专利名称：一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取纯化植物脂肪酶的方法，特别是指纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，属生物工程技术领域。
背景技术：
脂肪酶(EC 3.1.1. 3)是一种重要的水解酶类，在食品、药品、化工等行业得到广泛应用。脂肪酶种类很多，其中绝大多数来自于微生物，少数来自于动物，而极少数来自于植物。小麦胚芽脂肪酶是一种存在于小麦中的脂肪酶，由于其热稳定性以及在小麦发芽中的重要性，为大家所关注。一般认为小麦胚芽当中富含多种酶类，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在发芽后所显示的酶活主要是脂肪酶酶活。小麦胚芽脂肪酶的存在对小麦胚芽的保藏是十分不利的，它能短时间内水解油月旨，使其脂肪酸值大幅度升高，引起麦胚酸败变质；同时，微生物生长繁殖快，也会导致麦胚出现结块、霉变和发酵等变质现象。所以，目前对小麦胚芽脂肪酶的研究大多集中在该酶在小麦胚芽中稳定性以及如何快速降低其水解活性，防止麦胚酸化变质。对小麦胚芽脂肪酶用于催化生物反应过程研究相对较少，主要集中在手性拆分和油脂工业方面。据报道，小麦胚芽脂肪酶在立体选择性方面并不符合Kazlauskas规则，呈现为反K氏规则，是现有唯一天然来源的反K氏规则的脂肪酶，这在手性拆分和脂肪酶催化分子机理解析方面具有重要的意义。在油脂催化方面，目前认为，小麦胚芽脂肪酶对短链的甘油三酯具有较好的催化作用。总体而言，相对于其它脂肪酶，小麦胚芽脂肪酶具有来源广泛，可以从小麦加工废弃物麦胚中提取获得，如能利用，将能获得一种质优价廉适合大宗油脂产品加工的脂肪酶。相较微生物来源脂肪酶，小麦胚芽脂肪酶是植物脂肪酶，植物中含有多种色素、杂蛋白和糖类物质等，因此分离纯化特别困难；而小麦胚芽脂肪酶粗酶具有稳定性差和专一性差等缺点，因此如不分离纯化将会限制了小麦胚芽脂肪酶的进一步应用。长期以来，硫酸铵沉淀、透析、离子交换和凝胶层析等传统方法被用于小麦胚芽脂肪酶的提取与制备。总体而言，由于粗酶中杂质较多，各自的结构和功能性质各不相同，目前尚无成熟的分离纯化小麦胚芽脂肪酶的报道。因此需要提供一种快速分离纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，以达到高回收率，收获高纯度的小麦胚芽脂肪酶。
发明内容
本发明的目的是为了克服小麦胚芽脂肪酶粗酶稳定性差和专一性差的缺点，提出一种高效提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法。该方法通过设计合成一种亲和配体，辅以常见的分离手段，经过简单的几步反应就达到了分离纯化的目的。在分离纯化过程中，反应条件温和，所用试剂毒性均较低，对人体和环境危害小，易于放大。本发明的技术方案一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法， 具体包括如下几个步骤(I)高效提取粗酶将小麦胚芽机械粉碎至100目，然后用含有Triton X-100，吐温-20，吐温-80或SDS中的一种表面活性剂的磷酸钠缓冲液；以小麦胚芽缓冲液质量比
O.3-1 I混合，其中磷酸钠缓冲液ρΗ=7.0，混合振荡30min，控制与混合液质量比1:1加入正己烷溶解除油，12000rpm室温离心IOmin后取上清，得粗酶液。(2)硫酸铵沉淀和浓缩将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵，使其中硫酸铵浓度为10%_15%，摇匀后静置，然后在转速4000rpm下离心lOmin，弃去上清，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，回收率大于90%，纯化倍数1. 40 ;选用过滤分子量为10000 -15000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，获得超滤液。(3)离子交换层析采用 DEAE-sepharose, DEAE-纤维素，Q-sepharose 或superQ-sepharose中的一种离子交换柱层析纯化步骤(2)所得超滤液中的脂肪酶，较佳的米用 DEAE-sepharose 或 Q-sepharose ； 装柱后并用缓冲液平衡；将超滤液上样，上样量为柱体积的2 — 3倍，以含有lmol/L的NaCl的pH 8的0. 05 mol/L磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱，流速为1_5 mL/min，出现两个洗脱峰；收集活性峰，用透析袋浓缩。(4)合成亲和介质小麦胚芽脂肪酶亲和配体是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一种；层析介质是Sepharose、壳聚糖、娃胶或陶瓷颗粒中的一种,较佳的采用Sepharose或娃胶；
小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羟基-1，3丙二胺、1，4-丁二胺、1，6-己二胺中的一种作为间隔臂进行连接，合成亲和介质；
(5)吸附和洗脱将经过离子交换后步骤(3)收集的酶液用步骤(4)合成的亲和介质进行亲和吸附，亲和吸附的条件为pH值6. 5^8. O,电导率为5-10 ms/cm ;然后采用清洗液冲洗所述脂肪酶亲和介质，清洗液冲洗条件为PH 6. 5 7. 5，电导率5 10 ms/cm ;最后用洗脱缓冲液洗脱亲和介质上吸附的酶，洗脱条件为PH 3. 0-4. 5，较佳的在pH为3. 5时收集得到纯酶。所得纯酶,立即用0.1M Tris溶液中和至中性。本发明的有益效果
1.本发明通过采用小麦胚芽脂肪酶抑制剂核心构件嘧啶的结构类似物作为层析用亲和配体，与层析介质连接合成亲和介质，可快速高效纯化，适于大规模推广应用；
2.本发明通过辅以常规层析手段使得小麦胚芽脂肪酶的纯化效率显著增加，具有较大工业应用潜力，体现出较大的经济效益。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。实施例1 :小麦胚芽脂肪酶粗酶的提取
将新鲜小麦胚芽50g通过机械粉碎至100目，然后用含有5% (v/v)吐温-20的pH
7.O的磷酸钠缓冲液50mL混合振荡30min,加入IOOmL正己烧溶解,振荡IOmin,重复一次，12000rpm室温离心IOmin后取上清,得粗酶液。实施例2 :硫酸铵沉淀和浓缩
将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵，使其中硫酸铵饱和浓度为10%-15%，摇匀后静置5min，然后在转速4000rpm下离心lOmin，弃去上清，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，回收率大于90%，纯化倍数1. 40 ;选用过滤分子量为10000 - 15000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩脱盐。获得超滤液。实施例3 :离子交换层析
采用DEAE-sepharose离子交换柱层析纯化超滤液中的脂肪酶,装柱后并用pH 8的
O.05 mol/L磷酸钠缓冲液平衡；将超滤液上样,上样量为柱体积的2倍，以含有lmol/L的NaCl的pH 8的O. 05 mol/L磷酸钠缓冲液线性洗脱，流速为2mL/min，出现两个洗脱峰；根据洗脱峰的电泳实验，确定并收集活性峰，用透析袋浓缩。实施例4 :层析介质Sepharose-精氨酸的合成及应用
Sepharose CL 4 B (50 g)用500mL体积的去离子水洗漆,抽干成湿饼状；悬浮于50 mL活化缓冲液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次500mL体积的蒸馏水洗涤，直到洗漆液pH至中性,在抽干成湿饼状。活化的Sepharose CL 4 B介质悬浮于500 mL、0.1MNaOH溶液中，加入20 mL己二胺，凝胶在搅拌(200 rpm)下30 °C恒温12 h，用去离子水清洗。将所得之己二胺-Sepharose CL 4 B (50 g)用500mL体积的去离子水洗漆,抽干成湿饼状；悬浮于50 mL活化缓冲液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次500mL体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液PH至中性，在抽干成湿饼状。IOg精氨酸溶于0.1M NaOH溶液中与上述己二胺-Sepharose CL 4 B介质在60 °C恒温振荡12 h。反应完毕，用500 mL去离子水充分洗涤，抽干，得到亲和介质精氨酸-己二胺-Sepharose CL 4 B。( I)介质最大吸附量的确定
确定介质的最大吸附量。取小麦胚芽脂肪酶标准品(sigma)，用去离子水稀释至浓度为 100，200，300，400，500，600，700，800，900 Pg/mL，调节 pH 值为 7. 0，分别加入 0. 01 g湿亲和介质，4 1充分振荡2 h后，测定上清中的酶浓度，计算介质的最大吸附量；达到80. 5±1. 9 mg/g 介质。(2)特异性吸附的验证
考察该介质对小麦胚芽脂肪酶的特异性识别，分别取Img小麦胚芽脂肪酶标品(sigma)与20mg麦胚蛋白(提取液采用20mM PBS, pH 7. 0)混合，与该组介质进行吸附，使用pH 7. O的20mM PBS清洗，最后用0.1 M HAc洗脱，测定酶活、含量并进行电泳分析，特异性吸附含量达到3.4μ8/ιΛ。蛋白含量测定使用Bradford法。小麦胚芽脂肪酶水解酶活性采用橄榄油乳化法。实施例5 :亲和介质娃胶-苯甲喃唳的合成及应用
硅胶(50 g)用500mL体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50 mL活化缓冲液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次500mL体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在抽干成湿饼状。活化的硅胶介质悬浮于500 mL 0.1M NaOH溶液中，加入20 mL 1,6-己二胺，凝胶在搅拌(200 rpm)下30 °C恒温12 h，用去离子水清洗。己二胺-硅胶(50 g)用500mL体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于50 mL活化缓冲液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，O. 5mg/ml硼氢化钠)40 °C摇床震荡2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次500mL体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液pH至中性，在抽干成湿饼状。IOg苯甲嘧啶与己二胺-硅胶介质在O.1M NaOH溶液中60°C恒温12 h。反应完毕，用500 mL去离子水充分洗涤，抽干，得亲和介质苯甲嘧啶-己二胺-硅胶。(I)介质最大吸附量的确定
同实施例4。吸附量达到103 ±2. 8 mg/g介质。( 2)特异性吸附的验证
同实施例4，特异性吸附为2. 9 μ g/mL。实施例6吸附和洗脱
将小麦胚芽脂肪酶经过实施例1，2，3制备得到粗酶液，再用实施例5制得的硅胶一苯甲嘧啶进行亲和吸附，亲和吸附的条件为PH值6. 5，电导率为5-10 ms/cm;然后采用
O.lmol/L NaCl清洗液冲洗所述脂肪酶亲和介质,清洗液冲洗所述酶亲和介质的清洗条件为pH值7. 0，电导率5 10 ms/cm ;最后用O. lmol/L NaOH洗脱缓冲液洗脱所述亲和介质上吸附的酶，洗脱条件为PH值3. 5，得到纯酶。详细结果见表I表I
权利要求
1.一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于包括以下步骤 (O高效提取粗酶将小麦胚芽机械粉碎至100目，然后用含有表面活性剂、pH=7. O的磷酸钠缓冲液混合，小麦胚芽缓冲液质量比O. 3-1 1，混合振荡30min，控制与混合液质量比1:1加入正己烷溶解除油，12000rpm室温离心IOmin后取上清，得粗酶液； (2)硫酸铵沉淀和浓缩将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵，使其中硫酸铵浓度为10% — 15%，摇匀后静置，然后在转速4000rpm下离心lOmin，弃去上清，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，回收率大于90% ;选用过滤分子量为10000 - 15000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，获得超滤液； (3)离子交换层析采用离子交换柱层析纯化步骤(2)所得超滤液中的脂肪酶，装柱后，用pH 8的O. 05 mol/L磷酸钠缓冲液平衡；将超滤液上样，上样量为柱体积的2 — 3倍，以含有lmol/L的NaCl的pH 8的O. 05 mol/L磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱，流速为1_5mL/min,出现两个洗脱峰，收集活性峰，用透析袋浓缩； (4)合成亲和介质小麦胚芽脂肪酶亲和配体为脂肪酶抑制剂嘧啶的结构类似物，层析介质是Sepharose、壳聚糖、娃胶或陶瓷颗粒中的一种；小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羟基-1，3丙二胺、1，4- 丁二胺、1，6-己二胺中的一种作为间隔臂进行连接，合成亲和介质； (5)吸附和洗脱将经过离子交换后步骤(3)收集的酶液用步骤(4)合成的亲和介质进行亲和吸附，亲和吸附的条件为PH 6. 5 8.0，电导率为5-10 ms/cm ;然后采用清洗液冲洗吸附脂肪酶的亲和介质，清洗液冲洗条件为PH 6. 5 7. 5，电导率5 10 ms/cm ;最后用洗脱缓冲液洗脱亲和介质上吸附的酶，洗脱条件为PH 3. 0-4. 5，得到纯酶，立即用0.1M Tris溶液中和至中性。
2.根据权利要求1中步骤(I)所述的表面活性剂为TritonX-100,吐温-20，吐温-80或SDS中的一种。
3.根据权利要求1所述的提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述离子交换柱选用DEAE-sepharose, DEAE-纤维素，Q-sepharose或superQ-sepharose 中的一种。
4.根据权利要求1所述提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(4)所述的亲和配体，嘧啶的结构类似物是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一种。
全文摘要
一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明包括以下步骤(1)高效提取粗酶确定从麦胚中提取粗酶的最佳方法；(2)硫酸铵沉淀和浓缩将提取的粗酶液通过硫酸胺沉淀，并选用超滤膜对酶的盐析液进行浓缩，获得超滤液；(3)离子交换层析采用离子交换层析纯化超滤液中的脂肪酶，得到较纯的小麦胚芽脂肪酶；(4)制备小麦胚芽脂肪酶的亲和介质；(5)吸附和洗脱得到纯酶，纯度达到95%。本发明所提供的小麦胚芽脂肪酶高效提取方法，回收率高，纯度高。
文档编号C12N9/20GK103013951SQ20121057780
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者夏小乐, 辛瑜, 陈金花, 张玲, 王武 申请人:江南大学