专利名称：一种2-酮基-l-古龙酸的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。
背景技术：
目前国内生产古龙酸多采用二步发酵法，二步发酵法通常采用混合菌系进行发酵，这种混合菌系最为常用的两种菌一种是氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌)，另一种是巨大芽孢杆菌(俗称大菌)，其中小菌为产酸菌，胞内分泌L-山梨糖脱氢酶可以将山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸，但是单独培养生长缓慢，产酸能力低；大菌不能产酸，但是它可以作为小菌的伴生菌，在发酵中起辅助作用，促进小菌的生长和产酸。研究证实，大菌胞内液和胞外液菌均可以促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期。目前国内古龙酸生产过程中，多采用流加碳酸钠来控制调节pH，该反应的产物是可溶的古龙酸钠，在反应后期，随着反应的进行，古龙酸钠的浓度逐渐升高，容易对发酵反应形成产物抑制，从而降低反应产率。为了解决上述问题，本发明提出在古龙酸生产过程中采用一种新的pH调节剂， 一方面可以避免高浓度产物抑制产酸，利于发酵反应进程，使发酵终点产酸浓度能够提高 8-10%，另一方面可降低工艺难度，提高设备利用率。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。根据上述生产方法的不足，本发明采用氢氧化钙替代碳酸钠调节发酵过程中的pH 值，由于其反应产物为难溶的古龙酸钙，降低了高浓度产物对反应速度和进程的抑制，利于产酸。本发明的技术方案为在发酵过程中流加氢氧化钙控制PH值；所述氢氧化钙可选择液体或固体，优选质量浓度为20-50%的悬浮液；更优选质量浓度为30%的悬浮液。为进一步提高生产效率，本发明人进行了大量的研究，优化了发酵过程参数，要求在发酵过程中将PH值控制为6. 7-7. 0 ；控制初始山梨糖浓度为20-25mg/ml，并在发酵过程中流加山梨糖，使发酵液中的山梨糖浓度控制在20-2aiig/ml。优选地，所述pH值为6. 7-6. 8。其中，流加山梨糖可采用山梨糖糖液，其浓度可采用各种常用的浓度，优选的，所述山梨糖糖液的浓度为200mg/L。另外，还通过控制反应温度控制反应进程，优选的，控制反应起始温度为^rc，中后期(即M-38小时之后)将温度升至30-31°C。采用上述参数，发酵周期为44-48小时。发酵过程可采用生产2-酮基-L-古龙酸常用的发酵液，如采用下述成分的营养液作为发酵液玉米浆110g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，尿素10g/L。有益效果本发明在制备2-酮基-L-古龙酸的过程中，采用流加氢氧化钙来替代碳酸钠控制PH值，产物为难溶的古龙酸钙，降低了高浓度产物抑制，利于产酸。此发明方法在生产中成功运用于大生产。发酵终点产酸浓度提高8-10%，达到105-110mg/ml，糖酸转化率提高2-4 %，达到94-96 % ；此外，流加氢氧化钙对后提取有利，提高了设备利用率，大大降低了能耗和物耗。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如无特别指明，本发明采用的发酵液为下述成分的营养液玉米浆110g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，尿素10g/L，并添加适量的山梨糖(浓度控制在20 25mg/ ml)构成；采用本领域常用的氧化葡萄糖酸杆菌(小菌)(购自菌种保藏中心，保藏号 CGMCC1. 110)和巨大芽孢杆菌(大菌)(购自菌种保藏中心，保藏号CMCC(B)6310 制备菌液。菌液制备过程冻存管--摇瓶活化24h-大小菌分别分离(280C培养小菌2天，大菌2-3天)一选菌落饱满，边缘整齐，偏大的小菌单菌落挑一满环涂布试管培养一天)一搭上大菌，选菌落饱满，边缘整齐，大小适中的大菌单菌落在已搭过小菌的试管上培养2 天)-用无菌水将试管上的菌苔洗下接种子瓶，240r/min,培养Mh)。对照例140m3发酵罐中初始装液量为30m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为 30% (大菌和小菌混合种子液)，当残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-2aiig/ml ；同时，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH 在 6. 7-6. 8。 发酵过程中，起始温度为四V，30小时，温度升至30°C，36小时时，温度升至31 °C。发酵周期为46小时，发酵终体积为100m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为90mg/ ml，摩尔转化率为91%。实施例1140m3发酵罐中初始装液量为30m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为 30% (大菌和小菌混合种子液)，当残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-2aiig/ml ；同时，发酵过程中流加氢氧化钙控制pH 在 6. 7-6. 8。发酵过程中，起始温度为四V，30小时，温度升至30°C，36小时时，温度升至31 °C。发酵周期为44小时，发酵终体积为100m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为 105. lmg/ml，摩尔转化率为94. 5%0实施例2140m3发酵罐中初始装液量为35m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为 30% (大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流山梨糖糖液，糖液的浓度为 200mg/L，流加过程控制山梨糖含量为20-2aiig/ml ；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在 6. 8-7. O0发酵过程中，起始温度为^°C，24小时温度升至30°C，30小时温度升至31 °C。
发酵周期为46小时，发酵终体积为106m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为106mg/ ml，摩尔转化率为94. 79%。实施例3140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖浓度为23mg/ml，接种量为30% (大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为 200mg/L，流加过程控制山梨糖糖含量为20-2aiig/ml ；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在 6. 7-6. 8。发酵起始温度为，30小时温度升至30°C，36小时温度升至31 °C，发酵周期为 48小时，发酵终体积为108m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为107mg/ml，摩尔转化率为95. 4%。实施例4140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖糖浓度为25mg/ml，接种量为 30% (大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-2aiig/ml ；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在 6. 7-7. 0 ；30小时后控制在6. 8-7. 0。发酵过程中，起始温度为，30小时温度升至30°C，36小时温度升至31 °C，发酵周期为48小时，发酵终体积为110m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为110mg/ml，摩尔转化率为96. 01%。实施例5140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖糖浓度为23mg/ml，接种量为 30 % (大菌和小菌混合种子液)，残糖降至22mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-2aiig/ml ；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在 6. 7-7. 0，32小时后控制在6. 8-7. O。发酵过程中，起始温度为，33小时温度升至30°C，38小时温度升至31°C，发酵周期为49小时，发酵终体积为110m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为106mg/ml，摩尔转化率为95. 46%。
权利要求
1.一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征在于，发酵过程中流加氢氧化钙控制PH值。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中，控制初始山梨糖浓度为 20-25mg/ml。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中流加山梨糖，发酵液中山梨糖浓度控制在20-2ang/ml。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中控制起始温度为 29°C, 24-38小时后将温度升至30-31°C。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为6.7-7. 0。
6.如权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为6.7-6. 8。
全文摘要
本发明涉及一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。本发明采用氢氧化钙替代碳酸钠来控制发酵过程中的pH值，一方面可以避免高浓度产物抑制产酸，利于发酵反应进程，使发酵终点古龙酸的含量达105-110mg/ml，糖酸转化率为94-96％，提高产酸浓度8-10％；另一方面可降低工艺难度，操作简单，后提取容易，提高了设备利用率。
文档编号C12R1/01GK102242178SQ201110169689
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者李海燕, 李维理, 李荣杰, 穆晓玲, 符秀迪 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司