'/jj7) AS 2.2159作为催化菌株
斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g),琼月旨2g， PH6.0， 121'C灭菌 15分钟，灭菌后冷却接种，26'C培养3天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L, p恥.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL, 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，28。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 6g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，称取上述2.4 g湿菌体加于100 mL 三角瓶装含葡萄糖(5%)的O.l M， pH 6.5磷酸钾缓冲液10 mL，起始底物2-羰基-4-苯 基丁酸乙酯量为38g/L，反应体系中添加D392树脂0. 7g，于25°C， 180 rpm下进行转化 反应。20小时后结束反应，滤纸过滤，收集树脂。将收集的树脂用10ml的乙酸乙酯萃取， 于30。C， 180 rpm摇床振荡5h以上。离心去除树脂后，收集乙酸乙酯，加入2% (W/V)无水NaS04干燥、过滤后进行气相色谱分析(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为 95. 5%与摩尔转化率为82. 9%。
实施例14
选取赭色掷孢酵母(5^oro6o7o7^ces sa7历om'co7or) AS 2. 2111作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 12rC灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28-C培养5天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， p朋.5，装液量为 250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的 摇床，25。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50raL发酵酶液中含湿菌体量为2. 0g，离心10分钟(8， 000转/分钟)收集菌 体，用磷酸钾缓冲液(0.1 M， pH 6.5)清洗两次，将0.8g上述菌体转入5 mL含葡萄糖 (5%)的相同的磷酸缓冲液中，同时加入8g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，于3(TC， 180 rpm下反应。反应48小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸乙酯 萃取，分离水相和有机相。向有机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱手性 柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值为94. 1%与摩尔转化率78. 5%。
实施例15
选取赭色掷孢酵母(5^oroZw7o/i7/cas ^7/z o加'coJor)AS 2.2121作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 12rC灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28'C培养5天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， p朋.5，装液量为
250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的
摇床，25。C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，将lg/L的底物加入50ml的菌体发酵
液中，加葡萄糖至葡萄糖浓度为5%，于30'C， 180rpm下反应。反应42小时结束，离
心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机
相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基丁
酸乙酯对映体过量值为81. 7%与摩尔转化率77. 5%。
实施例16选取赭色掷孢酵母(5^oro力W咖，7C^ 5V37忍朋众o7or)AS 2.2116作为催化菌株 斜面培养培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g， pH6.0， 121。C灭菌
15分钟，灭菌后冷却接种，28"C培养5天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， PH6.5，装液量为
250 mL三角瓶装液50 mL， 12(TC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180 rpm的
摇床，25'C培养48小时，作为种子或发酵酶液。
得到每50mL发酵酶液中含湿菌体量为1. 5g，将1. 2g/L的底物加入50ml的菌体发
酵液中，加葡萄糖至葡萄糖浓度为5%，于25'C， 180 rpm下反应。反应24小时结束， 离心除去菌体，得上清液。上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，分离水相和有机相。向有
机相加入2% (W/V)无水NaS04干燥过夜，气相色谱手性柱分析产物(R)-2-羟基-4-苯基
丁酸乙酯对映体过量值为83. 4%与摩尔转化率78. 6%。
权利要求
1.一种以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，该方法包括步骤(1)选择以下的选择性羰基还原酶产生菌菌株作为出发菌株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)AS 1.1799，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii) AS2.2159、AS 2.2160或AS 2.2162，或赭色掷孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)AS 2.2110、AS 2.2111、AS 2.2113、AS 2.2114、AS 2.2115、AS 2.2116、AS 2.2117、AS 2.2118、AS 2.2119、AS 2.2120、AS2.2121、或AS2.2122；(2)湿菌体的培养培养基组成以g/L计为蛋白胨10～30，葡萄糖10～30，酵母膏5～20，pH5.5～7.5，温度20～40℃，将步骤(1)所述菌株培养1～5天，发酵液过滤获得湿菌体作为酶源；(3)配制反应体系以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物，用0.1M、pH5.5～pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成单一水相反应体系，底物浓度为1g/L～50g/L；或者用有机溶剂与pH6.5的磷酸盐缓冲液配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物，底物浓度1g/L～50g/L；或者用大孔树脂与pH5.5～pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成水/树脂两相体系，再加入底物，底物浓度1g/L～50g/L；(4)酶转化反应在反应体系中加入步骤(2)所述湿菌体，于20～50℃进行酶反应，反应时间为1～48小时；(5)转化液后处理转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是所述菌株为博伊丁假丝酵母菌 (C朋t/jVa力oz'A'/7j7) AS 2. 2159。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(4)中加入的湿菌体量为10 60g/g底物。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶转化反应，在反应过程中添 加葡萄糖作为辅助底物，其浓度为10~100g/L。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶转化反应，在反应过程中补 充添加底物至l 50g/L。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的大孔树脂为DA201、 Hz816、 Hz803、 AB-8、 D4006、 HPD300、 HPD100A、 NAK-II、 X-5、 Hz004、 Hz202、 Hz016 或Hz802大孔吸附树脂，或D201GF、 D392、 D315、 D290、 D280或D293大孔阴离 子树脂，或HD-2、 D61、 DOOl、 HD-1、 D001-CC或D113大孔阳离子树脂，所述 大孔树脂的孔径为100 180 A，树脂与底物的质量比为0.6 6: 1。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征是水/有机溶剂两相体系的配制方法 是用有机溶剂与pH5. 5 PH7. 5的磷酸盐缓冲液，按体积比0.1: 1 1: 0.1配制 成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度1 g/L 50g/L,所用的有机溶剂为邻 苯二甲酸二辛酯，或邻苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、乙酸正戊酯、环己烷、正 己烷、正庚烷、正辛垸、异辛垸、癸垸、壬垸、辛醇、正丁醇或异丁醇。
8. —种以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯 基丁酸乙酯的方法，该方法步骤-(1) 选择以下的选择性羰基还原酶产生菌菌株作为出发菌株粪产碱杆菌 (A ca7j^e/7es/aecaiis) AS 1.1799 ，博伊丁假丝酵母(C朋&Va力o V/"/i) AS、2.2159、 AS 2.2160或AS 2.2162 ，或赭色掷孢酵母(分oro/)oAM^ces saJ历o"j.co or) AS 2.2110、 AS 2.2111、 AS 2.2113、 AS 2.2114、 AS 2.2115、 AS 2.2116、 AS 2.2117、 AS 2.2118、 AS 2.2119、 AS 2.2120、 AS2. 2121、或AS 2.2122;(2) 湿菌体的培养培养基组成以g/L计为蛋白胨10 30，葡萄糖10 30，酵母膏5 20， pH5.5~7.5，温度20 4(TC,将步骤(l)所述菌株培养1~5 天，得到含湿菌体的发酵液；(3) 在上述湿菌体培养发酵液中加入l 50g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯 作为底物；于20 5(TC进行酶反应，反应时间为1 48小时；(4) 转化液后处理转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸 附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，得 到无色油状液体(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
全文摘要
一种生物催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物催化不对称还原制备医药手性中间体技术领域。本发明利用筛选的高对映体选择性羰基还原酶的产生菌博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等，在优化条件下发酵产酶，湿菌体在单一水相体系、水/有机两相体系或水/树脂两相体系中，以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为底物，并添加葡萄糖，制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。当底物2-羰基-4-苯基丁酸乙酯浓度为1～50g/L，转化1h～48h，得到产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的对映体过量值达84.9～98.88％，摩尔转化率达72.0～84.6％，在整个反应过程中不需要添加辅酶。
文档编号C12P7/62GK101314784SQ20071007857
公开日2008年12月3日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者昊 刘, 孙志浩, 林文清, 勋 胡, 谭小兵 申请人:重庆博腾科技有限公司