专利名称：包含双呋脒腙的促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，以及由多能干细胞制备心肌细胞的方法。
背景技术：
对于再生医学的实现，诱导多能干细胞分化成所需细胞的技术是必不可少的。此夕卜，同样预期分化自多能干细胞的细胞对于体外药物筛选研究和药物安全评估是有价值 的。尤其，非常需要的是开发用于再生医学和心脏病药物评估的诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，原因在于目前在日本心脏病是第二位的死因。存在多种药物，其诱导严重的副作用，包括心脏停搏和心律不齐，因此导致增加的对提供同质心肌细胞(其可用于心脏毒性研究)的需要。目前，已有报道，通过将人ES细胞和小鼠饲养细胞、END2细胞共培养来诱导人ES细胞分化为心肌细胞(非专利文献I)。然而，此方法的分化效率不令人满意并且它难以获得纯的人心肌细胞，因为所得的人心肌细胞通常被小鼠END2细胞污染。还有报道，可以通过由ES细胞制备胚胎体并向胚胎体中加入若干细胞因子(成纤维生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF) ,Dickkopf-I (DKKl)、活化素A)来诱导心肌细胞分化(非专利文献2和3)。然而，此方法需要大量的细胞因子并且成本太高，同时其分化效率不足。现有技术文献非专利文献专矛1J 文献 I Mummery, C.，等，Differentiation of human embryonic stemcells to cardiomyocytes role of coculture with visceral endoderm-like cells(A胚胎细胞分化成心肌细胞与内脏内胚层样细胞共培养的作用).Circulation (循环)· 107(21)，2733-40 (2003)。非专利文献 2 :Yang, L.,等，Human cardiovascular progenitor cells developfrom a KDR+embryonic-stem-cell-derived population (人心血管先祖细胞发育自 KDR+胚胎干细胞源的种群)· Nature (自然).453 (7194)，524-8 (2008)。非专利文献3 :Leschik, J.,等，Cardiac commitment of primate embryonic stemcells (灵长类胚胎干细胞的心脏定向)· Nat Protoc. 3 (9)，1381-7 (2008)。这些文献通过弓丨用结合于此。发明概述本发明要解决的问题本发明的目的是提供以高效率低成本制备同质心肌细胞的方法。解决问题的方式本发明的发明人对9，600种库化合物的促进猴ES细胞分化成心肌细胞的活性进行了检验。结果，发现与常规的心肌细胞分化促进剂相比，双呋脒腙(其是一种已知作为抗生素和生长促进剂用于家畜的低分子量化合物)高效促进心肌细胞分化。因而，本发明已经得以实现。本发明提供促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，其包含双呋脒腙(nitrovin)。此外，本发明提供诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，该方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
此外，本发明提供由多能干细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。本发明的效果根据本发明，已经可能诱导多能干细胞分化成心肌细胞而不使用饲养细胞以及之后获得纯的心肌细胞。此外，根据本发明，已经可能高效低成本地诱导心肌细胞分化以制备心肌细胞。本发明尤其适用于评估QT延长，这对于以高通量形式评估药物安全、大规模制备用于心脏病药物评估的同质且成熟的人心肌细胞以及生产用于移植以治疗心脏疾病的心肌细胞是重要的。附图
简述图I.对促进心肌细胞分化的物质的筛选策略。图2.筛选系统及对双呋脒腙的检测。图3-1.在猴ES细胞中施用双呋脒腙(终浓度I μ M，5 μ M，20 μ M)后GFP的表达。图3-2.在猴ES细胞中双呋脒腙诱导的GFP荧光强度和心肌细胞搏动集群(beating colonies)数目的增加。横轴表示双呋脒腙的浓度。在左图中，纵轴表示施用双呋脒腙后的GFP荧光强度，其表示为与对照(二甲亚砜，DMS0)相比的百分比(100%)。在右图中，纵轴表示搏动集群的数目/孔。图4-1.施用双呋脒腙后人ES细胞中的GFP表达(终浓度5 μ M)。图4-2.人ES细胞中双呋脒腙(终浓度5 μ Μ)诱导的GFP荧光强度的增加。纵轴表示施用双呋脒腙后GFP的荧光强度，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100% )。图5-1.在猴ES细胞中在施用双呋脒腙(终浓度5 μ Μ)、细胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKKI 和活化素 A)(终浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、150ng/ml 和 3ng/ml)或双呋脒腙(终浓度5 μ M)与上述细胞因子的组合后GFP的表达。图5-2.在猴ES细胞中由双呋脒腙诱导的GFP荧光强度和心肌细胞搏动集群数目的增加。左图中，纵轴表示在施用双呋脒腙和/或细胞因子后GFP的荧光强度，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100%)。右图中，纵轴表示搏动集群的数目/孔。图5-3.在猴ES细胞中，由双呋脒腙诱导的GFP和肌钙蛋白T表达的增加。纵轴表示施用双呋脒腙和/或细胞因子后的表达水平，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100% )。实施方案描述本发明提供促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，其包含双呋脒腙。双呋脒腙是具有下式(C14H12N6O6)的低分子量化合物[式I]
权利要求
1.一种促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，其包含双呋脒腙。
2.根据权利要求I的组合物，其中所述多能干细胞是哺乳动物细胞。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述多能干细胞是灵长类细胞。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述多能干细胞是人细胞。
5.诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，所述方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
6.由多能干细胞制备心肌细胞的方法，所述方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
7.通过权利要求6的方法制备的心肌细胞。
全文摘要
本发明提供用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的包含双呋脒腙的组合物，通过使用双呋脒腙诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法和通过使用双呋脒腙制备心肌细胞的方法。
文档编号C12N5/071GK102648274SQ201080055309
公开日2012年8月22日 申请日期2010年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者上杉志成, 中辻宪夫, 南一成, 尾辻智美 申请人:国立大学法人京都大学