专利名称：一种噬菌核霉的固体发酵产孢方法
技术领域：
本发明涉及噬菌核霉分生孢子的固体发酵产孢方法，属生物农药技术领域。
背景技术：
现阶段由真菌诱发的植物疾病已经占农作物疾病中的大部分，急需一些手段对其进行控制。化学农药虽然对其效果虽然较好，但其对人体以及环境的危害也是不可忽视的。因此，代替化学农药的的生物防治菌农药应运而生，在欧洲，已经有大量的工业化真菌的生物防治产品的得到应用，其中有些已经得到农药的认证了，并且他们的数量还在继续增加。
核盘菌[Scerotiniasclerotionrum (Lib.) de Bary]是世界性的植物病原菌,可引起408种植物的菌核病。由其引发的油菜菌核病仍然是现中国农业生产中的难题。目前多采用化学农药进行控制，而核盘菌核的抗药性和化学农药对生态环境的污染及人类身体健康的侵害是不可忽视的。卩遼菌核霉(Coniothyrium minitans Campbell)是1947年由美国学者Cambell首先发现并报道的一种重要的菌核寄生菌。它(Coniothyrium minitans)被认为是一种对于核盘菌(Scerotinia sclerotionrum)很有前景的生防菌。在欧州已有两种噬菌核霉制剂(Κ0ΝΙ和Contans)出售。国内尚没有关于盾壳霉制剂产品上市。现阶段国内仍没有相关产品上市，并且现阶段很多抗化学农药的噬菌核霉的突变菌株正在研究过程中，但得到的突变菌株容易出现菌丝生长过于旺盛，有产孢两不足的问题，并且分生孢子的产量与菌剂的质量密切相关，因此需要研究开发一种能解决噬菌核霉突变菌株高产孢子的方法。发明内容
本发明的目的在于针对现有状况，合理整合最优资源设计实验方案，提供一种噬菌核霉突变株分生孢子的固体发酵方法，能产生大量的分生孢子，可直接用于开发高效噬菌核霉农药，有效防治菌核病。
为实现这一目的，本发明利用无锡楗农生物科技有限公司、无锡瑞融生物医药有限公司筛选、诱变并保存的曬菌核霉(Coniothyrium minitans)K1菌株作为实验对象。单胞分离后转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面内培养后作母菌种，进而经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵基质为麸皮，通过优化发酵条件及营养液组成、配比后得到最优产孢条件，发酵所获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于生产。
本发明的方法具体包括如下步骤:
1、噬菌核霉K1孢子悬浮液的制备:将K1菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，与20°C条件下培养6 8天，用无菌水冲洗斜面孢子，利用血球计数法调整分生孢子悬浮液浓度至106/ml，放入4°C冰箱内备用。
2、二级种子液的制备:取经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基(在培养基中加入0.7%。琼脂)，以I 1.5%的接种量想发酵种子液培养基接种孢子悬浮，于摇床中振荡培养。培养条件:20°C，150r/min，培养6 8天，获得二级菌种。
3、获得产量高得固体发酵条件:以麸皮为基质，对固体发酵产孢条件进行优化。
首先，确定最佳产孢天数为8 11天，添加微量元素营养液含量为70% 80%，经过Plackett-Burman试验设计确定对孢子产量有影响的因子。之后,进行正交试验(如不同碳源、有机无机氮源)选出产孢最优组合。最后,进行Response Surface试验设计,确定添加最有影响因子的最佳含量。实验验证理论与实际的相符性，即得到最优产孢条件。
其中:
步骤3所添加的微量元素营养液为K2HPO4' EDTA、CaCl2.2H20、MgCl2.6H20、ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20、Na2MoO4.2H20、CoCl2.2H20
步骤3中Plackett-Burman试验就是筛选试验设计,主要针对因子数较多,且未确定众因子相对于响应变量的显著性是，采用的试验设计方法。
步骤3中Response Surface是指响应变量Π与一组输入变量(ζ I, ζ 2,ζ 3...ζ k)之间的函数关系式:η = f ( ζ 1，ζ 2，ζ 3...ζ k)。利用统计模型对产孢结果进行预测。
本发明方法可产生大量的噬菌核霉分生孢子。最大分生孢子量可达到I 5X 101°个/克干基质，可经处理后制成喷雾剂洒在大田中，预防菌核病的发生。
本发明适用于噬菌核霉经化学农药突变株的大量生产，利用的麸皮等物质工业中价格便宜，实验室阶段环境需求条件低，为其中试条件的优化提供了有效的依据。
具体实施方式
实施例1:
1、噬菌核霉K1孢子悬浮液的制备:将K1菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，与20°C条件下培养6 8天，用无菌水冲洗斜面孢子，利用血球计数法调整分生孢子悬浮液浓度至106/ml，放入4°C冰箱内备用。
2、二级种子液的制备:取经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基(在培养基中加入0.7%。琼脂)，以I 1.5%的接种量想发酵种子液培养基接种孢子悬浮，于摇床中振荡培养。培养条件:20°C，150r/mm，培养6 8天，获得二级菌种。
3、获得产量高得固体发酵条件:以麸皮为基质，对固体发酵产孢条件进行优化。
首先，确定最 佳产孢天数为8 11天，添加微量元素营养液含量为70% 80%，经过Plackett-Burman试验设计确定对孢子产量有影响的因子。之后,进行正交试验(如不同碳源、有机无机氮源)选出产孢最优组合。最后,进行Response Surface试验设计,确定添加最有影响因子的最佳含量。实验验证理论与实际的相符性，得到最优产孢量不少于I XlOici个/克干物质。
实施例2:
噬菌核霉致腐活性测定
噬菌核霉是菌核菌的重寄生菌，通过寄生于菌核菌，致使菌核液化、腐烂，并最终降解。试验采用江沙中混入不同量的噬菌核霉，以观察噬菌核霉对菌核菌的致腐能力，利用半数有效剂量EC5tl进行致腐活性测定。
1、菌核的培养
菌核菌预培养:取一支冻存于_80°C冰箱中的的菌核菌JPG-2冻存管，在保持不开盖的情况下于室温解冻。在无菌条件下，用灭菌后的移液器，吸取50 200 μ I解冻后的菌液，加入到9cm PSA平板的中央，用涂布棒涂补均匀。于23 28°C条件下培养2 6天。
用接种铲取预培养后的JPG-2菌，接种到PSA平板的中央，于23 28 °C、黑暗条件下培养10 16天，从平皿上取黑色的菌核作为试验对象。
2、试验处理和方法
(1)基质的准备
江沙经过0.59mm(30目)过筛后，在165°C下干热灭菌3h ;作为备用基质。
(2)药剂配制
称取8份IOOg的灭菌江沙分别置于8个200毫升的烧杯中，按照0，0.625，0.125，0.25，0.5，1.0,2.0和4.0g/Kg江沙的剂量称取噬菌核霉并分别加入盛有江沙的烧杯中，充分混匀。
3、试验方法
称取上述已经充分混匀后的噬菌核霉+江沙的样品20g，分别装入直径为9cm的培养皿中，同时在每个平皿中加入2 6mL灭菌水，混匀后在每皿埋入15 30个菌核，每个剂量安排4个重复，以Og/Kg的剂量作为空白对照。
把经上述处理的培养皿放入塑料袋中(以防水分散失)，然后置于20°C的培养箱中避光培养，10 35天后取出培养皿。用刀从菌核中间切开，如果发现被切开的菌核组织变软并且中间变黑，则该菌核就作为是腐烂菌核。
4、测定结果
采用半数致腐值(EC5tl)来表示噬菌核霉的致腐效果，EC50的计算方法如下:
(1)统计各处理剂量4个重复的腐烂菌核数的平均值，分别计算各处理剂量和对照剂量的平均腐烂率,F1 (% )和Ftl(X) =F1 (or F0)=(腐烂菌核数平均值+20) XlOO% ;F — F
(2)按如下计算各处理剂量的校正腐烂率F(% ) ^ = -^^00
(3)在《百分率 概率单位表》上查找与各校正腐烂百分率F相对应的概率单位值G；
(4)绘制1gC (y轴) G (X轴)曲线图，得到噬菌核霉对菌核菌菌核致腐活性的回归方程:y = ax+b其中:G为概率单位值，C为噬菌核霉剂量值(g/Kg)；
(5)在上述曲线图上，读取概率单位为5时相对应的1gC值，1gC的反对数值C即为所求EC5tl (g/Kg).其中PSA培养基平板
配方(IL):马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g。
配置方法:马铃薯去皮，切成小块，放入800mL去离子中，煮沸30min。用纱布过滤去除滤洛后，加入鹿糖，加水定容至1000mL。按每瓶200mL分装于500mL三角瓶中，每瓶加入4g琼脂粉。121°C高压灭菌20min后凉至45°C左右，倒入9cm培养皿制成约4mm厚的平板，备用。
实验得到的结果为< 10g/kg，噬菌核霉活性测定结果表明本发明所制备的噬菌核霉Kl的分生孢子具有良好的生防价值，具有良好的开发应用前景。
权利要求
1.一种新的噬菌核霉的固体发酵产孢方法，其特征包括如下步骤: (1)噬菌核霉K1孢子悬浮液的制备:将噬菌核!^菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，与20°C条件下培养6 8天，用无菌水冲洗斜面孢子，利用血球计数法调整分生孢子悬浮液浓度至106/ml，放入4°C冰箱内备用。
(2)二级种子液的制备:取经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基(在培养基中加入0.7%。琼脂)，以I 1.5%的接种量想发酵种子液培养基接种孢子悬浮，于摇床中振荡培养。培养条件:20°C，150r/min，培养6 8天，获得二级菌种。
(3)获得产量高得固体发酵条件:以麸皮为基质，对固体发酵产孢条件进行优化。
首先，确定最佳产孢天数为8 11天，添加微量元素营养液含量为70% 80%，经过Plackett-Burman试验设计确定对孢子产量有影响的因子。之后,进行正交试验(如不同碳源、有机无机氮源)选出产孢最优组合。最后,进行Response Surface试验设计,确定添加最有影响因子的最佳含量。实验验证理论与实际的相符性，即得到最优产孢条件。
其中: 步骤(3)所添加的微量元素营养液为 K2HP04、EDTA、CaCl2.2H20、MgCl2.6H20、ZnS04.7H20、FeSO4.7H20、Na2MoO4.2H20、CoCl2.2H20 步骤(3)中Plackett-Burman试验就是筛选试验设计,主要针对因子数较多,且未确定众因子相对于响应变量的显著性是，采用的试验设计方法。
步骤(3)中Response Surface是指响应变量η与一组输入变量(ζ ，ζ 2,ζ 3...ζ k)之间的函数关系式:η = f ( ζ 1，ζ 2，ζ 3...ζ k)。利用统计模型对产孢结果进行预测。
2.权利要求1所述方法获得的噬菌`核霉K1在生物防治菌核病微生物制剂中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物农药技术领域，具体主要涉及优化对菌核病具有强寄生、致腐能力的噬菌核霉的固体发酵产孢的研究。这里描述的噬菌核霉菌株，由我们筛选、诱变并保存。单胞分离后转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面内培养后作母菌种，进而经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵基质为麸皮，通过优化发酵条件及营养液组成、配比后得到最优产孢条件，发酵所获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于田间菌核病的防治。本发明方法可在短时间周期内产生大量的分生孢子，可用于预防植物的菌核病。
文档编号C12N3/00GK103146635SQ20131008230
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者雷楗勇, 冯骉, 朱瑞宇, 李红, 金坚, 陆核, 陈金娣, 沈志松, 付强, 张六六, 夏森玉, 徐梦龙, 丁鹏鹏 申请人:无锡楗农生物科技有限公司, 无锡瑞融生物医药有限公司