专利名称：一种细胞负压培养装置及其方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞负压培养方法及其装置，特别涉及细胞大规模快速体外扩增培
养方法及其装置。
背景技术：
组织工程技术的兴起和发展为组织移植和再造提供了最理想的方法，近年来，组织 工程的研究已成为当前研究的热点之一。但直到现在还没有任何一种组织工程产品能完 全满足临床病人的需求，其中原因之一是未找到合适的种子细胞。通过对发育生物学研 究发现，干细胞和体细胞在组织形成和再生过程中起重要作用，但很多细胞在体内含量 相对较低，取材困难，并且一般是慢周期细胞，即使像干细胞一样具有无限的增殖潜能， 但很难快速扩增达到组织工程的需要。因此，体外如何大量快速扩增干细胞成为最近 干细胞研究的热点。现在应用旋转生物反应器以及微载体技术进行组织工程种子细胞大 规模培养逐渐受到科研人员的重视，进展较快。方法及装置的不足之处在于(l)虽然
能扩增细胞，但是细胞增殖的速度还是很有限；(2)现在组织工程很难控制细胞培养的 气液界面，(3)不便于细胞形态观察。
最近的研究显示，负压系统能对许多不同类型的细胞增殖起作用，表皮细胞、成纤维 细胞以及内皮细胞等[Baldwin C， Topical Negative Pressure Stimulates Endothelial Migration and Proliferation: A Suggested Mechanism for Improved Integration of Integra. Ann Plast Surg. 2009， 62(1) :92-6]。因此，设计一种体外细胞负压培养系统，， 不仅可以用于细胞体外大量快速扩增，为组织工程提供种子细胞，同时也可以为阐明负 压条件下细胞的生物学行为及其相应机理的研究提供技术手段和体外模型。
发明内容
本发明的目的就是针对上述的不足，提供一种细胞负压培养的方法和装置，解决现 有装置无法准确模拟体内状况、无法大量快速扩增细胞的问题，同时使得细胞生长环境 的负压可以按照要求调节，为临床使用提供相应的技术参数。
本发明提出的细胞负压培养的装置主要包括储液槽、高压气瓶、第一、二、三、
4四导管、蠕动泵、玻璃管、细胞培养槽、膜盒压力仪、流量阀、微型真空泵、微孔滤膜 片和过滤器等。储液槽同时连接有第二、第三导管、玻璃管，第二导管另一端通过蠕动 泵连有细胞培养槽，将细胞培养槽中的多余液体泵回储液槽，另外第一导管和高压气瓶 通过导管连接，将细胞生长需要的气体通入储液槽。第二导管连有阀门，将储液槽中的 培养基输入到下方的细胞培养槽中，储液槽上方接带过滤器的导管控制储液槽的气液界 面。细胞培养槽上方接带阀门、膜盒压力仪的导管通过微型真空泵来控制细胞培养槽中 的真空度。
利用上述装置，可采用以下方法对细胞进行负压培养
(1) 接种和粘附
先在细胞培养槽中注入超过微孔滤膜片的培养基，将细胞接种在细胞培养用微孔滤 膜片上，等细胞贴壁后将其细胞面朝上放入细胞培养用微孔滤膜片支撑架上；也可以等 细胞贴壁后将其细胞面朝下放入细胞培养用微孔滤膜片支撑架上，然后接种另外的细胞 进行细胞共培养；
(2) 液面的调节
分别通过调节安装在储液槽下端的蠕动泵和第二流量阀来调节进出细胞培养槽中 的液面，控制液面高度在细胞培养板上下，是否是气液界面；
(3) 气压的调节
根据第二膜盒压力仪显示的细胞培养槽内气压，通过微型真空泵来控制细胞培养槽 中的真空度；
(4) 细胞的观察
通过显微镜观察细胞的形态和生长趋势； .
(5) 取样并检测
按照实验设计实时取样检测细胞的物理、化学、生物学行为。
本发明具有如下优点
1、 本发明提出的装置能在体外大量扩增细胞，并且细胞增殖的速度比较快，同时 通过次装置还可以与其他的促进细胞的药物同时使用；、
2、 通过本发明的方法培养的细胞植入能很快适应在体微环境；
3、 通过控制细胞培养的气液界面，可以培养表皮与结缔组织的组织工程产品；
4、 便于细胞形态实时观察。
图l是本装置的结构示意图。
图2是血管内皮细胞负压与对照条件下增殖图
具体实施例方式
参见图1，本发明提出的细胞负压培养的装置包括高压气瓶1、第一导管2、第一流量阀3、第一膜盒压力仪4、第二导管5、蠕动泵6、储液槽7、第三导管8、第一 0. 22um过滤器9、玻璃管IO、第二流量阀ll、细胞培养用微孔滤膜片12、细胞培,槽13、第二膜盒压力仪14、第一 0. 22mn过滤器15、第四导管16、微型真空泵17和细胞培养用微孔滤膜片支撑架18。储液槽7、细胞培养槽13均为圆柱形，第一、二、三、四导管均为硅胶管。
储液槽7同时连接有第二和第三导管5、 8，第二导管5另一端通过蠕动泵6连到细胞培养槽13，将细胞培养槽13中的多余培养基泵回储液槽7，玻璃管10上装有第二流量阀11，通过第二流量阀11控制细胞培养槽13中的液面的高低。储液槽7上方接出第三导管8，并在管上装有第一0.22um过滤器9，以控制储液槽7气液界面的高度。高压气瓶l中的装有5y。C02的混合气体，通过第一导管2接入储液槽7，并且在导管上装第一流量阀3来控制气体的流量，装第一膜盒压力仪4来显示气体的相关参数。细胞培养用微孔滤膜片12放置在细胞培养槽13内的细胞培养用微孔滤膜片支撑架18上，可以使用不同孔径大小的细胞培养用微孔滤膜片12，并且使活动的细胞可以生长在细胞培养用微孔滤膜片上。细胞培养槽13是使用聚碳酸酯制作的透明槽，并且制作成楔形，可以实时观察细胞形态。微型真空泵17通过第四导管16与细胞培养槽13相连，中间通过第二膜盒压力仪14控制细胞培养槽内气压、第一 0. 22um过滤器过滤空气。
细胞培养实施例1:(1)接种和粘附 '
先在细胞培养槽(13)中注入超过微孔滤膜片(12)的培养基，将血管内皮细胞接种在细胞培养用微孔滤膜片(12)上，等细胞贴壁后将其细胞面朝上放入细胞培养用微孔滤膜片支撑架(18)上；
(2)液面的调节
分别通过调节安装在储液槽(7)下端的蠕动泵(6)和第二流量阀(11)来调节进出细胞培养槽(13)中的液面，控制液面高度平行细胞培养板上层，使培养的细胞处于气液界面上；
(3) 气压的调节
根据第二膜盒压力仪(14)显示的细胞培养槽内气压5kPa,4h/次，通过微型真空泵(17)来控制细胞培养槽中的真空度，同时以正常培养的细胞作为对照；
(4) 细胞的观察通过显微镜观察细胞的形态和生长趋势
(5) 取样并检测
每天定时取样对细胞进行计数，分析细胞在负压条件下的增殖特性，同时与未处理组进行比较，制作生长曲线
参见图2，结果显示
与培养在微孔滤膜片上，但没有进行负压加载的细胞比较，负压培养的细胞增殖速度明显加快。
细胞培养实施例2:
(1) 接种和粘附
先在细胞培养槽(13)中注入超过微孔滤膜片(12)的培养基，将皮肤成纤维细胞接种在细胞培养用微孔滤膜片(12)上，等12h细胞贴壁后将其细胞面朝下放入细胞培养用微孔滤膜片支撑架(18)上，然后接种皮肤表皮细胞进行细胞共培养；
(2) 液面的调节
分别通过调节安装在储液槽(7)下端的蠕动泵(6)和第二流量阀(11)来.调节进出细胞培养槽(13)中的液面，控制液面高度平行皮肤表皮细胞培养板上层，使培养的细胞处于气液界面上；(3)气压的调节
根据第二膜盒压力仪(14)显示的细胞培养槽内气压5kPa,4h/次，通过微型真空泵(17)来控制细胞培养槽中的真空度，同时以正常培养的细胞作为对照；(4)细胞的观察通过显微镜观察细胞的形态和生长趋势；(5)取样并检测
每天定时取样对细胞进行计数，分析细胞在负压条件下的增殖特性，同时与未处理组进行比较，制作生长曲线；
结果显示
与培养在微孔滤膜片上共培养，但没有进行负压加载的细胞比较，表皮细胞和成纤维细胞增殖都明显加快，并且细胞紧密粘附，有利于构建组织工程皮肤。
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权利要求
1、一种细胞负压培养装置，其特征在于，所述装置包括高压气瓶(1)、储液槽(7)、细胞培养用微孔滤膜片(12)、细胞培养槽(13)、以及连接在它们之间的导管和玻璃管、安装在这些管路上的流量阀、泵和膜盒压力仪；所述高压气瓶(1)通过第一导管(2)连接第二导管(5)，并在第一导管(2)上安装第一流量阀(3)来控制气体的流量，还安装第一膜盒压力仪(4)来显示气体的相关参数；所述第二导管(5)两端分别连接储液槽(7)和细胞培养槽(13)，并在靠储液槽(7)一端安装蠕动泵(6)，将细胞培养槽(13)中的多余培养基泵回储液槽(7)；所述储液槽(7)的位置高于细胞培养槽(13)，在储液槽(7)底部与细胞培养槽(13)之间连接玻璃管(10)，在储液槽(7)的上部接出第三导管(8)，并在玻璃管(10)和第三导管(8)上分别安装有第二流量阀(11)和第一过滤器(9)，第二流量阀(11)控制细胞培养槽(13)中的液面的高低，第一过滤器(9)控制储液槽(7)气液界面的高度；所述细胞培养用微孔滤膜片(12)放置在细胞培养槽(13)内，从细胞培养槽(13)接出第四导管(16)，在第四导管(16)上安装有第二膜盒压力仪(14)显示细胞培养槽内气压，安装第二过滤器(15)过滤空气，并安装有微型真空泵(17)来控制细胞培养槽中的真空度。
2、 根据权利要求1所述的细胞负压培养装置，其特征在于，所述细胞培养槽(13) 内设置有细胞培养用微孔滤膜片支撑架(18)，细胞培养用微孔滤膜片(12)放置于其上。
3、 根据权利要求1所述的细胞负压培养装置，其特征在于，所述细胞培养槽(13) 是使用聚碳酸酯制作的透明槽，并且制作成楔形，在保证培养基体积的条件下，降低细胞与培养槽底的高度。
4、 根据权利要求1所述的细胞负压培养装置，其特征在于，所述第一和第二过滤 器都是0.22um过滤器。
5、 根据权利要求1所述的细胞负压培养装置，其特征在于，所述储液槽(7)、细 胞培养槽(13)均为圆柱形，第一、二、三、四导管均为硅胶管。
6、 使用权利要求1-5之任一项细胞负压培养其装置进行细胞培养的方法，按以下 步骤进行(1)接种和粘附先在细胞培养槽(13)中注入超过微孔滤膜片(12)的培养基，将细胞接种在细胞 培养用微孔滤膜片(12)上，等细胞贴壁后将其细胞面朝上放入细胞培养用微孔滤膜片 支撑架(18)上； '(2) 液面的调节分别通过调节安装在储液槽(7)下端的蠕动泵(6)和第二流量阀(11)来调节进出细胞培养槽(13)中的液面，控制液面高度在细胞培养板上下，是否是气液界面；(3) 气压的调节根据第二膜盒压力仪(14)显示的细胞培养槽内气压，通过微型真空泵(17)来控 制细胞培养槽中的真空度；(4) 细胞的观察 通过显微镜观察细胞的形态和生长趋势； .(5) 取样并检测按照实验设计实时取样检测细胞的物理、化学、生物学行为。 .
7、使用权利要求1-5之任一项细胞负压培养其装置进行细胞培养的方法，按以下 歩骤进行(1) 接种和粘附先在细胞培养槽(13)中注入超过微孔滤膜片(12)的培养基，将细胞接种在细胞 培养用微孔滤膜片(12)上，等细胞贴壁后将其细胞面朝下放入细胞培养用微孔滤膜片 支撑架(18)上，然后接种另外的细胞进行细胞共培养；(2) 液面的调节分别通过调节安装在储液槽(7)下端的蠕动泵(6)和第二流量阔(11)來调节进 出细胞培养槽(13)中的液面，控制液面高度在细胞培养板上下，是否是气液界面；(3) 气压的调节 根据第二膜盒压力仪(14)显示的细胞培养槽内气压，通过微型真空泵(17)来控制细胞培养槽中的真空度；(4) 细胞的观察 通过显微镜观察细胞的形态和生长趋势；(5) 取样并检测 按照实验设计实时取样检测细胞的物理、化学、生物学行为。
全文摘要
本发明涉及一种体外细胞负压培养的装置，解决现有细胞增殖缓慢，难以满足组织工程细胞需求和给细胞培养提供理想的气液界面的装置的问题。细胞负压培养装置包括储液槽、硅胶管、玻璃管、膜盒压力仪、流量阀、高压气瓶、微型真空泵、蠕动泵、微孔滤膜片，0.22um过滤器，其中储液槽通过玻璃管与细胞培养槽连接，细胞培养槽通过装有膜盒压力仪和流量阀的玻璃管连接，通过微型真空泵使其形成负压。细胞通过装有蠕动泵的硅胶管与储液槽连接，高压气瓶通过硅胶管于储液槽连接，既可以保证细胞生长需要的二氧化碳环境又可以形成负压。本发明不仅能准确的模拟体内细胞的压强环境，为体内实验提供更好的支持，而且可以体外大量扩增需要的细胞类型。
文档编号C12M3/00GK101665766SQ200910190989
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者张琳琳, 杜广刚, 王贵学, 罗向东, 邱菊辉, 莉 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院