专利名称：化合物(2s)－5，7,2＇，6＇－四羟基－6，8－二异戊烯基－二氢黄酮的提取工艺及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药中具有明显药理活性成分的分离纯化方法，更具体地说，本发明涉及的是白花败酱草中一种具有明显抗肿瘤活性的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺及其应用。
背景技术：
癌症是严重危害人民生命健康的重大疾病，世界上每年有600多万人死于恶性肿瘤。目前临床上使用的治疗药物主要是传统的细胞毒类化学合成抗肿瘤药物，虽然部分药物抗肿瘤作用明显，但毒副作用大，选择性较差，容易产生耐药性。中医药学是一门积淀中华民族几千年来防病治病的实践经验结晶，具有鲜明的理论体系，又能体现辨证论治和个体化治疗时代特征的生命科学。中医能辨西医不明之症，中药能治西药难治、不治之症。因此抗肿瘤中药的研究越来越收到国内外医药界的重视和青睐。
白花败酱草(Patrinia villosa Juss)又名苦菜、苦斋、鹿肠，系败酱科多年生草本植物，分布于我国华东、华中、华南及西南各地。因其含有多种氨基酸、维生素和矿物质等有益成份而被人们广泛食用，它也是一种常用中药，始载于《神龙本草经》，后又被《中国药典》(1977版)收载，具有清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神、促进肝细胞再生、改善肝功能、增强抑菌和抗病毒等作用，临床上常用于治疗阑尾炎、痢疾、肝炎、扁桃体炎、流行性腮腺炎、痈肿等症。现代研究表明白花败酱草主要含有三萜类与环烯醚萜类化合物如白花败酱醇甙(villosolside)、白花败酱醇(villosol)、番木别甙(loganin)、莫诺甙(morroniside)、白花败酱甙(villoside)等，此外还有以败酱烯与异败酱烯为主的挥发油、内酯、香豆素等，但很多未见文献报道，也未见有相关活性筛选的报道，其中化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮[(2S)-5，7，2′，6′-tetrahydroxy-6，8-di(γ，γ-dimethylallyl)-flavanone]的结构式如下 虽然我们已经采用高速逆流色谱技术从白花败酱草药材中对该化合物进行了分离制备，但所得产物量较少，不能满足大量药效试验的需要[J.Y.Peng，G..J.Yang，G.R.Fan，Y.T.Wu，J.Chromatogr.A，1092(2005)235-240]，并且也没有进行该化合物药效筛选尤其是抗肿瘤活性方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从白花败酱草中分离纯化具有明显抗肿瘤活性化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，并进行了抗肿瘤活性筛选以验证其抗肿瘤活性。
本发明提供的从白花败酱草中分离纯化具有明显抗肿瘤活性的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，具体包括粗提物提取、粗提物的极性分段、硅胶柱层析三道工序，其特征在于采用一定浓度的乙醇提取药材获取粗提物，采用有机溶剂对粗提物分段萃取并结合硅胶柱层析得到纯品。
其具体提取工艺工序如下1.粗提物提取取白花败酱药材适当粉碎后，用80％乙醇回流提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味。
2.粗提物的极性分段取提取所得浸膏，加适量水混悬后，先用石油醚(60-90℃)萃取，静止分取石油醚层，再向水层中加入氯仿萃取，静止后分取氯仿层，减压浓缩氯仿萃取物，真空干燥。
3.硅胶柱层析取氯仿萃取物进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，接收氯仿-甲醇(20∶1)洗脱流分，该流分减压回收溶剂后再次进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，接收氯仿-甲醇(15∶1)洗脱流分，减压回收后得浅黄色粉末，即为(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮。
亦对化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮进行了体内、体外抗肿瘤活性实验，考察所得化合物的体外细胞毒活性和体内对移植性肿瘤生长的抑制作用。
采用MTT法考察了所得化合物体外对7种人肿瘤细胞株(A549、BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29、K562和A498)的生长抑制作用。结果该化合物对所选7种人肿瘤细胞株的半数抑制浓度均小于10μg/ml。
同时也进行了该化合物对小鼠体内S180移植性肉瘤生长的抑制作用试验。
建立小鼠体内S180移植性肉瘤模型，腹腔注射该化合物，并与阳性对照药环磷酰胺对照，计算该化合物的抑瘤率，并观察该化合物对小鼠的免疫系统和白细胞的影响。结果表明在腹腔注射给药40mg/kg时，该化合物的抑瘤率达到了57％以上。
图1为白花败酱草中具有明显抗肿瘤活性化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺流程图。
图2为化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮体内抗S180肉瘤试验各给药组肉瘤的病理切片具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明实施例1.
化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取1.称取白花败酱草药材粗粉8.0kg，用8倍量80％乙醇回流提取2.0h，过滤，再向滤渣中加入6倍量80％乙醇回流提取1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏约2000ml(浓缩温度为50度)。
2.取浓缩后的浸膏，加1000ml水混悬后，置于5000ml分液漏斗中，加石油醚1000ml充分振摇后静止分层，分取石油醚层，如此萃取二次，合并石油醚萃取液。再向水层中加入1000ml氯仿，充分振摇后静止分层，分取氯仿层，如此萃取三次，合并氯仿萃取液。减压浓缩萃取液(浓缩温度60度)后减压干燥得氯仿萃取物94g。
3.取氯仿萃取物进行硅胶柱层析(8.0×120cm，硅胶量2500g，200-300目)，依次用氯仿、氯仿∶甲醇(100∶1-1∶10)梯度洗脱，接收氯仿∶甲醇(20∶1)洗脱液，减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得浅黄色粉末3.5g。取次粉末在此进行硅胶柱层析(8.0×120cm，硅胶量350g，200-300目)，依次用氯仿-甲醇(50∶1-1∶1)梯度洗脱，接收氯仿∶甲醇(15∶1)洗脱液，减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得浅黄色粉末400mg，即为化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮。
实施例2.
化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮体内、体外抗肿瘤实验选择7种人肿瘤细胞株，A549、BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29、K562和A498在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液、37℃、5％CO2培养箱生长至细胞旺盛，经0.25％胰酶加0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔微量培养板中(细胞浓度为5×105个/ml)，给药组分别加入不同浓度的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮，对照组加入相应的溶剂，给药后培养72小时，按MTT法用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(A)值，计算化合物的抑制率，由抑制率和样品浓度绘制相应的抑制曲线，再计算出半数抑制浓度(IC50)。该化合物对各肿瘤细胞株的IC50值见下表1。
表1化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮对7种人肿瘤细胞株的IC50值
取本室自己传代呈对数生长期的S180小鼠腹水，用生理盐水稀释成2×107/ml，取0.2ml接种于小鼠右腋皮下。小鼠接种后第二天灌胃给药，空白组给予生理盐水0.2ml，阳性对照组给腹腔注射CTX 0.2ml(20mg/kg)，各治疗组分别给予化合物化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg注射用油溶解后腹腔注射)，连续10天，于次日处死。小鼠处死前眼眶取血，并作白细胞(WBC)计数，之后行脱臼处死小鼠。
剥取肉瘤组织同时取小鼠脾脏和胸腺，称重后按照下式计算抑瘤率，并计算脾指数和胸腺指数。小鼠服用CTX后，被毛疏松，精神较差，饮水饮食减少，与对照组相比体重增加缓慢，但对肿瘤的抑瘤作用十分突出，抑瘤率高达57.7％。腹腔注射化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮后的小鼠饮食良好，行动自如，体重与模型组相比无显著性差异，肿瘤生成时间延后，瘤块生长缓慢。所得结果表明本工艺制备得到的化合物具有很强的抑制小鼠体内S180肉瘤生长的作用，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，同时该化合物能明显见降低小鼠的脾指数和升高小鼠的胸腺指数，高剂量时的作用尤为显著(P＜0.01)。白细胞计数表明该制备物能明显升高由CTX所造成的小鼠白细胞降低(P＜0.01)。
同时，我们也对小鼠S180肉瘤进行了常规石蜡切片和显微分析，如图2所示。由图可知模型组肿瘤细胞生长旺盛，各给药组肿瘤细胞都有不同程度的死亡，尤其是CTX和给药高剂量组，肿瘤细胞死亡比例较大，病理切片表明CTX和化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮都能杀死一定量的肿瘤细胞，从而抑制肉瘤的生长，与上述实验所得数据一致。
具体见表2、3和4。
表2化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮对S180移植肉瘤的抑制作用(mean±S)
注与模型组相比ΔP＜0.05；与模型组相比ΔΔP＜0.01；与CTX组相比#P＜0.05表3化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮对荷瘤小鼠免疫器官的影响(mean±S)
注与模型组相比ΔP＜0.05；与CTX组相比#P＜0.05；与CTX组相比##P＜0.01表4化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮对荷瘤小鼠WBC数的影响(mean±S)
注与模型组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与CTX组相比###P＜0.00权利要求
1.一种从白花败酱草中分离纯化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，包括粗提物提取、粗提物的极性分段、硅胶柱层析三道工序，其特征在于工序(1)采用乙醇提取药材获取提取物，工序(2)采用有机溶剂对提取物分段萃取得到粗提物，工序(3)采用硅胶层析对粗提物进行分离纯化，即得化合物纯品。
2.按照权利要求1所述的一种从白花败酱草中分离纯化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，其特征在于工序(1)中乙醇为80％的药用乙醇，药材粗粉用80％乙醇提取两次，每次2.0小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至浸膏。
3.按照权利要求1所述的一种从白花败酱草中分离纯化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，其特征在于工序(2)中提取液萃取所用的有机溶剂为石油醚(60-90℃)和氯仿，先用石油醚萃取，再用氯仿萃取，得到氯仿萃取物。
4.按照权利1或3所述的一种从白花败酱草中分离纯化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，其特征在于工序(3)中氯仿萃取物进行硅胶柱层析，用氯仿—甲醇梯度洗脱，接收氯仿∶甲醇＝20∶1的洗脱流分，以此为进一步分离纯化样品。
5.按照权利要求4所述的一种从白花败酱草中分离纯化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮的提取工艺，其特征在于采用硅胶柱层析对氯仿∶甲醇＝20∶1的洗脱流分再次进行分离纯化，氯仿—甲醇梯度洗脱，接收氯仿∶甲醇＝15∶1的洗脱流分，即得化合物纯品。
6.化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羟基-6，8-二异戊烯基-二氢黄酮在抗肿瘤方面的应用。
全文摘要
本发明提供一种白花败酱草中具有明显抗肿瘤活性化合物(2S)－5，7，2′，6′－四羟基－6，8－二异戊烯基－二氢黄酮[(2S)－5，7，2′，6′－tetrahydroxy－6，8－di(γ，γ－dime－thylallyl)－flavanone]的提取工艺，具体包括粗提物提取、粗提物的极性分段、硅胶柱层析三个步骤，其特征在于采用乙醇提取药材获取粗提物，采用有机溶剂对粗提物分段萃取并结合硅胶柱层析得到纯品。本法具有制备量大、所得产品纯度高的特点(纯度高于99％)。并对该化合物进行了抗肿瘤活性筛选以验证其抗肿瘤活性。该化合物在制备抗肿瘤药物方面可得到应用。
文档编号A61K31/352GK1850816SQ20061002682
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者范国荣, 彭金咏, 柴逸峰, 吴玉田 申请人:中国人民解放军第二军医大学