专利名称：一种高产可德胶菌株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种高产可德胶菌株及其制备方法。
背景技术：
多糖是由十个以上单糖通过苷键连接而成的聚糖，多糖资源丰富、来源广泛，如可从陆地植物、海藻中提取，也可通过微生物发酵进行生物合成。通常具有生物活性和凝胶化特性是一些多糖大分子具有的两个最主要的性质。生物活性是指多糖在参与生命过程中表现出的免疫调节、抗肿瘤活性、抗AIDS和抗氧化作用等。多糖的凝胶化是指多糖溶液或溶胶在一定条件下形成凝胶的性质。目前，在食品、医药、化妆品、化工等工业领域，多糖已被广泛用做胶凝剂、增稠剂、药物载体、乳化剂、稳定剂、膜材料等。多糖种类繁多，A-i， 3-d-glucan葡聚糖是多糖家族中最重要的成员之一。1964年，日本的原田笃也(Tokuya Harada)教授从土壤中分离了得到了粪产碱菌变种 10 CXAlcaligenes faecal is var. myxogenes 10 C3)，这种微生物能在 10% 的乙二醇为碳源的培养基中生成一种粘性物，里面含有琥珀酰化多糖。1966年，原田教授在制备琥珀酰多糖的过程中，发现在培养基中添加的葡萄糖完全被消耗，并且生成大量白色沉淀。他们认为是有机体发生了变异而产生了这种不溶解的物质，通过进一步研究，分离出了所谓变异物种，发现它含有一种仅仅由A-l，3-d-葡聚糖苷键组成的聚合物，当其水悬浮液加热会形成一种弹性凝胶。根据其高温凝固(Curdle) 的特性，将其命名为Curdlan(可德胶)。这也是世界上首次发现的唯一完全由A-l，3-d-葡聚糖苷键组成，并能在加热情况下形成凝胶的多糖大分子。1968年起，日本武田(Takeda)化学股份有限公司(大阪，日本)开始与原田教授合作开展可德胶在食品工业上的应用研究工作。分别就可德胶本身是否致癌，有无动物体突变反应等问题进行了安全性测试，证实了可德胶为安全无毒性的物质。在Takeda公司的要求下，美国的IRDC (国际研发协作组织)也对可德胶进行了进一步的安全测试，发现它安全无毒，并且具有提高人体免疫力，抗肿瘤的生物活性。美国FDA (食品药物管理局)已经推荐将其应用于食品行业，成为继黄原胶、结冷胶之后，第三个可直接作为食品添加剂用于食品配料中的多糖。1989年起，日本武田公司以Pureglucan TM为可德胶的商品名，在美国、日本、韩国、台湾等地广泛生产使用。我对于可德胶的研究起步较晚，但目前开展较广泛的研究，并主要集中在发酵、分离、生产以及多糖合成的氮信号调控机制等方面。目前商用的可德胶， 其结构中99%以上是由d-葡萄糖通过A-1，3葡萄糖苷键构成的葡聚糖。在自然状态下， 可德胶是以圆环状的小颗粒形式存在的，与淀粉的结构相类似。干燥的可德胶是一种无嗅、 无味的白色或灰白色粉末状固体。从溶解性看，长链的可德胶不溶于水、醇类及许多有机溶剂，但可溶解于碱液、甲酸、二甲基亚砜、镉乙二胺(cadoxen)溶液及25%碘化钾溶液等通常易破坏氢键的物质的溶液中，相反低聚合度(短链)的可德胶是水可溶的。研究发现大多数活性葡聚糖多具有1，3糖苷键主链。目前国内外对产可德胶合成菌株的基础性研究较多，且主要集中于菌株筛选、发酵及可德胶(curdlan)提取、分离和纯化，而应用方面研究较少，目前可德胶生产存在产量低成本高的缺点，本发明正是基于此，通过物理与化学的诱变方法，结合特异性的筛选方法，获得高产可德胶的发酵菌株来解决目前可德胶大规模生产中产量低成本高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产可德胶菌株及其制备方法。本发明利用产可德胶ATCC31749的通过紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和 UV+NTG复合处理等突变方法进行改良，并结合苯酚蓝染色来进行筛选，从而获得可德胶高产菌株。本发明的高产可德胶菌株于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No. 5103，分类命名为产热凝胶农杆菌 {Agrobac teriumsp.)
上述的高产可德胶菌株的制备方法如下
利用UV (紫外线照射)、NTG (亚硝基胍)，UV + NTG复合诱变处理筛选突变农杆菌菌株(ATCC31749)的菌体细胞和原生质体进行同步诱变，在以蔗糖为主要碳源的培养基中，通过与可德胶有专一性结合苯胺蓝染色，筛选出菌落大(生长速度快)、染色深(可德胶高产)， 发酵周期时间缩短，遗传性能稳定，连续翻接5代后发酵性能维持良好的优良菌株。具体步骤如下
1)将广泛用于可德胶生产的出发菌株(Agrobacteriumsp. ATCC31749)接种到LB培养基中培养1天，稀释涂LB平板，于30°C培养3天；
2)菌悬液的制备在生长良好的LB平板上，加入5mL的生理盐水，洗下菌体移入装有15 mL生理盐水的250 mL三角瓶中，震荡使菌体充分分散，用无菌脱脂棉过滤至装有30 mL生理盐水的无菌三角瓶中，用显微镜观测并通过血球计数板计数并调整菌体细胞浓度为 IO6个/mL备用；
3)UV+ NTG复合诱变处理将处于对数期的菌悬液10 mL放入离心管中，加入NTG至 10 30 yg/mL，混勻，静止30 min，然后吸取0. 5毫升加入到平底平板中，在预热好的紫外灯下照射60 120 s ；
4)将上述照射液进行离心(4000rpm, 10 min)，去上清，取沉淀；
5)用灭菌的10%甘油悬浮沉淀后，冰上放置10min, 4000 rpm 10 min离心离心去上清，取沉淀；
6重复上述第5步骤两次后获得的沉淀，重悬于10%的甘油中，稀释涂布到高糖产胶培养指示平板上，30°C恒温培养箱中黑暗培养，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺蓝，培养基组成(g/L)蔗糖 100，KH2PO4 5. 0，MgSO4 · 7H20 0. 5，柠檬酸 5，琼脂糖 15，1% (ν/ν) 无机盐浓缩液(称取I^eCl3, MnCl2, NaCl, CaCl2各1 g，加入去离子水溶解并定容至1L，调 pH=5. 5飞.0)培养3天；
7)初筛在高糖指示平板上挑选菌落较大，粘稠，变蓝较深的菌株来进行复筛；
8)复筛将经初筛选得的菌株先接到LB平板上，摇瓶发酵以确定发酵产可德胶较高的诱变菌株；
经过初筛和复筛，获得一株发酵周期短，遗传性能稳定高产可德胶菌株(CGMCC No. 5103)。本发明的高产可德胶菌株蔗糖转化率为72.6%，可德胶胶产量为34. 5 g/L。该菌株能利用蔗糖为唯一碳源高产可德胶，且遗传性能稳定，发酵周期短。以其它产可德胶菌株相比，利用该菌株生产可德胶具有生产成本低，可德胶产量高，生产周期短及性能稳定等特点ο
图1是诱变菌株的菌落形态。保藏登记号为CGMCC No. 5103的高产可德胶菌株于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施例方式1)将出发菌株(Agrobacterium sp. ATCC31749)接种到种子培养基中培养1天， 种子培养基为LB培养基，培养液稀释涂平板，于30°C培养3天；
2)菌悬液的制备在生长良好的LB纯种斜面培养基中，加入5mL的生理盐水，洗下菌体移入到装有15 mL生理盐水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，震荡使菌体充分分散，用无菌脱脂棉过滤至装有30 mL生理盐水的无菌三角瓶中，用血球计数板计数并调整浓度为IO6个 /mL备用；
3)UV+ NTG复合诱变处理将处于对数期的菌悬液10 mL放入离心管中，加入NTG 10 μ L/mL，混勻，静止30 min，然后吸取5毫升加入到平底平板中，在预热好的紫外灯下照射 6(Tl20s ；
4)将上述照射液进行离心4000rpmUO min，去上清，取沉淀；
5)用灭菌的10%甘油悬浮沉淀后，冰上放置10min,4000 rpmUO min离心去上清，取
沉淀；
6)重复上述第5步骤两次后获得的沉淀，重悬于10%的甘油中，稀释涂布到高糖产胶培养指示平板上，30°C恒温培养箱中黑暗培养，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺蓝，培养 3天；
7)初筛在高糖指示平板上挑选菌落较大，粘稠，变蓝较深的菌株来进行复筛；
8)复筛将经初筛选得的菌株先接到LB平板上，摇瓶发酵以确定发酵产可德胶较高的诱变菌株；
经过初筛和复筛，获得一株发酵周期短，遗传性能稳定高产可德胶菌株(CGMCC No. 5103)。连续翻接5代后发酵性能维持良好的高产可德胶农杆菌。菌体形态观察将筛选到的菌株稀释涂平板，在30°C的恒温培养箱中培养定时进行观察，在高糖指示培养平板上生长快，产可德胶胶多，呈凸起状，菌落光滑圆形。在平板上培养开始时菌体生长，菌落呈白色。当可德胶产出时，菌落颜色加深。菌体的革兰氏染色观察取少量菌与载玻片上的一滴水混合涂片，用常规法进行加热固定，用草酸铵结晶紫染色1分钟后水洗，然后滴加路哥氏碘液染2分钟，水洗并吸干后用95%的乙醇进行脱色，再水洗吸干，最后用0. 5%的番红染色液染色25 s，用水冲洗，干燥后进行镜检。结果显示该试验菌株呈革兰氏阴性。
权利要求
1.一种高产可德胶菌株，其特征在于该菌株保藏登记号为CGMCC No. 5103，分类命名Agrobacterium sp. 0
2.权利要求1所述的高产可德胶菌株的制备方法，其特征在于利用紫外线照射+亚硝基胍复合诱变处理筛选突变农杆菌菌株ATCC31749的菌体细胞和原生质体进行诱变，在以蔗糖为主要碳源的培养基中，通过与可德胶有专一性结合苯胺蓝染色，筛选出菌落大、生长速度快、染色深、发酵周期时间缩短、遗传性能稳定，连续翻接5代后发酵性能维持良好的优良菌株；具体步骤如下1)将出发菌株Agrobacteriumsp. ATCC31749接种到种子培养基中培养1天，种子培养基为LB培养基，培养液稀释涂平板，于30°C培养3天；2)菌悬液的制备在生长良好的LB纯种斜面培养基中，加入生理盐水，洗下菌体移入到装有生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，震荡使菌体充分分散，过滤至装有生理盐水的无菌三角瓶中，调整浓度为IO6个/mL备用；3)紫外线照射+亚硝基胍复合诱变处理将处于对数期的菌悬液放入离心管中，加入亚硝基胍到终浓度为10 30 yg/mL，混勻，静止30 min，然后吸取5毫升加入到平底平板中，在预热好的紫外灯下照射60 120 s ；4)将上述照射液进行离心4000rpmUO min，去上清，取沉淀；5)用灭菌的10%甘油悬浮沉淀后，冰上放置10min,4000 rpmUO min离心去上清，取沉淀；6)重复上述第5步骤两次后获得的沉淀，重悬于10%的甘油中，稀释涂布到高糖产胶培养指示平板上，30°C恒温培养箱中黑暗培养，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺蓝，培养 3天；7)初筛在高糖指示平板上挑选菌落较大，粘稠，变蓝较深的菌株来进行复筛；8)复筛将经初筛选得的菌株先接到LB平板上，摇瓶发酵以确定发酵产可德胶较高的诱变菌株；经过初筛和复筛，获得一株发酵周期短，遗传性能稳定高产可德胶菌株CGMCC No. 5103。
3.根据权利要求2所述的高产可德胶菌株的制备方法，其特征在于4)步骤中的发酵产胶培养基的组成为g/L 蔗糖100，KH2PO4 5. 0，MgSO4 · 7Η20 0. 5，柠檬酸5，1% ν/ν无机盐浓缩液。
4.根据权利要求3所述的高产可德胶菌株的制备方法，其特征在于所述的无机盐浓缩液为用！^eCl3,MnCl2,NaCl,CaCl2各1 g，加入去离子水溶解并定容至1 L，调ρΗ=5· 5 6. O。
全文摘要
本发明是一种高产可德胶菌株及其制备方法。该菌株保藏登记号为CGMCC No.5103，分类命名为农杆菌Agrobacteriumsp.。本发明的高产可德胶菌株蔗糖转化率为72.6%，可德胶胶产量为34.5g/L。该菌株能利用蔗糖为唯一碳源高产可德胶，且遗传性能稳定，发酵周期短。以其它产可德胶菌株相比，利用该菌株生产可德胶具有生产成本低，可德胶产量高，生产周期短及性能稳定等特点。
文档编号C12N1/20GK102296045SQ20111027824
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者尚海丽, 李兴义, 杨发祥, 毛自朝 申请人:云南省微生物发酵工程研究中心有限公司