专利名称：Sult1a1基因扩增用引物对,含有其的sult1a1基因扩增用试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于扩增SULT1A1基因的引物对、含有其的SULT1A1基因扩增用试剂及其用途。
背景技术：
人组织硫酸转移酶(磺基转移酶，SULT)担当如下的功能将通过肝细胞色素P450 等导入氢基的脂溶性底物的代谢物进行0-硫酸酯化，从而增加水溶性而排泄。SULT是被归类为超家族的酶类，存在SULT1、SULT2等基因家族。有报道指出属于SULTl家族的、催化酚性底物的硫酸结合反应的酶(PSULT)，由于基因多态性而活性不同。而且，由于该PSULT 分子种类催化致癌物芳胺的代谢活化反应，因此从疾病易感性出发，其基因多态性的解析受到重视。具体的，在PSULT中，在人的肝脏和血小板等组织中以对硝基酚作为代表性底物的分子种类(ST1A3)基于编码它的SULT1A1基因的多态性而活性不同，已知活性的性状与结肠癌、偏头痛的易感性等相关。在该SULT1A1基因的多态性之中，SULT1A1*2和SULT1A1*3 与以上疾病易感性的关联性显著，因此，研究SULT1A1基因的SULT1AN2和SULT1A1*3，在预测患者的疾病易感性，预防、治疗疾病方面是非常重要的。予以说明，SULT1AN2是氨基酸213位的精氨酸(Arg)变为组氨酸(His)的突变，SULT1A1*3是氨基酸223位的甲硫氨酸(Met)变为缬氨酸(Val)的突变。另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、 个体间的药效的差异等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出⑴利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目的DNA 的相当于检测对象序列的区域，再对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)利用PCR扩增试样的目的DNA的相当于检测对象序列的区域，通过随上述检测对象序列有无目的突变而切断作用不同的限制酶，将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析；(3)使用目的突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增判断突变的ASP-PCR法等。但是，这些方法例如必须进行由试样提取出的DNA的精制、电泳、限制酶处理等， 因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的试样。另外，上述⑶的ASP-PCR法还存在特异性低的问题。由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目的核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行分析的方法。这种方法由于通过Tm分析或上述双链的融解曲线的分析来进行，因此称作融解曲线分析。其为如下的方法。即，首先使用与含有检测目的点突变的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目的单链DNA与上述探针的杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)，测定检测试样的目的单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目的DNA存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为错配、即目的DNA不存在点突变。而且，通过该方法还可以实现基因解析的自动化。但是，对于利用此类Tm分析的检测方法而言，存在PCR中必须特异且高效地扩增含有检测目的位点的区域的问题。特别是，SULT存在许多同工酶，由于编码这些同工酶的序列都非常相似，在PCR中，有可能连SULT1A1以外的同工酶的编码基因也一起扩增。此外， 像这样连其它同工酶的编码基因也被扩增的情况，也成为例如SULT1A1基因的特定多态性 (SULT1AN2或SULT1A1*3)的解析(非专利文献1、非专利文献2)中解析结果可信度降低的原因。因此，像这样由于解析1个试样也要伴随极大的劳动力，因此存在在解析大量试样中不实用的问题。非专利文献1 =PMID :9854023 Biochem J. 1999 Jan 1 ；337 (Ptl) :45 9。非专利文献2 :PMID :9566748 Chem Biol Interact. 1998 Feb20 ； 109 (1 3) 237 48。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供通过基因扩增法能够特异且高效地扩增SULT1A1基因的目的区域的引物对。为了实现上述目的，本发明的引物对，其特征在于，其是用于通过基因扩增法扩增 SULT1A1基因的引物对，包含下述引物对(1)。引物对(1)包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第3418位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第M 33个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端(Rl)下述寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸与序列号1的碱基序列中的、以第3607位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着 3’方向到第20 四个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第3607 位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第3576位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基向着 3’方向到第M 33个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第3576 位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶(T)作为3’末端。此外，本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，其是用于通过基因扩增法扩增SULT1A1基因的试剂，含有上述本发明的SULT1A1基因扩增用引物。本发明的扩增产物的制备方法，其特征在于，其是通过基因扩增法制备SULT1A1 基因的扩增产物的方法，含有下述(I)步骤。(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的SULT1A1基因扩增用引物对，在反应液中扩增上述SULT1A1基因的步骤本发明的多态性解析方法，其特征在于，其是解析SULT1A1基因中的检测对象位点的多态性的方法，包含下述(i) (iv)步骤。(i)通过本发明的扩增产物的制备方法，在反应液中扩增SULT1A1基因中含有检测对象位点的区域的步骤(ii)准备含有上述⑴步骤中的扩增产物、和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的步骤(iii)改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动，确定上述检测对象位点的多态性的步骤根据本发明的引物对，能够在反应液中特异且高效地扩增SULT1A1基因中的、同时含有发生检测目的多态性(SULT1AN2和SULT1A1*3)的位点的区域。因此，与上述传统方法不同，能够降低时间和成本。此外。由于这样能够扩增出同时含有SULT1AN2和 SULT1A1*3的检测对象位点的区域，再通过使用至少与含有一个上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针，能够使用上述反应液直接进行Tm分析，将上述多态性分别进行分型。另外，由于能在一个反应液中扩增含有2个检测对象位点的目的区域、对多态性进行分型，因此还能够实现操作的自动化。而且，当使用本发明的引物对时，例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，还可以省略预处理、更为迅速且简单地进行扩增反应。 另外，当使用本发明的引物对时，能以优于以往的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增反应。因此，通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制备方法和多态性解析方法，能迅速且简单的解析SULT1A1基因的2个多态性，在医疗领域是非常有效的。
图1是表示本发明的实施例1中的Tm分析结果的图。图2是表示本发明的上述实施例1中的Tm分析结果的图。图3是表示本发明的上述实施例1中的Tm分析结果的图。图4是表示本发明的实施例2中的Tm分析结果的图。
具体实施例方式〈SULT1A1基因扩增用引物对〉本发明的SULT1A1基因扩增用引物对，如前所述，其特征在于，含有上述引物对 (1)。根据该引物对(1)，如前所述，能够在1个反应液中特异地扩增同时含有发生多态性 SULT1A1*2的检测对象位点和发生多态性SULT1A1*3的检测对象位点的目的区域。因此，使用本发明的引物对扩增该目的区域，能比传统方法高效地解析SULT1A1基因的多态性。此外，以下有时将正向引物称为F引物，将反向引物称为R引物。如前所述，上述引物(1)是包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述 (Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第3418位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第M 33个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端(Rl)下述寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸与序列号1的碱基序列中的、以第3607位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着 3’方向到第20 四个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第3607 位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端和与序列号1的碱基序列中的、以第3576位的腺嘌呤碱基㈧作为第1位碱基向着 3’方向到第M 33个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第3576 位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶(T)作为3’末端。序列号1所示的碱基序列是人的磺基转移酶1 (phenol-preferring phenol sulfotransferase 1 =STPl)的全长DNA序列，例如，是NCBI登录号No. U71086所登录的序列。此外，序列号1示意的是第3514位碱基是A、第3543位碱基为G这样的多态性序列。上述引物(1)是用于扩增序列号1中的、含有第3419位 3606位的区域或第3419 位 3575位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内第3514位碱基(序列号1 中第3514位的碱基)、以及第3543位碱基(序列号1中第3543位碱基)存在影响SULT1A1 功能的点突变(3514G、3514A和3543G、3543A)。前者的多态性是上述的SULT1A1*2，第3514 位的碱基是G的话，SULT1A1基因被翻译成蛋白质时，第213位的氨基酸为精氨酸(Arg)，第 3514位的碱基是A的话，则显示出第213位的氨基酸变为组氨酸(His)的多态性。在本发明中，纯合子的情况下该位点的多态性可以用3514G/G、3514A/A表示，杂合子的情况下该位点的多态性可以用3514G/A表示。后者的多态性是上述的SULT1A1*3，第3543位的碱基是A的话，SULT1A1基因被翻译成蛋白质时，第223位的氨基酸为甲硫氨酸(Met)，第3543 位的碱基是G的话，则显示出第223位的氨基酸变为缬氨酸(Val)的多态性。在本发明中， 纯合子的情况下该位点的多态性可以用3M3G/G、3M3A/A表示，杂合子的情况下该位点的多态性可以用3M3G/A表示。此外，以下该引物对(1)也称为“SULT1A1用引物”。在本发明中，引物(1)的Fl引物和Rl引物，只要用于决定DNA聚合酶的扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。如此通过固定各引物的3’末端的碱基，就能充分防止引物对(1)与其它类似的同工酶的基因(例如，SULT1A2、SULTlA3, SULTlA4基因等)
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？口口。如此，由于只需要固定Fl引物和Rl引物的3’末端的碱基，对各引物的长度本身并没有特殊的限定，可以适当调整为一般的长度。作为引物长度的一个例子，例如为13 50mer的范围，优选14 45mer，更优选15 40mer。作为具体例子，上述Fl引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第3418位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第M 33个碱基(优选25 32个碱基，更优选沈 31个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸。上述Rl引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第3607位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着3’方向到第20 四个碱基(优选21 沈个碱基、 更优选22 25个碱基)的区域互补的至少1个寡核苷酸，或者与序列号1的碱基序列中的、以第3576位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基向着3’方向到第M 33个碱基(优选第25 30个碱基、更优选第沈 28个碱基)的区域互补的至少1个寡核苷酸。此外， 由于Fl引物和Rl引物的3’末端被固定，从引物延伸出的区域例如是上述序列号1中第 3419位 3606位的区域、或者第3419位 3575位的区域，所获得的扩增产物的总长度随使用的引物的长度而变化。此外，Rl引物可以是与序列号1表示的碱基序列不完全互补的寡核苷酸，Fl引物可以是与上述碱基序列的互补链不完全互补的寡核苷酸。也就是说，各引物中除3’末端的碱基以外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1个 5个碱基不同。以下，示意出Fl引物和Rl引物的具体例子，但是本发明不限定于此。此外，对这些Fl引物和Rl引物的组合也没有任何限定，其中，特别优选包含含有序列号7的寡核苷酸的F1’引物、以及含有序列号18或序列号39的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。下表中的“Tm(°C)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的TmCC )，是通过 MELTCALC软件(http://www. meltcalc. com)将参数设为寡核苷酸浓度0. 2 μ M，钠当量(Na eq. )50mM计算出来的值。上述Tm值可以通过例如目前已知的MELTCALC软件(http://WWW. meltcalc. com)等算出来，此外，还可以通过邻接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。[表 1]
权利要求
1.一种用于检测SULT1A1基因的多态性的探针，其特征在于， 所述探针由下述(1)的寡核苷酸构成，(1)下述寡核苷酸中的至少1个，与序列号1中的、以第3518位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第15 19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3’末端，以及，与序列号1中的、以第3517位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第14 19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3’末端。
2.根据权利要求1所述的探针，所述(1)的寡核苷酸是序列号22 沈和序列号43 48中的任意一个寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的探针，所述(1)的寡核苷酸为序列号23的寡核苷酸和序列号 46的寡核苷酸中的至少一个。
4.根据权利要求1所述的探针，所述探针为荧光标记探针。
5.一种试剂，其特征在于，其为用于检测SULT1A1基因的多态性的试剂，所述试剂含有权利要求1所述的探针。
6.根据权利要求5所述的试剂，其还含有由下述O)的寡核苷酸构成的探针，(2)与序列号1中的、以第3556位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第15 20个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3，末端。
7.根据权利要求6所述的试剂，所述O)的寡核苷酸为序列号27 32中的任意一个寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的试剂，所述O)的寡核苷酸为序列号30的寡核苷酸。
9.根据权利要求5所述的试剂，所述探针为荧光标记探针。
10.根据权利要求5所述的试剂，其还含有下述引物对(1)， 引物对⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对，(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第3418位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第M 33个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端；(Rl)下述寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸与序列号1的碱基序列中的、以第3607位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着3’ 方向到第20 四个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第3607位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端， 禾口与序列号1的碱基序列中的、以第3576位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基向着3’ 方向到第M 33个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第3576位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶(T)作为3’末端。
11.一种多态性解析方法，其特征在于，其为解析SULT1A1基因中的检测对象为点的多态性的方法，含有下述⑴ (iv)步骤(1)以试样中的核酸为模板，在反应液中扩增SULT1A1基因中含有序列号1的3514位和3543位中的至少一个检测对象位点的区域的步骤，( )准备含有所述⑴步骤中的扩增产物、和权利要求5所述的试剂的反应液的步骤，(iii)改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物和所述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤，(iv)根据伴随温度变化的所述信号值的变动，确定所述检测对象位点的多态性的步马聚ο
12.根据权利要求11所述的多态性解析方法，在所述(i)步骤中，在扩增反应之前，向所述反应液中添加权利要求5所述的试剂。
13.根据权利要求11所述的多态性解析方法，所述试样为生物体试样。
14.根据权利要求13所述的多态性解析方法，所述生物体试样为全血。
15.根据权利要求12所述的多态性解析方法，所述试剂还含有由下述O)的寡核苷酸构成的探针，(2)与序列号1中的、以第3556位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第15 20个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3，末端。
16.根据权利要求12所述的多态性解析方法，在所述(i)步骤中，使用下述引物对(1) 在反应液中扩增所述SULT1A1基因，引物对⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对，(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第3418位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着5’方向到第M 33个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端；(Rl)下述寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸与序列号1的碱基序列中的、以第3607位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基向着3’ 方向到第20 四个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第3607位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端，禾口与序列号1的碱基序列中的、以第3576位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基向着3’ 方向到第M 33个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第3576位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶(T)作为3’末端。
全文摘要
本发明提供引物对，其为用于通过基因扩增法扩增SULT1A1基因中的、包含SULT1A1*2和SULT1A1*3的检测目的位点的区域的引物对，其能够特异地扩增上述区域。使用一对引物对，其包含含有序列号7的碱基序列的正向引物、和含有序列号18的碱基序列的反向引物。通过使用该引物对，能够特异且高效地扩增SULT1A1基因中的、同时包含2种多态性(SULT1A1*2和SULT1A1*3)发生位点的区域。
文档编号C12Q1/68GK102199662SQ20111006369
公开日2011年9月28日 申请日期2007年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者细见敏也 申请人:爱科来株式会社