一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤：（1）将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，活化培养，制得活化菌株；（2）将活化菌株接种于PDA种子培养基中，经培养，制得发酵种子；（3）将发酵种子接种于红曲霉发酵培养基中，经培养，即得。本发明利用木糖母液作为发酵培养基的碳源，将木糖母液变废为宝，并且有效降低了桔霉素的产生，降低桔霉素浓度与发酵液色价比值，提高红曲产品的安全性。
【专利说明】一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，属于微生物发酵【技术领域】。【背景技术】
[0002]紫色红曲菌(Monascus purpureus)是红曲红色素和降血脂药的重要生产菌株,其发酵产物也被广泛应用于饮食烹饪。1995年，Blanc在红曲发酵产物中发现了肾毒素桔霉素(citrinin)，桔霉素会导致肾脏肿大，肾小管扩张，上皮细胞坏死，同时还具有致畸致癌作用，因此红曲产品的安全性受到了质疑。
[0003]传统的红曲霉培养方式以大米(淀粉)为原料，有调察显示中国市场内约有一半的红曲产品桔霉素含量超标(Yan I1.,2012)。
[0004]为了降低红曲产品中桔霉素的产量，研究者对红曲菌进行大量的菌种改良和发酵工艺改良研究。这其中有对红曲霉菌株进行基因工程改造(周礼红，江南大学)，使用60Co辐照诱变(许赣荣，江南大学)，有研究利用大豆水解液为氮源优化发酵工艺降低桔霉素产量(陈蕴，江南大学)。
[0005]如中国专利文献CN102987180A (申请号201210536354.9)公开了一种低桔霉素红曲米的生产方法，其采用紫色红曲菌发酵大米而成，该方法的工艺步骤为:(I)将清洗干净的大米放入加有桔霉素抑制剂的水中浸泡；(2)浸泡后的大米经浙干、蒸米、降温、接种，再堆积培养后转入通风培养；所述通风培养期间通过补加水使物料的含水量保持在50wt%~70wt%，所述补加的水中加入有金属螯合剂；(3)所述通风培养结束前，向物料加入氧化剂以去除红曲米上的桔霉素；所述通风培养结束后，出料烘干，即可得到低桔霉素红曲米。
[0006]中国专利文献CN1807576A (申请号200610033131.5)公开了一种不含桔霉素的功能性红曲菌菌丝体的培养方法。该方法通过调节培养室或塑膜温室送风量排风量或敞开式通风系统，在菌丝体生长对数期以低浓度醋酸雾状物以及点燃稻草产生烟熏进行刺激，以及加大通气量，使菌丝体培养阶段昼夜间变温、调湿，调控培养基料含水量，保持淀粉质培养基料疏松，加速菌丝体生长速率及功能性代谢产物Monacolin K的合成和积累，同时有效抑制Monascidin A(Citrinin)的形成。但上述研究仍然不能满足市场的需求。
[0007]将玉米秸、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻草、小麦秸杆等植物原料进行加压加热预处理以及酸水解后，再对水解液进行木糖浓缩结晶，在结晶分离后得到的废液一木糖母液；木糖母液采用菲林法测定其还原糖含量为3%~80%的生产废弃糖液；通常采用高效液相色谱法(HPLC)测定其可溶性糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖各种糖的浓度，该废液的木糖含量为25~70%，葡萄糖含量为5~25%，阿拉伯糖含量为5~25%。针对上述木糖母液，目前还没有很好的利用方法。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法。
[0009] 本发明的技术方案如下:[0010]一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤:
[0011](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在25~35°C活化培养4~5天，制得活化菌株；
[0012](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在25~35°C、200rpm/min条件下，培养2~4天，制得发酵种子；
[0013](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10~1:5接种于红曲霉发酵培养基中，在25~35°C、200rpm/min条件下，培养7~10天，即得；
[0014]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0015]木糖母液30 ~50mL，NaN032 ~4g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g,MgS04.7H200.5g, FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH5 ~7。
[0016]根据本发明优选的，每升组分如下:
[0017]木糖母液30mL， NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH6。
[0018]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的红曲霉菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种保藏编号40943。本领域技术人员可以根据实际情况选择不同的红曲霉菌株进行制备红曲制剂。
[0019]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PDA斜面培养基，每升组分如下:
[0020]去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，定容至1000mL。
[0021]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的PDA种子培养基，每升组分如下:
[0022]去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000mL。
[0023]根据本发明优选的，所述木糖母液的组分如下，均为重量百分比:
[0024]木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量为水。DNS法测得总还原糖浓度为600 ~700g/L。
[0025]有益效果
[0026]1、本发明利用木糖母液作为发酵培养基的碳源，将木糖母液变废为宝，并且有效降低了桔霉素的产生，降低桔霉素浓度与发酵液色价比值，提高红曲产品的安全性；
[0027]2、本发明采用液态发酵法生产红曲霉，相比固态发酵操控性强，且物质利用效率高，节约能源。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为红曲菌株经发酵后的发酵液在500nm的发酵液色价、桔霉素浓度和桔霉素浓度与发酵液色价的比值的柱状图；
[0029]图2为红曲菌株经发酵后的发酵液在400nm和500nm的发酵液色价、桔霉素浓度和桔霉素浓度与发酵液色价的比值的柱状图；
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0031]培养基
[0032]实施例中的PDA斜面培养基按如下方法制备:
[0033]去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，定容至1000mL,充分溶解后，121°C高压蒸汽灭菌30min ；
[0034]实施例中的PDA种子培养基按如下方法制备:
[0035]去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000mL,充分溶解后，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0036]发酵产物指标(发酵液色价、桔霉素浓度)检测方法如下:
[0037]发酵液色价检测方法:用发酵液四倍体积的无水乙醇在60°C水浴中萃取lh，12000rpm/min离心5min,取上清，用适量无水乙醇稀释，以无水乙醇做空白对照，测量在400nm和500nm处测量吸光值。
[0038]色价=500nm波 长下吸光值X稀释倍数；
[0039]或者
[0040]色价=(400nm波长下吸光值+500nm波长下吸光值)X稀释倍数
[0041]桔霉素检测方法:用发酵液四倍体积的无水乙醇在60°C水浴中萃取lh，12000rpm/min离心5min,取上清液,用0.22 μ m的滤膜微滤后,进行HPLC分析。
[0042]菌株来源:购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种保藏编号40943。
[0043]木糖母液购自山东龙力生物科技股份有限公司，经检测，木糖母液的组分如下，均为重量百分比:
[0044]木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量为水。DNS法测得还原糖含量为600 ~700g/Lo
[0045]实施例1
[0046]—种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤:
[0047](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0048](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养3天，制得发酵种子；
[0049](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0050]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0051]木糖母液30mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0052]经分析本次使用木糖母液木糖含量为468g/L ;葡萄糖含量为114g/L ；DNS法测得还原糖量为618g/L
[0053]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的红曲霉菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种保藏编号40943。本领域技术人员可以根据实际情况选择不同的红曲霉菌株进行制备红曲制剂。
[0054]本发明所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为17.2U/mL，桔霉素含量为0.598mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.03μ g/U。
[0055]实施例2
[0056]一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤:
[0057](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0058](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养4天，制得发酵种子；
[0059](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；[0060]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0061]木糖母液20mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0062]本发明所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为6.54U/mL，桔霉素含量为0.548mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.083μ g/U。
[0063]实施例3
[0064]一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤:
[0065](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0066](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养4天，制得发酵种子；
[0067](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0068]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0069]木糖母液30mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0070]上述低桔霉素产生的红曲霉发酵培养基的应用，步骤如下:
[0071]本发明所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为6.3U/mL，桔霉素含量为0.47mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.075μ g/U。
[0072]实施例4
[0073]一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，包括如下步骤:
[0074](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0075](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养4天，制得发酵种子；
[0076](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0077]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0078]木糖母液50mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。[0079]本发明所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为6.5U/mL，桔霉素含量为0.58mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.09μ g/U。
[0080]对比例I
[0081](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0082](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养3天，制得发酵种子；
[0083](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0084]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下:
[0085]木糖30g, NaN033g,酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0086]对比例I所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为8.7U/mL,桔霉素含量为0.348mg/L,桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.03 μ g/U。
[0087]对比例2
[0088](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0089](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养3天，制得发酵种子；
[0090](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0091]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基使用PDA培养基作为对比，每升组分如下:
[0092]去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，定容至1000mL。
[0093]对比例2所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为20.8U/mL,桔霉素含量为8.62mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.41 μ g/U。
[0094]对比例3
[0095](I)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在30°C活化培养4天，制得活化菌株;
[0096](2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在30°C、200rpm/min条件下，培养4天，制得发酵种子；
[0097](3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10接种于红曲霉发酵培养基中，在30°C >200rpm/min条件下,培养8天，即得；
[0098]所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，参照文献报道方法制备(邢淑婕，周颖，刘开华.玉米芯水解液发酵生产红曲色素的研究及条件优化[J].中国酿造，2010 (9):130-132)出玉米芯水解液，依照还原糖量添加玉米芯水解液配置发酵培养基，还原糖量与实施例2相同，培养基其余成分不变。
[0099] 对比例3所涉及的红曲霉菌株在上述发酵方法下生产的发酵液色价为5.0U/mL,桔霉素含量为0.44mg/L，桔霉素浓度与发酵液色价的比值为0.08 μ g/U。[0100]结果分析
[0101]由上述结果可以看出，使用木糖母液(实施例1)相对于纯木糖培养(对比例I),具有较高色价，同时保持较低的桔霉素浓度与色价比值；相对于PDA培养基(对比例2)，本发明可以极大的降低桔霉素产量；而相对于文献报道的方法(对比例3)本发明具有较高的发酵液色价，桔霉素浓度与发酵液色价比值也较低(实施例2、3、4)，同时，当木糖母液添加量为30mL/L时(实施例3),发酵效果最佳。
[0102]虽然本申请已以较佳实施例揭露如上，然并非用以限定本申请实施的范围，依据本申请的权利要 求书及说明内容所作的简单的等效变化与修饰，仍属于本申请技术方案的范围。
【权利要求】
1.一种利用木糖母液制备红曲制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将红曲霉菌株接种于PDA斜面培养基上，在25~35°C活化培养4~5天，制得活化菌株； (2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于PDA种子培养基中，在25~35°C、200rpm/min条件下，培养2~4天，制得发酵种子； (3)将步骤(2)制得的发酵种子按照体积比1:10~1:5接种于红曲霉发酵培养基中，在25~35°C、200rpm/min条件下，培养7~10天，即得； 所述步骤(3)中的红曲霉发酵培养基，每升组分如下: 木糖母液 30 ~50mL，NaN032 ~4g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g,MgS04.7H200.5g, FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH5 ~7。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每升组分如下: 木糖母液 30mL, NaN033g,酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH6。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的红曲霉菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种保藏编号40943。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PDA斜面培养基，每升组分如下: 去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，定容至1000mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PDA种子培养基，每升组分如下: 去皮马铃薯200g，切块，加水600mL煮沸30分钟，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，定容至 1000mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木糖母液的组分如下，均为重量百分 比: 木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量为水。
【文档编号】C12R1/66GK103937682SQ201410152887
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】方诩, 自振滔, 石文昊, 李钰茜, 王明钰 申请人:山东大学