一种用于检测结直肠癌K-ras基因突变的核酸质谱的制备方法及其产品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测K-ras基因12、13密码子突变的方法，该方法基于质谱检测核酸酶切指纹图谱技术，包括PCR扩增、PCR产物纯化、逆转录和核酸酶切、酶切产物纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，检测人K-ras基因12、13密码子是否存在突变，可为临床判断患者预后，决定用药方案提供参考。
【专利说明】—种用于检测结直肠癌K-ras基因突变的核酸质谱的制备方法及其产品
【技术领域】
[0001]本发明属于基因检测领域，涉及一种用于检测结直肠癌K-ras基因突变的核酸质谱的制备方法及其产品，具体地是涉及利用核酸指纹质谱方法来检测一种K-ras基因12、13密码子及其相关产品。
【背景技术】 [0002]K-ras基因(GenBank:NC_000012)是RAS基因超家族中的一种原癌基因，位于12号染色体短臂上，其编码的蛋白是细胞表面受体如EGFR等信号传导通路上的重要蛋白，在肿瘤的发生、发展起着关键作用。通过下游信号蛋白参与细胞周期调控，与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移扩散、血管生成密切相关。
[0003]在正常生理情况下，细胞受到外界刺激并激活EGFR等信号通路，野生型的KRAS蛋白被上游EGFR等酪氨酸激酶磷酸化，导致短暂激活，从而激活该信号通路中的下游信号蛋白，其后KRAS蛋白迅速失活。而K-ras基因的突变将导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下，突变的KRAS蛋白仍处于激活状态，其功能状态不可控，使肿瘤的持续增殖等。
[0004]近年来研究显示K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。突变K_ras基因使本应正常死亡的细胞的生存期延长，可能的机制是K-ras基因增强了细胞分解过氧化氢的能力从而抑制凋亡。大约70%的肿瘤在不同程度上都与该基因12、13位密码子突变有关。K-ras基因在结肠癌占44%，胰腺癌占90%。
[0005]目前已报道的K-ras基因突变集中于第12、13位密码子，该区域共有7种单位点突变型(表1)。
[0006]表1:K_ras基因常见突变
[0007]
12-13位密码子~1--
GGT-GGC野生型 WT
AGT-GGC突变型 12S
[0008]
CGT-GGCj 突变型 [12R
TGT-GGC突变型 12C
GAT-GGC突变型 12D
GCT-GGC突变型 12AGTT-GGCj 突变型 [I2V
GGT-GAC突变型 13D
[0009]新型的抗肿瘤靶向药物是以与肿瘤生物学特性相关的细胞信号通路上关键因子为靶标，通过改变这些关键因子的活性，影响整个通路的信号传导，最终抑制肿瘤细胞的发生、发展。
[0010]其中，Cetuximab (爱必妥)和Panitumumab (帕尼单抗)等药物,通过与内源性配体(EGF、TGFa等)竞争性结合EGFR，阻断EGFR介导的细胞通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。这些靶向药物价格昂贵，但是对携带野生型K-ras基因的患者疗效非常好。而K-ras基因若发生突变，将使KRAS蛋白在无EGFR影响下长期处于激活状态，使肿瘤持续增殖，这也就意味着这些药物失效。因此，如果携有K-ras基因突变的患者服用相关药物，治疗效果不明显，不仅造成巨额药费的浪费，还耽误了病情。
[0011]2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布的临床结果表明，K_ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，并具有不良反应危险，而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2008年第3版)。该指南明确指出:所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，只有野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如Cetuximab> Panitumumab等)的治疗。欧洲药监机构和美国FDA都明确规定了在使用革巴向药物Cetuximab和Pan itumumab治疗转移性结肠癌前必须检测K_ras基因。我国的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也提示，“确定为复发或转移性结直肠癌时，检测肿瘤组织K-ras基因状态”。
[0012]所以，对K-ras基因突变进行检测，将有助于制定合理的用药方案，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
[0013]另一方面，近年研究发现在外周血液中能够检测到早期肿瘤细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血液中检测到K-ras突变，认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道患者体内是否存在微小病灶、肿瘤手术后是否存在转移、靶向药物靶标位点的分子学特征等，从而作出相应治疗方案。因此，检测K-ras基因的突变，还将有助于评价治疗效果，有助于对肿瘤发病风险进行预测，有助于对肿瘤转移进行早期诊断。
[0014]目前检测K-ras基因突变的方法有多种，主要有两大类，一类是非实时PCR，如测序法、限制性片段长度多态性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR和单碱基延伸的质谱检测等，虽然测序法为核酸序列分析的金标准，基于多重PCR和单碱基延伸的质谱检测也广泛的运用于基因多态和基因突变检测实验中，但是这些方法步骤繁琐，耗时长。另一类是实时PCR及其各类变化，如TaqMan探针、竞争性抑制实时PCR方法等。这类方法最大的缺陷在于，K-ras基因在12、13密码子处共有7种突变类型，加上野生型共为8种基因型，以PCR的方法对这两个密码子进行基因分型，共要进行8个PCR反应(如基于扩增受阻突变体系(ARMS)的蝎子引物法)，操作上过于繁琐，成本也较高。
[0015]综上所述，目前检测K-ras基因12、13密码子是否发生突变，对肿瘤患者(特别是结直肠癌患者)能否使用特定的靶向抗癌药物具有极其重要的临床意义。而现有的检测技术，或者步骤繁琐，耗时过长，或者要分多个反应进行，成本较高。
[0016]因此，目前需要一种对K-ras基因突变的快速、简便、准确和高效的检测方法，从而为结直肠癌的合理给药治疗提供便利。
【发明内容】
[0017]本发明第一个目的提供一种制备K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹图谱的方法，它包括如下步骤:
[0018](I)PCR反应:使用特异性PCR引物，扩增包含12、13密码子在内的K-ras基因DNA序列；
[0019](2) PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化；
[0020](3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶，对步骤(2)得到的纯化产物进行逆转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；
[0021](4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化；
[0022](5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到K-ras基因DNA片段(含12、13密码子)的核酸酶切指纹图谱。
[0023]在一个实施方案中，步骤I所述的PCR引物选自如SEQ ID NO: 1_2所示的序列，且步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在另一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在SEQ NO:1的5’端加入aggaagagag,在SEQ ID NO: 2的5’端加入cagtaatacgactcactatagggagaaggct。例如，实际合成的引物序列如下:·[0024]5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0025]5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0026]在另一个实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS 质谱仪。
[0027]上述任一方案中，其中密码子突变的类型选自12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D，其中，
12-13 β密Ri表型命名
GGT-GGC野 4:.型WT
A6T-GGC突变.?12S
[0028]CGT-GGC突变摩—12R
TGT-GGC突变.?12C
GAT-GGC突变12D
GfiT-GGC突免切12A
GTT-GGC突变.型12V
[0029]
GGT-GAC究变 M13D[0030]本发明的第二个目的是提供建立K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括:
[0031]上述步骤1-5，和:
[0032](6)将步骤5得到的K-ras基因12、13密码子野生型及突变型的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的K-ras基因12、13密码子的核酸指纹特征图谱库。
[0033]在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。
[0034]本发明的第三个目的是提供上述方法所制备的K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹特征图谱库。
[0035]本发明第四目的是提供一种利用上述特征图谱库进行待测K-ras基因12、13密码子突变检测的方法，包括:
[0036](1) PCR反应:使用特异性PCR引物，扩增包含12、13密码子在内的待测K_ras基因DNA序列；
[0037](2) PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化；
[0038](3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶，对步骤(2)得到的纯化产物进行逆转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；
[0039](4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化；
[0040](5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到待测K-ras基因DNA片段(含12,13密码子)的核酸酶切指纹图谱；
[0041](6)将所得核酸指纹特征图谱与核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测K-ras基因12、13密码子的突变类型。
[0042]在一个实施方案中，步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。在另一个具体实施方案中，步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
[0043]本发明的第五个目的是提供建立一种通过上述K-ras基因核酸指纹图谱库判断该基因12、13密码子突变类型的方法，该方法至少包括:
[0044]本发明上述第一目的的步骤(1)- (5)，和:
[0045](6)将步骤(5)得到的待测样本的核酸酶切指纹图谱，与野生型或突变型的核酸指纹特征图谱库进行对比，看是否存在特征峰，即可判断K-ras基因12、13密码子的突变类型。
[0046]在一个实施方案中，上述方法可用于指导临床用药。
[0047]本发明的第六个目的是提供能用于K-ras基因12、13密码子基因型检测的检测产品，包括:
[0048](1)用于扩增DNA的弓丨物对及其缓冲液；
[0049](2 )用于PCR产物纯化的试剂；
[0050](3)用于逆转录及核酸酶切的逆转录酶和核酸酶及其缓冲液；
[0051](4)用于纯化酶切产物的试剂；
[0052](5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。[0053]在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-20
[0054]在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为(软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700)。
[0055]定义
[0056]本发明所述的“K-ras基因DNA片段”，是指K_ras基因编码序列中，包含12、13密码子在内的一段DNA。
[0057]术语“保护碱基”，指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。
[0058]术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括:检测试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体，以及检测试剂盒等。
[0059]有益效果
[0060] 1、本发明能够实现K-ras基因12、13密码子基因型的检测，方便临床医师做出用药判断。
[0061]2、相对于测序法、限制性片段长度多态性法(RFLP)、DHPLC以及基于多重PCR和单碱基延伸的质谱检测等方法，本发明全过程仅用1-3小时即可完成，可快速获得基因型结果;
[0062]3、相对于常规PCR测序检测、竞争性抑制实时PCR、基于扩增受阻突变体系(ARMS)的蝎子引物法等方法，本发明仅在一个反应孔内即可完成实验，方便快捷，并且大大的降低了试剂盒耗材成本；
[0063]4、质谱检测技术具有高灵敏度、高准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0064]图1为野生型(WT)的核酸酶切指纹图谱
[0065]图2为突变型(12A)的核酸酶切指纹图谱
[0066]图3为突变型(12C)的核酸酶切指纹图谱
[0067]图4为突变型(12D)的核酸酶切指纹图谱
[0068]图5为突变型(12R)的核酸酶切指纹图谱
[0069]图6为突变型(12S)的核酸酶切指纹图谱
[0070]图7为突变型(12V)的核酸酶切指纹图谱
[0071]图8为突变型(13D)的核酸酶切指纹图谱
[0072]图9为对照样本I的测序结果
[0073]图10为样本I的测序结果
[0074]图11为样本2的测序结果
[0075]图12为样本3的测序结果
【具体实施方式】
[0076]现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明。本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，[0077]Sam brook and Russell" Molecular Cloning:A Laboratory Manual" (2001);
[0078]Cloning:A Practical Approach, " Volumes I and II (D.N.Glover, ed.,1985)";
[0079]T.A Brown “Genome”BIOS Scientific Publishers Limited;
[0080]PY Kwok Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.(2001), 235 - 58.[0081]实施例一、引物设计。
[0082]针对K-ras基因DNA片段，设计对应特异性PCR弓丨物核心序列(SEQ ID No:1和SEQ ID No:2)，该对引物能扩增K-ras基因编码序列上，含12、13密码子在内的83bp。
[0083]SEQ ID No:1:5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0084]SEQ ID No:2:5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0085]它们扩增的序列SEQ ID NO:3 (83bp)如下(其中加下划线区域为12、13密码子，仅列出野生型):
[0086]SEQ ID No:3:AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTA
[0087]为了使逆转录酶识别PCR产物，并且避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，还需要在SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的5’端加上特定序列(小写字母)。因此，实际合成的引物序列如下:
[0088]SEQ ID No:4:5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’
[0089]SEQ ID No:5:5’ -cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’
[0090]它们扩增的PCR产物实际序列如下(其中加下划线区域为12、13密码子，仅列出野生型，大写字母为K-ras基因的部分编码DNA，小写字母为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的5’端加上的特定序列):
[0091]SEQ ID No:6:aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTT GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAagccttctccctatagtgagtcgtatt actg
[0092]相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。
[0093]实施例二、样本制备。
[0094]通过质粒构建和定点突变等分子克隆技术，分别构建含K-ras基因野生型和7种突变的的质粒，共8种，分别为样本WT (野生型)、12A (12密码子GGT>GCT)、12C (12密码子GGT>TGT)、12D (12 密码子 GGT>GAT)、12R (12 密码子 GGT>CGT)、12S (12 密码子 GGT>AGT)、12V (12密码子GGT>GTT)、13D (13密码子GGOGAC)。此操作采用基本的分子生物学常用技术，不再累述。
[0095]临床结直肠癌患者一，在手术切除肿瘤组织时，取新鲜组织块(黄豆大小)，以血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP304)提取该患者肿瘤基因组DNA，定为样本1，-20°C备用。
[0096]结直肠癌术后患者二，采集静脉血，分离血清(约Iml),采用磁珠法基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP329)提取该患者血清中的游离DNA，定为样本2，-20°C备用。
[0097]某结直肠癌患者三的组织标本，取石蜡切片10块(5um厚，每块中肿瘤组织面积大于70%)，采用石蜡包埋组织DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP331)提取该样本中的患者的肿瘤基因组DNA，定为样本3，-20°C备用。
[0098]根据上述方法，对三名已知未患有结直肠癌的其他疾病患者，分别采集其直肠组织、静脉血以及直肠组织石蜡切片，进行处理，分别得到对照样品1-3，-20°C备用。
[0099]实施例三、K-ras基因12、13密码子野生型和突变型核酸酶切指纹图谱的差异性分析和验证。
[0100]通过对野生型和突变型的序列进行理论分析，野生型和突变型将产生不同的核酸酶切指纹图谱，如表2所示，野生型的DNA片段，通过酶切将产生3738.35峰，并且不具有1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰，而突变型的DNA片段正好相反，通过酶切和质谱后将产生1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰中的一个或几个，而不存在3738.35峰。因此，理论上可通过3738.35峰是否存在确定是否存在野生型，通过1577.98,2196.38,2485.56,3778.38和3794.37等峰中的一个或几个是否存在确定是否存在突变型。
[0101]表2:K-ras基因12、13密码子野生型和突变型核酸酶切片段的理论分析
[0102]`
【权利要求】
1.一种制备κ-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹图谱的方法，包括如下步骤: (1)PCR反应:使用特异性PCR引物，扩增包含12、13密码子在内的K-ras基因DNA序列； (2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化； (3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶，对步骤(2)得到的纯化产物进行逆转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化； (5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到K-ras基因DNA片段(含12、13密码子)的核酸酶切指纹图谱。
2.权利要求1的方法，其中所述的PCR引物选自如SEQID NO: 1_2所示的序列，且步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.权利要求1或2的方法，其中上述PCR引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。
4.权利要求3的方法,其中保护碱基序列选自在SEQNO:1的5’端加入aggaagagag,在SEQ ID N0:2的5’端加入cagtaatacgactcactatagggagaaggc,即实际合成的引物序列如下:
5’-aggaagagagAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’`
5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’ 。
5.权利要求1至4的方法，其中密码子突变的类型选自12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D,即:12-13位密码—f表型命名GGT-GGC野.,l1.fiWTAGT-GGC突变.?12SCGT-GGC突变甩12RTGT-CiCiC突变型12C GAT-GGC突变型12D GCT-GGC突变型12A GTT-GGC51变型12V ° GGT-GAC51变型13D
6.一种建立K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括: 权利要求1-5中所述步骤1-5，和: (6)将步骤5得到的K-ras基因12、13密码子野生型及突变型的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的K-ras基因12、13密码子的核酸指纹特征图谱库。
7.权利要求6的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第.136879 号、登记号 2009SR10700。
8.通过权利要求6或7的方法所制备的K-ras基因12、13密码子突变的核酸指纹特征图谱库。
9.一种利用权利要求8的特征图谱库进行待测K-ras基因12、13密码子突变检测的方法，包括: (1)PCR反应:使用特异性PCR引物，扩增包含12、13密码子在内的待测K_ras基因DNA序列； (2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化； (3)逆转录和核酸酶切:使用特定的逆转录酶和核酸酶，对步骤(2)得到的纯化产物进行逆转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化:对步骤(3)得到的酶切产物进行纯化； (5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到待测K-ras基因DNA片段(含12,13密码子)的核酸酶切指纹图谱； (6)将所得核酸指纹特征图谱与核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测K-ras基因12、13密码子的突变类型。 在一个实施方案中，步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。在另一个具体实施方案中，步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
10.一种用于K-ras基因12、13密码子基因型检测的检测产品，包括: (1)用于扩增DNA的引物对及其缓冲液； (2)用于PCR产物纯化的试剂； (3)用于逆转录及核酸酶切的逆转录酶和核酸酶及其缓冲液； (4)用于纯化酶切产物的试剂； (5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件；其中， 所述引物是SEQ ID NO:1-2。
【文档编号】C12Q1/68GK103667490SQ201310680221
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】张学记, 马庆伟, 赵洪斌, 张海燕, 林燕 申请人:向华