% Na2S2Oj§ 液中止反应。
[0071] f.适当稀释，取最后稀释度的菌液0. 2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基（含100g/L 葡萄糖的碳酸钙MRS培养基）平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板 的菌株转印到pH为1. 5、1. 8和2. 0的LPHMRS培养基（低pH值改性MRS培养基）上和亚 硝酸钠筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基）上。
[0072] g.在37°C培养2~3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛 选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆 菌L1。
[0073] 2)亚硝基胍诱变
[0074] a.在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1 一环，接入装有50mL培养基MRS (无 琼脂）（葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于 对数生长前期。
[0075] b.取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗绦2次。
[0076] c?用pH6. 0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0077] d?取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/ mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0078] e.在37°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理 盐水洗涤数次，中止反应。
[0079] f.适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基（含100g/L 葡萄糖的碳酸钙MRS培养基）平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板 的菌株转印到pH为1. 5、1. 8和2. 0的LPHMRS培养基（低pH值改性MRS培养基）上和亚 硝酸钠筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基）上。
[0080] g.挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基 上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
[0081] 3)摇瓶复筛
[0082] a.在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基 MRS (无琼脂）（葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养15h左右，使菌 体处于对数生长中期。
[0083] b.分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基（含250g/L葡萄糖的 碳酸钙MRS培养基）平皿中、pH为1. 5、1. 8和2. 0的LPHMRS液体培养基（低pH值改性MRS 培养基）和亚硝酸钠液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基） 上（注：采用250mL三角瓶）。200rpm，37°C培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培 养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚 硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生 速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
[0084] c.选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pHl. 8的培养基 中生长）和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
[0085] 4)遗传稳定性试验
[0086] 将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵 情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正 常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014。
[0087] 5) 5L发酵罐试验
[0088] a.取斜面上的植物乳杆菌L2 -环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂）（葡萄糖 浓度为150g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
[0089] b.将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基（初始葡萄糖为150g/L)的5L发 酵罐中。接种量为10%，37°C下lOOrprn培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0. 5L/ min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。
[0090] C.将对数期的菌种接入装有3L pH为1. 8的LPHMRS液体培养基（初始葡萄糖为 50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下lOOrprn培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0. 5L/min)，后期厌氧，整个过程用0. 5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1. 8,总 培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2. 5g/L，说明植物乳杆菌 L2能够在pHl. 8的环境中生存。
[0091] d.将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚 硝酸钠的改性MRS筛选培养基）的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下lOOrpm培养8小 时，对数前期溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速 率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对 亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/ h/L〇
[0092] 实施例2
[0093] 一种中温a -淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
[0094] (1)菌种活化
[0095] 将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，31°C培养24h进 行菌种活化，如此活化2次；
[0096] 所述斜面培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g,琼脂15g， 蒸馏水 1000mL，pH 值 6,121°C灭菌 20min ;
[0097] (2)液体种子扩大培养
[0098] ①一级种子培养：将步骤（1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基 装量100毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度31°C，培养时间10h ;
[0099] ②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0100] ③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度38°C，培养时间10h ;
[0101] ④一级种子罐培养：将三级种子以10 %接种量接入总容积为150L的一级种子罐， 发酵培养基装量100L，培养温度31°C，搅拌速度200rpm，通风量（V/V) 1: 1，罐压0. 05Mpa， 培养时间l〇h ;
[0102] 所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
[0103] 酵母粉0. 3%，葡萄糖1%，蛋白胨0. 3%，牛肉膏0. 5%，磷酸氢二钾0. 8%，中草 药剂粉1.5%，海藻糖1%，硫酸钙lg，氯化镁2g，柠檬酸钠lg，不足部分纯净水补足，pH值 6,121°C 灭菌 30min。
[0104] 所述种子罐培养基重量组成为：
[0105] 麦芽糊精5%，酵母粉0. 4%，中草药剂粉1. 5%，海藻糖1 %，蛋白胨0. 1 %，玉米浆 0. 1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0. 1%，不足部分纯净水补足，pH值6， 121°C 灭菌 30min。
[0106] 所述种子罐发酵液菌体浓度为7. Ox 108个/ml ;
[0107] (3)发酵罐发酵
[0108] 将种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度35°C，搅拌速度250r/min，通 风量（V/V) 1:2,培养时间13h ;然后以1. 5°C /h降温速率缓慢降温至15°C，恒温培养13h ; 继续以1. 5°C /h降温速率缓慢降温至3°C，此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接 入发酵罐，恒温培养13h ;最后以1. 5°C /h升温速率缓慢升至35°C，恒温培养30h。
[0109] pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6. 5 ;
[0110] 所述发酵培养基组成为：麦芽糊精l〇〇g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药剂粉40g， 海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g， 消泡剂 〇? 5g,纯净水 lOOOmL，pH 值 6. 5,121°C灭菌 20min;
[0111] 所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0112] 称取黄芪25份，党参15份，柴胡15份，黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径 为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度到33°C，pH值6. 5,按 混合物料质量比添加〇. 3%纤维素酶酶解1. 5小时，控制温度80°C保持8分钟，然后降温至 50°C，pH为6. 0，按混合物料重量比分别加入0. 20 %的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解50分钟，冷 却到8°C保持2小时，升高温度到90°C保持15分钟，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙 醇的混合物，控制温度至70°C保持3. 4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0113] 所述乙醇和丙醇的质量比例为1 :1. 2。
[0114] (4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温a -淀粉酶。
[0115] 经上述制备方法得到发酵液经离心取上清液所得的中温