专利名称：基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量rt-pcr检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种rRT-PCR检测技术，具体涉及一种基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。
背景技术：
流感病毒基因组由8条(甲、乙型)或者7条(丙型)负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒广泛分布于自然界，偶能引起局部地区和学校暴发。丙型流感病毒普遍感染健康人群,婴儿出生时由母体带来的抗体,在6个月时基本消失。从I岁起，个体血清阳性百分比逐渐增加，大约在20 30岁达到最高水平。根据日本调查，所有10岁儿童基本上都有丙型流感病毒抗体。丙型流感病毒跟A型流感病毒一样，能引起婴儿和老人流涕、发烧(腋下体温^ 38°C)，出现感冒症状。中国曾于1981年和1982年由郭元吉教授在猪群中分离到2株丙型流感病毒，但中国到目前为止人群中没有丙型流感病毒的监测数据。日本对丙型病毒的监测比较完善，通过RT-PCR检测，人群感染丙型流感病毒的阳性率高达2.5 %，可见丙型流感病毒的感染率并不比甲型和乙型的阳性率低。丙型流感病毒可以通过鸡胚或者细胞分离，但分离率比较低，灵敏度不高。已有的普通RT-PCR检测技术容易引 起环境污染，检测灵敏度低，易导致假阳性结果，不适于临床标本的快速检测和鉴定。另外鉴定病毒还可以通过基因测序的方法，但耗时长，成本高，普通实验室难于完成。因此，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测丙型流感病毒及其变异株。上述现有技术至少存在以下缺点:(I)操作费时、成本高；(2)对实验室的软硬件要求也比较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、应用方便的基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂克服现有技术中常规基因测序的方法，耗时长，成本高且对实验室软硬件要求高的缺陷。本发明解决上述技术问题的技术方案如下:基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种；所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区；所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18 27bp的寡核苷酸片段；其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。本发明的有益效果是:本发明基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，由于包括针对流感病毒HE基因相对保守区域；针对丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区所述丙型流感病毒NS基因和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测丙型流感病毒，操作简单、应用方便。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQID N0.1):5’-YGGAGGAAATTTRTATGC-3’，反向引物(SEQID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3’，探针(SEQID N0.3):5，-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3，；所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQID N0.4 ):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQID N0.5): 5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3’，探针(SEQID N0.6):5，-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3，；丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQID N0.8):5’ -TGGTGAGirGTCGGITTC-3’，探针(SEQID N0.9):5，-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3，；丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQID N0.10):5，-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3，，反向引物(SEQ ID N0.11):5’ -CTCCACGATGATGATACA-3’，探针(SEQID N0.12):5，-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3，。采用本发明进一步的有益效果是:采用上述的四套引物对和探针，在丙型流感病毒变异较小的情况下，4套引物及探针检测均为阳性，如果丙型流感病毒发生较大变异，可能仅出现I套 3套引物及探针阳性，显著提高检测率。本发明提供还提供基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括检测溶液，所述检测溶液包括权利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。本发明提供还提供基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤:(I)利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；(2)反应体系:总体积25ul，取5ul步骤(I)制得的病毒RNA溶液，
12.5ul2 X RT-PCR Buffer, lul25 X RT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒 HE 基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为 20uM, RNase Free H2O 加至 25ul ；(3)步骤(2)反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测:45°C/lOmin，I 个循环，95°C/lOmin, I 个循环，95。/15s, 60° /45s，40 个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果，根据扩增曲线和Ct判定结果。
具体实施例方式结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明的丙型流感病毒rRT-PCR (real-t ime RT-PCR)检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种；所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区；所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18 27bp的寡核苷酸片段；其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列:正向引物(SEQID N0.1):5’-YGGAGGAAATTTRTATGC-3’，反向引物(SEQID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3’，探针(SEQID N0.3):5，-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3，；所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列:正向引物(SEQ ID N0.4 ):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQID N0.5):5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3’，探针(SEQID N0.6):5’-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3’ ；丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列:正向引物(SEQID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQID N0.8):5’ -TGGTGAGirGTCGGITTC-3’，探针(SEQ ID N0.9):5’-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3’ ；丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列:正向引物(SEQID N0.10):5’-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3’，
反向引物(SEQID N0.11):5’-CTCCACGATGATGATACA-3’，探针(SEQID N0.12):5’-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3’。上述探针序列两端的标记FAM、BHQl为荧光素标记。本发明应用上述的丙型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测丙型流感病毒的试剂盒，包括检测溶液，所述检测溶液所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。本发明应用上述的丙型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测丙型流感病毒的方法:首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；再建立r-RT-PCR反应体系:总体积25ul，取5ul步骤(I)制得的病毒RNA 溶液，12.5ul2 X RT-PCR Buffer, lul25 X RT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为20uM, RNase Free H2O加至25ul ；再将步骤(2)反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测:45°C/lOmin，I 个循环，95°C/lOmin, I 个循环，95。/15s, 60° /45s，40 个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果，根据扩增曲线和Ct判定结果。
本发明中的引物和探针的序列(5’ 一 3’ )及检测的靶序列片段如下:
权利要求
1.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，其特征在于， 所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种； 所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区； 所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18 27bp的寡核苷酸片段； 其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。
2.根据权利要求1所述基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，其特征在于， 所述丙型流感病毒基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQ ID N0.1):5’-YGGAGGAAAITTRTATGC-3’，反向引物(SEQ ID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3，，探针(SEQ ID N0.3):5’-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3’ ； 所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为: 正向引物(SEQ ID N0.4):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQ ID N0.5):5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3，，探针(SEQ ID N0.6):5’-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3’ ； 丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQ ID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQ ID N0.8):5’-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3’，探针(SEQ ID N0.9):5’-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3’ ； 丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针为:正向引物(SEQ ID N0.10):5’-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3’，反向引物(SEQ ID N0.11):5’-CTCCACGATGATGATACA-3’，探针(SEQ ID N0.12):5’-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3’。
3.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于，所述检测溶液包括权利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。
4.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤: (1)利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液； (2)反应体系:总体积25ul,取5ul步骤(I)制得的病毒RNA溶液，12.5ul2XRT-PCRBuffer, lul25XRT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为20uM，RNase Free H2O 加至 25ul ； (3)步骤(2)反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测: 45°C/lOmin，I 个循环，95°C/IOmin, I 个循环，95° /15s, 60° /45s，40 个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果`，根据扩增曲线和Ct判定结果。
全文摘要
本发明涉及一种基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR，rRT-PCR)检测试剂，包括对丙型流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和针对丙型流感病毒NS基因相对保守区的4套特异性引物对及探针序列，同时公开了待检测样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析，能快速通过rRT-PCR法检测丙型流感病毒，且在丙型流感病毒变异较小的情况下，4套引物及探针检测均为阳性，如果丙型流感病毒发生较大变异，可能仅出现1套～3套引物及探针阳性，可以有效的为临床诊断、检验检疫等领域的预警机制提供可行的技术支持。
文档编号C12Q1/68GK103103287SQ20121057317
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者蓝雨, 王大燕, 舒跃龙 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所