一种rna片段及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种制备RNA片段的方法，该方法包括：（1）获得化学合成的双链DNA；（2）将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；（3）对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；（4）对所述转录模板片段进行体外转录，得到转录产物。本发明还提供了如上所述的方法制备得到的RNA片段及其用途。本发明大幅度地提高了制备的RNA片段在序列和长度上的完全正确性和均一度。
【专利说明】一种RNA片段及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物领域，具体地，涉及分子生物【技术领域】，更具体地，涉及一种 制备RNA片段的方法、该方法制备得到的RNA片段以及该RNA片段的用途。
【背景技术】
[0002] 最近十几年小的非编码 RNA(small non-coding RNAs)，尤其是微 RNA(microRNA， 即miRNA)的研究非常火热，技术人员非常看好以微RNA作为靶点来研发诊断试剂盒和研发 小核酸药物的前景（Jackson and Levin, 2012;van Rooij et al·，2012)。由于微RNA通常 只有18-30个碱基（Bartel, 2004)，而且一个家族的不同微RNA成员可能只有1-2个碱基的 差异（WWW. mirbase.com)，因此用杂交方法来检测微RNA时，对探针的纯度要求高。如果探 针有碱基突变的话，会导致检测结果为假阴性或假阳性（Barad et al.，2004)。
[0003] 现有的生产微RNA探针的方法有两种：一种是通过化学合成与微RNA互补的 RNA链，然后通过末端转移酶把一个带DIG或其它标记物的核苷酸加在RNA链的末端， 从而使探针被标记好，以便于后续的检测，这类探针在早期发表的微RNA文献中大量使 用（Chen，2004)。第二种方法是在化学合成与微RNA互补的DNA探针时，把RNA核苷酸 类似物锁核酸（locked nucleic Acid, LNA)参入探针中，得到锁核酸修饰的DNA探针 (LNA-modified DNA probes,如Exiqon公司生产的产品)，然后再通过末端标记使探针的一 端或两端都带上DIG或其它的标记物。现在，这种LNA修饰的DNA探针被大量应用于检测 微RNA的研究中。
[0004] 上述两种方法的缺点有三：第一，RNA或DNA的化学合成都是从核酸的3'向5'端 逐渐加上单个的碱基，因为每次合成一个碱基时效率都达不到l〇〇%(Reese，2005)，所以无 论是化学合成的RNA还是DNA，都有一定的错误率，且错误率随合成的核苷酸长度的增加而 增加。虽然合成后的纯化(常用HPLC或PAGE纯化）能帮助富集预期目的大小的核苷酸，但 无法减少拥有同样大小的序列突变的杂质核苷酸。第二，其标记探针的方法都是在探针的 一端或两端加上带标记的一个碱基，这使得探针的序列比要检测的微RNA序列多1或2个 碱基，这会影响探针的特异性。第三，因为探针最多只携带两个标记物，所以检测的灵敏度 有限，无法检测那些低丰度表达的微RNA。
[0005] 已经公开了用T7RNA聚合酶（T7RNA polymerase)以体外转录的方式制备短RNA的 方法（Milligan et al.，1987)，具体地，该方法使用了如下3种模板：（1)化学合成的完全 双链DNA，其编码链由T7启动子和RNA片段的DNA模板连接而成；（2)酶切线性化的质粒双 链DNA，其编码链由线性载体片段、T7启动子和目的RNA片段的编码DNA连接而成；（3)化 学合成的由双链区和单链区连接而成的DNA，双链区为完全双链的T7启动子，单链区为RNA 探针的DNA模板。用该方法制备短RNA探针，会存在下列问题：（1)化学合成的模板会引入 和扩增DNA合成时的突变，从而降低了探针的纯度和特异性；（2)以酶切线性化的质粒双链 DNA为模板的方法，虽然保证了模板的完全正确性，但由于该方法使用的是一型限制性内切 酶，所以线性化的模板在编码RNA的序列后面衔接着酶切位点的残余序列，使得转录出来 的RNA比目的RNA片段多几个碱基，也降低了探针的特异性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有的RNA探针的特异性较低和灵敏度较差的缺陷，提供一 种特异性较高且灵敏度较好的RNA片段及其制备方法。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种制备RNA片段的方法，该方法包 括：（1)获得化学合成的双链DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成； 在从所述编码链的5'至3'方向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码 DNA和第二内切酶的酶切位点依次连接；（2)将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体 中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完 全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；（3)使用第一内切酶和第二内 切酶对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA 片段的转录模板片段；其中，第二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5'末端切开， 以使转录模板片段的模板链的5'末端能够与目的RNA片段的3'末端形成平末端的双链； (4)对所述转录模板片段进行体外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物。
[0008] 另一方面，本发明还提供了一种RNA片段，该RNA片段是根据如上所述的方法制备 得到的。
[0009] 再一方面，本发明还提供了 RNA片段在制备核酸药物、检测试剂盒或诊断试剂盒 中的用途。
[0010] 通过上述技术方案，本发明大幅度地提高了制备RNA片段在序列和长度上的完全 正确性和均一度，由此提高了 RNA探针的特异性和灵敏度。
[0011] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0013] 图1举例性地显示了本发明的制备RNA片段的策略。
[0014] 图2显示了转录模板片段T1 (泳道1)、转录产物R1 (泳道2)、转录产物R1-DB1 (泳道4)、转录模板片段T2 (泳道6)和转录产物R2 (泳道7)的电泳结果，泳道3、5和8分 别为分子量标记。
[0015] 图3显示了来源于同一个小鼠胚胎的发育13. 5天的冠状切片标本（A，B)和发育 11.5天的矢状切片标本（C，D)。同时用本发明生产的miR-96RNA探针（B，D)或购自Exiqon 公司的靶向miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号38474-05)(A，C)杂交 显色3个小时后，本发明生产的miR-96RNA探针检测到的信号（B，D)明显强于购自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05) (A，C)。
[0016] 图4显示了来源于同一个小鼠胚胎的发育13. 5天的冠状切片标本（A，B)和发育 11.5天的矢状切片标本（C，D)。同时用本发明生产的miR-96RNA探针（A，C)或购自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05) (B，D)杂 交后，本发明生产的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到的信号非常强（A，C);相反， 购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针（B，D)在显色72个小时检测到的信号还是很弱。 这说明本发明生产的miR-96RNA探针比购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)更加灵敏。
[0017] 图5显示了在胚胎发育11. 5天的小鼠胚胎矢状切片的背根神经节中，本发明生产 的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到miR-96特异地高表达(A);相反，购自Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)在显色 72 个小时后检测到的信号还是很微弱，与背景差别不大（B)。
[0018] 图6显示了在胚胎发育13. 5天的小鼠胚胎冠状切片的背根神经节中，本发明生 产的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到miR-96的信号非常强、而且非常特异（A); 相反，购自Exiqon公司的祀向miRNA-96的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)在显色72个小时后检测到miR-96的信号还是非常弱，与背景难以区分（B)。
【具体实施方式】
[0019] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020] 本发明提供了一种制备RNA片段的方法，该方法包括：（1)获得化学合成的双链 DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成；在从所述编码链的5'至3'方 向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码DNA和第二内切酶的酶切位点 依次连接；（2)将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒， 并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增 质粒的克隆作为模板质粒；（3)使用第一内切酶和第二内切酶对模板质粒进行酶切，得到 酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；其中，第 二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5'末端切开，以使转录模板片段的模板链的 5'末端能够与目的RNA片段的3'末端形成平末端的双链；（4)对所述转录模板片段进行体 外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物。
[0021] 其中，需要制备的RNA片段即为目的RNA片段；目的RNA的长度没有特别的要 求，可以为常规的作为探针和/或核酸药物的RNA片段的长度，例如为5-200bp，优选为 8-100bp，更优选为10-50bp，特别优选为15-30bp。目的RNA的碱基序列也没有特别的要求， 可以为常规的作为探针和/或核酸药物的RNA片段的碱基序列，如数据库miRBase(http:// www. mirbase. org/)> miR2Disease (http://www. mir2disease. org/)中所记载的各 miRNA 的碱基序列或它们的反向互补序列。
[0022] 其中，化学合成双链DNA的操作可以按照本领域常规的方式进行，例如使用固相 DNA合成法分别合成模板链的单链DNA和编码链的单链DNA。
[0023] 其中，编码链，又称正义链，是指与转录产物（RNA)序列相同(仅仅将T替换为U)的 那条DNA单链。
[0024] 其中，模板链，又称反义链，是指与编码链互补的那条DNA单链。
[0025] 其中，"互补"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸类似物的碱基按照Watson-Crick 配对原则（A-T、A-U、C-G)的配对。"完全互补"是指核酸分子中的核苷酸或核苷酸类似物的 喊基100%的互补。"完全正确"是指测定的喊基序列与目的喊基序列具有100%的一致性。
[0026] 根据本发明所述的方法，其中，第一内切酶可以为本领域常规使用的I型核酸 内切酶或II型核酸内切酶（EC3. 1. 22. 1)，例如NEB公司出售的各种限制性核酸内切酶 (https://www. neb. com/products/restriction-endonucleases)，包括但不限于 Aatll，A baSI, Acc65I, AccI, Acil, Acll, Acul, Afel, Aflll, Afllll, Agel, Ahdl, Alel, Alul, Alwl, A1 wNI, Apal, ApaLI, ApeKI, Apol, AscI, AscI, Asel, AsiSI, Aval, Avail, AvrII, BaeGI, Bael, B amHI, BanI, Banll, Bbsl, BbvCI, Bbvl, BccI, BceAI, Bcgl, BciVI, Bell, BcoDI, Bfal, BfuAI, BfuCI, Bgll, Bglll, BlpI, BmgBI, Bmrl, Bmtl, Bpml, BpulOI, BpuEI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, Bs al, BsaJI, BsaffI, BsaXI, BseRI, BseYI, Bsgl, BsiEI, BsiHKAI, BsiffI, BslI, BsmAI, BsmBI, B smFI, BsmI, BsoBI, Bspl286I, BspCNI, BspDI, BspEI, BspHI, BspMI, BspQI, BsrBI, BsrDI, Bs rFI, BsrGI, BsrI, BssHII, BssKI, BssSI, BstAPI, BstBI, BstEII, BstNI, BstUI, BstXI, BstY I, BstZ17I, Bsu36I, Btgl, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, Cac8I, Clal, CspCI, CviAII, CviK 1-1, CviQI, Ddel, Dpnl, DpnII, Dral, Dralll, DrdI, Eael, EagI, Earl, Ecil, Eco53kI, EcoNI, Eco0109I, EcoP15I, EcoRI, EcoRV, Fatl, Faul, Fnu4HI, FokI, Fsel, FspEI, FspI, Haell, Hael II, Hgal, Hhal, Hindi, Hindlll, Hinfl, HinPlI, Hpal, Hpall, HphI, Hpyl66II, Hpyl88I, Hpy 188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4III, HpyCH4IV, HpyCH4V, I-CeuI, I-Scel, KasI, Kpnl, LpnPI, Mbol, MboII, Mfel, MluCI, Mlul, Mlyl, Mmel, Mnll, MscI, Msel, MslI, MspAlI, MspI, MspJI, Mw ol, Nael, Narl, Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Neil, Ncol, Ndel, NgoMIV, Nhel, Nla III, NlalV, NmeAIII, Notl, Nrul, Nsil, NspI, Nt. Alwl, Nt. BbvCI, Nt. BsmAI, Nt. BspQI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, PacI, PaeR7I, Pcil, PflFI, PflMI, Phol, PI-PspI, PI-SceI, Plel, PluTI ,Pmel, Pmll, PpuMI, PshAI, Psil, PspGI, PspOMI, PspXI, PstI, Pvul, PvuII, Rsal, RsrII, Sac I, SacII, Sail, SapI, Sau3AI, Sau96I, Sbfl, Seal, ScrFI, SexAI, SfaNI, Sfcl, Sfil, Sfol, Sg rAI, Smal, Smll, SnaBI, Spel, Sphl, SspI, StuI, StyD4I, Styl, Styi-HF?，Swal, Taq α I，Tfi 1, Tlil, Tsel, Tsp45I, Tsp509I, TspMI, TspRI, Tthllll, Xbal, Xcml, Xhol, Xmal, XmnI, Zral ； 优选为SnaBI或BtsCI。
[0027] 其中，第二内切酶可以为本领域常规使用的I型核酸内切酶或II型核酸内切酶， 且能在目的RNA片段的编码DNA的3'末端切开，以使转录模板片段的模板链的5'末端能 与目的RNA片段的3'末端形成平末端的双链；例如上面所列出的酶，优选为BtsCI。
[0028] 优选地，目的RNA片段的DNA模板链的5'末端的1-7个碱基是第二内切酶的 酶切位点的片段(也就是目的RNA片段的编码DNA与第二内切酶的酶切位点存在重叠 (overlap))，并且，第二内切酶的切割点恰好为DNA模板链的5'末端的第1个核苷酸的5' 一侧。例如BtsCI的酶切位点在编码链上的序列为5' -NNCATCC-3'，而BtsCI的酶切位点 在模板链上的序列为3'-NNGTAGG-5'（即5'-GGATGNN-3'），此时，目的RNA片段的DNA模板 链的5'末端的第1和第2个碱基是BtsCI的酶切位点中的NN，BtsCI的切割点恰好为目的 RNA片段的DNA模板链的5'末端的第1个核苷酸的5' 一侧（即5' -GGATG-3'和5' -NN-3' 之间）。
[0029] 根据本发明的一种实施方式，其中，可以通过第一内切酶和/或第二内切酶的具 体选择，以避免在启动子和目的RNA片段的编码DNA中出现第一内切酶的酶切位点或第二 内切酶的酶切位点。例如，当目的RNA片段的编码DNA中出现EcoRI的酶切位点时，要避免 使用EcoRI作为第一内切酶的酶切位点或第二内切酶位点。
[0030] 根据本发明所述的方法，其中，启动子是指能够被RNA聚合酶识别和结合并 且在5' -3'方向上促使RNA合成的特异性DNA序列。可以根据不同的RNA聚合酶选 择该RNA聚合酶对应的启动子。优选使用高保真（即突变几率小）的RNA聚合酶，例如 T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。优选情况下，所述启动子为T7启动子 (TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID N0:5)、SP6启动子（GATTTAGGTGACACTATAG，SEQ ID N0:6) 或 T3 启动子（AATTAACCCTCACTAAAGG，SEQ ID N0:7)。
[0031] 根据本发明所述的方法，其中，目的RNA片段可以为各种需要合成的RNA片段，例 如RNA探针、RNA药物等，优选情况下，目的RNA片段为靶向miRNA的RNA探针。其中，RNA 探针是指用于RNA杂交的RNA片段。
[0032] 根据本发明所述的方法，其中，所得到的转录产物可以直接作为含有目的RNA片 段的物料使用，优选情况下，该方法还包括，从转录产物中纯化RNA片段。
[0033] 其中，纯化RNA片段的操作可以按照本领域常规的方法进行，例如进行核酸凝胶 电泳和切胶回收，或者高压液相色谱纯化。
[0034] 根据本发明所述的方法，其中，优选情况下，所述编码链的序列为SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:3。
[0035] 根据本发明所述的方法，其中，进行体外转录所用的核糖核苷三磷酸中的至少一 部分为带有标记修饰的核糖核苷三磷酸。
[0036] 其中，"标记"是指能够通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他手段 检测到的基团或化合物。例如，常用的标记包括但不限于 32P、荧光染料、生物素、地高辛或 半抗原。标记可以在转录所得的RNA中的任意位置掺入，例如在5'末端、3'末端或中间。
[0037] 其中，优选情况下，所述带有标记修饰的核糖核苷三磷酸为带有地高辛修饰的核 糖尿嘧啶三磷酸、生物素修饰的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修饰的核糖胞嘧啶三磷酸、生物 素修饰的核糖鸟嘌呤三磷酸、荧光素修饰的核糖尿嘧啶三磷酸、荧光素修饰的核糖胞嘧啶 三磷酸、荧光素修饰的核糖鸟嘌呤三磷酸、荧光素修饰的核糖腺嘌呤三磷酸、氚标记的核糖 尿嘧啶三磷酸、 32P标记的核糖尿嘧啶三磷酸、32P标记的核糖胞嘧啶三磷酸或32P标记的核 糖腺嘌呤三磷酸。
[0038] 根据本发明所述的方法，其中，优选情况下，所述带有标记修饰的核糖核苷三磷酸 为带有地高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸，且带有地高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸和不带有 地高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸的摩尔比为1.5-4:1，更优选为1.8-3:1，更进一步优选为 1. 9-2. 5:1，最优选为 2:1。
[0039] 另一方面，本发明还提供了一种RNA片段，其中，该RNA片段是根据如上所述的方 法制备得到的。
[0040] 再一方面，本发明还提供了 RNA片段在制备核酸药物、检测试剂盒或诊断试剂盒 中的用途。
[0041] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，各分子生物学试剂 均为市售品，各分子生物学实验的操作均可按工具书（Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press;4th edition)及各试剂的使用说明书进 行。
[0042] 实施例1
[0043] 参考图1，本实施例按照以下方式制备转录产物：
[0044] (1)委托上海钼宜生物科技有限公司化学合成以下4条DNA单链：
[0045] 单链 SS1，MiR-96 探针的正向序列(SnaBI-T7-MiR96~BtsCI)；
[0046] TACGTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAACG CATCC(SEQ ID NO:1);
[0047] 单链 SS2, MiR-96 探针的反向互补序列(BtsCI-MiR96-T7~SnaBI)；
[0048] GGATGCGTTTGGCACTAGCACATTTTTGCTCCCTATAGTGAGTCGTATT ACGTA(SEQ ID NO:2)；
[0049] 单链 SS3, MiR_2〇OC 探针的正向序列(BtsCI-SP6-MiR200c-BtsCI)；
[0050] GGATGCGGATTTAGGTGACACTATAGTCCATCATTACCCGGCAGTATTA CGCATCC(SEQ ID NO:3)；
[0051] 单链 SS4, MiR-200C 探针的反向互补序列(BtsCI-MiR200c-SP6-BtsCI)
[0052] GGATGCGTAATACTGCCGGGTAATGATGGACTATAGTGTCACCTAAATC CGCATCC (SEQ ID NO:4)〇
[0053] 其中，单链SSI是编码链，单链SS2是模板链，单链SSI和单链SS2经过变 性退火处理后即得到化学合成的双链DNA，命名为双链DS1 ;在DS1的编码链（即单链 SS1)的5'至3'方向上，第一内切酶的酶切位点（即SnaBI的酶切位点，GGATGCG)、启 动子（即 17 启动子，TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID N0:5)、RNA 片段的编码 DNA (即， AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID N0:8)和第二内切酶的酶切位点（S卩BtsCI的酶切位点， CGCATCC)依次连接。
[0054] 其中，单链SS3是编码链，单链SS4是模板链，单链SS3和单链SS4经过变 性退火处理后即得到化学合成的双链DNA，命名为双链DS2 ;在DS2的编码链（即单链 SS3)的5'至3'方向上，第一内切酶的酶切位点（即BtsCI的酶切位点，GGATGCG)、启 动子（即 SP6 启动子，GATTTAGGTGACACTATAG, SEQ ID N0:6)、RNA 片段的编码 DNA (即， TCCATCATTACCCGGCAGTATTA, SEQ ID N0:9)和第二内切酶的酶切位点（S卩BtsCI的酶切位点， CGCATCC)依次连接。
[0055] (2)将双链DS1克隆到载体pUC57的EcoRV酶切位点处，得到多个单克隆的质粒 PUC57-DS1。具体地，将载体pUC57用EcoRV酶切开，然而后用DNA连接酶（T41igase，购自 NEB，以下同）把切开的pUC57和DS1进行核酸连接，得到连接产物；用连接产物转化感受态 细胞(大肠杆菌DH5 α菌株)，挑选4个单克隆并扩增得到质粒pUC57-DSl。
[0056] 同上述方法将双链DS2克隆到pUC57的EcoRV酶切位点处，得到4个单克隆的质 粒PUC57-DS2。
[0057] 将4个单克隆的质粒PUC57-DS1分别进行测序，测序结果显示其中有1个克隆含 有的插入序列与RNA片段的编码DNA(g卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQIDN0:8)不完 全一致，因而不能完全正确编码RNA片段；而剩余的3个克隆含有的插入序列与RNA片段的 编码DNA (S卩，AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA，SEQ ID勵:8)完全一致，能够完全正确编码尺隱 片段。挑选任意1个能够完全正确编码RNA片段的pUC57-DSl质粒作为模板质粒，命名为 模板质粒TP1。
[0058] 将4个单克隆的pUC57-DS2分别进行测序，测序结果显示其中有2个克隆含有的 插入序列与RNA片段的编码DNA(g卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQIDN0:9)不完全一 致，因而不能完全正确编码RNA片段；而剩余的2个克隆含有的插入序列与RNA片段的编码 DNA (S卩，TCCATCATTACCCGGCAGTATTA，SEQ ID勵:9)完全一致，能够完全正确编码1?隱片段。 挑选任意1个能够完全正确编码RNA片段的pUC57-DS2质粒作为模板质粒，命名为模板质 粒 TP2。
[0059] (3)使用51^81和财8(：1对模板质粒了？1进行酶切，然后通过电泳切胶法分离酶切 产物中的小片段(约50bp)，该分离的小片段即为能够完全正确编码RNA片段的转录模板片 段T1。
[0060] 使用BtsCI对模板质粒TP2进行酶切，然后通过电泳切胶法分离酶切产物中的小 片段(约50bp)，该分离的小片段即为能够完全正确编码RNA片段的转录模板片段T2。
[0061] (4)使用体外转录体系对转录模板片段T1进行体外转录得到转录产物R1。体外 转录体系采用购自Promega公司的体外转录试剂盒进行，其中含有IX转录缓冲液、10mM的 DTT，40 单位的 RNA 酶抑制剂、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (购自Roche Applied Science公司）和40单位的T7RNA聚合酶。体外转录的 时间为4h，温度为37°C，模板用量为5ng/l·! L。
[0062] 使用体外转录体系对转录模板片段T2进行体外转录得到转录产物R2。体外转 录体系采用购自Promega公司的体外转录试剂盒进行，其中含有IX转录缓冲液、10mM的 DTT，40 单位的 RNA 酶抑制剂、0· 5mM 的 CTP、0. 5mM 的 ATP、0. 5mM 的 GTP、0. 4mM 的 UTP、0. 2mM 的DIG-UTP (购自Roche Applied Science公司）和40单位的SP6RNA聚合酶。体外转录 的时间为4h，温度为37°C，模板用量为5ng/l·! L。
[0063] 对比例1
[0064] 采用实施例1的方法制备RNA产物，不同的是将载体pUC57替换为载体 pcDNA3. 1 (+)，并用Pmel酶将pcDNA3. 1 (+)质粒线性化以使pcDNA3. 1 (+)质粒中自带的 ?7启动子后面只连接22bp的模板序列，然后通过电泳切胶法分离线性化的质粒，该分离 的片段作为转录模板片段T1-DB1。然后采用实施例1的方法进行体外转录得到转录产物 R1-DB1。
[0065] 对比例2
[0066] 采用实施例1的方法制备转录产物，不同的是将单链SS1和单链SS2经过变性退 火处理后得到的化学合成的双链DS1作为转录模板片段T1-DB2。然后采用实施例1的方法 进行体外转录得到转录产物R1-DB2。
[0067] 测试实施例1
[0068] 将转录模板片段T1、转录产物R1、转录产物R1-DB1、转录模板片段T2和转录产物 R2用浓度为15%的PAGE胶进行电泳，电泳结果见图2。
[0069] 图2的结果显示转录产物R1 (泳道2)中大部分是预期大小（23bp)和比预期大小 少一个碱基的产物，另有一些比预期大小大的RNA产物。图2的结果还显示，以线性化载体 (转录模板片段T1-DB1)为模板不能精确转录短的RNA，未见预期的22bp的RNA (泳道4)。 转录产物R2 (泳道7)中也含有精确大小的RNA探针，且转录产物主要是预期大小（23bp) 的RNA和比预期大小大一个碱基（24bp)的RNA。
[0070] 实施例2
[0071] 将转录产物R1和转录产物R2用浓度为15%的PAGE胶进行电泳，电泳结果与图2 中的泳道2和泳道7相同。切下23bp位置处的凝胶，并且从切下的凝胶中回收RNA片段， 以达到纯化RNA片段的目的，分别得到靶向miRNA-96的探针1和靶向miRNA-200c的探针 2〇
[0072] 具体的从凝胶中回收RNA片段的操作包括：把胶切成小碎片，用3倍体积的 1 XTBE洗脱摇过夜，离心（600X g，lmin)后，把上清液转移至新的离心管内，加相当于上清 液〇. 7倍体积的异丙醇沉淀RNA，用lmL的70%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，风干RNA沉淀，力口 10 μ 1无核酸酶的水溶解RNA沉淀，即得到溶解有RNA探针的水溶液。
[0073] 对比例3
[0074] 采用实施例2的方法纯化RNA片段，不同的是对转录产物R1-DB2进行纯化，得到 探针1-DB2。
[0075] 测试实施例2
[0076] 按照文献（Peng et al. ,2012)中的方法分别制备8μπι厚的11.5日龄和13.5 日龄的小鼠胚胎的切片。并按照上述文献中的方法分别使用实施例2中制备得到的靶向 miRNA-96 的探针 1、购自 Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号38474-05)和对比例3中制备得到的探针1-DB2以相同的条件对切片进行杂交 和显色，部分结果分别如图3-图6所示。
[0077] 具体地的杂交和显色的操作如下：
[0078] (1)处理切片：将上述制得的切片按照文献（Peng et al.，2012)中的方法依次进 行二甲苯脱蜡、复水、4质量％的多聚甲醛固定、蛋白酶K消化、4质量％的多聚甲醛固定和 2倍浓度的SSC杂交缓冲液洗涤；得到处理好的切片。
[0079] (2)预杂交：加100 μ 1的杂交缓冲液(购自Ambion，货号8806G)到上述处理好的 组织片上，盖上盖玻片，放置在一个含50体积％甲酰胺的5倍浓度的SSC杂交缓冲液的保 湿盒中，把保湿盒放置在53°C的温箱内预杂交1个小时。
[0080] (3)杂交：为每张标本片准备ΙΟΟμΙ的杂交缓冲液(购自Ambion，货号8806G)， 其中加2pmol的本发明生产的miR-96RNA探针，或者加2pmol的购自Exiqon公司的革巴向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)，或者加 2pmol 的对比 例3中制备得到的探针1-DB2,混匀后备用。把组织片上的盖玻片移去，分别加上如上所述 的含探针的1〇〇μ 1的杂交缓冲液，盖上一个新的盖玻片，放回保湿盒中，放至温箱中53°C 杂交过夜。
[0081] (4)洗涤：将杂交后的切片用含有50体积％甲酰胺和0. 1体积％Tween-20的2倍 浓度的SSC杂交缓冲液于57°C洗4次，每次200mL，每次15分钟；用含有50体积％甲酰胺 和0. 1体积％Tween-20的0. 2倍浓度的SSC杂交缓冲液于57°C洗4次，每次200mL，每次15 分钟；PBS中洗2次，每次200mL，每次10分钟，得到洗涤后的切片。
[0082] (5)抗体检测信号：在室温下用500 μ 1的含10体积％胎牛血清（FBS)的PBS封闭 上述洗涤后的切片1小时；加40〇μ 1的1:2000 (体积）稀释的辣根过氧化物酶（HRP)交联 的 anti-DIG 抗体（Roche)，4°C孵育过夜；缓冲液 I (0. 1Μ Tris，0. 1Μ NaCl，pH7. 5)中洗涤 2 次，每次 200mL，每次 15 分钟；200mL 的缓冲液 II (0· 1M Tris，0. 1M NaCl，pH9. 5)中洗涤 15分钟；加400 μ 1 NBT/BCIP (Roche)底物于脑片上，室温显色反应3小时后用相机拍照， 记录显色进程(见图3)。
[0083] 用本发明生产的探针显色速度快，且特异地深染高表达miR-96的背根神经节区， 与文献报道一致（Kloosterman et al.，2006)。室温显色反应12小时后终止用本发明生 产的miR-96RNA探针杂交的显色，并封片。用购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针 (miRCURY LNA? Detection probe，货号38474-05)杂交的显色在72小时后终止，并封片。 用相机拍照记录染色的结果，显示本发明生产的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测 到的信号要明显强于购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号38474-05)在显色72个小时后检测到的信号（见图4)。
[0084] 用10倍光学显微镜拍照显示：本发明生产的miR-96RNA探针在显色12个小时后 检测到miR-96特异地高表达在胚胎发育11. 5天的小鼠胚胎矢状切片的背根神经节中（图 5 中的 A)，相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货 号38474-05)在显色72个小时后在背根神经节中检测到的信号还是很微弱，与背景差别不 大（图5中的B)。
[0085] 同样，在胚胎发育13. 5天的小鼠胚胎冠状切片的背根神经节中，本发明生产的 miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到miR-96的信号非常强，而且非常特异（图6中 的 A);相反，Exiqon 公司的祀向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)在显色72个小时后检测到miR-96的信号还是非常弱，与背景难以区分（图6中 的B)。
[0086] 此外，相对于对比例3中制备得到的探针1-DB2,实施例2中制备得到的靶向 miRNA-96的探针1的背景较浅，证明本发明生产的RNA探针(探针1)的特异性高于探针 1-DB2。
[0087] 由此可以看出：用来源于同一小鼠胚胎的标本，同步检测Exiqon公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)与本发明生产的 RNA探 针的灵敏度和特异性，结果显示，本发明生产的RNA探针灵敏度和特异性都远高于Exiqon 公司的靶向 miRNA-96 的探针（miRCURY LNA? Detection probe，货号 38474-05)，且大大缩 短了显色反应的时间。
[0088] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0089] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0090] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1. 一种制备RNA片段的方法，该方法包括： (1) 获得化学合成的双链DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成； 在从所述编码链的5'至3'方向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码 DNA和第二内切酶的酶切位点依次连接； (2) 将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分 别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒 的克隆作为模板质粒； (3) 使用第一内切酶和第二内切酶对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物 中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段； 其中，第二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5'末端切开，以使转录模板片 段的模板链的5'末端能够与目的RNA片段的3'末端形成平末端的双链； (4) 对所述转录模板片段进行体外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，第一内切酶为SnaBI或BtsCI ;第二内切酶为 BtsCI ;所述启动子为T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，目的RNA片段为靶向miRNA的RNA探针。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括，从转录产物中纯化RNA片段。
5. 根据权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述编码链的序列为SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，进行体外转录所用的核糖核苷三磷酸中的至少 一部分为带有标记修饰的核糖核苷三磷酸。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述带有标记修饰的核糖核苷三磷酸为带有地 高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修饰的核糖尿嘧啶三磷酸、生物素修饰的核糖胞嘧 啶三磷酸、生物素修饰的核糖鸟嘌呤三磷酸、荧光素修饰的核糖尿嘧啶三磷酸、荧光素修饰 的核糖胞嘧啶三磷酸、荧光素修饰的核糖鸟嘌呤三磷酸、荧光素修饰的核糖腺嘌呤三磷酸、 氚标记的核糖尿嘧啶三磷酸、 32P标记的核糖尿嘧啶三磷酸、32P标记的核糖胞嘧啶三磷酸或 32P标记的核糖腺嘌呤三磷酸。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述带有标记修饰的核糖核苷三磷酸为带有地 高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸，且带有地高辛修饰的核糖尿嘧啶三磷酸和不带有地高辛修 饰的核糖尿嘧啶三磷酸的摩尔比为1. 5-4 :1。
9. 一种RNA片段，其特征在于，该RNA片段是根据权利要求1-8中任意一项所述的方法 制备得到的。
10. 权利要求9所述的RNA片段在制备核酸药物、检测试剂盒或诊断试剂盒中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104250645SQ201310263324
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2013年6月27日
【发明者】彭长庚, 温婷 申请人:彭长庚, 温婷