专利名称：利用rac 1b抑制剂治疗退行性疾病的方法
利用RAC IB抑制剂治疗退行性疾病的方法
技术领域：
本发明涉及利用Rac lb抑制剂治疗退行性疾病的组合物和方法。 更具体地，本发明涉及治疗淀粉样P肽-相关的疾病、尤其是阿尔茨海默 氏病(Alzheimer's disease)的方法。本发明可以在疾病的不同阶段， 包括发病期，用于哺乳动物对象，尤其是人类对象。本发明还基于对 测试化合物抑制Raclb能力的确定，提供了制备、鉴定、筛选或者优 化用于退行性疾病治疗的化合物的方法。本发明还包括检测对象中退 行性疾病的存在、阶段或者性质的方法，包括评估所述对象的样品中 Rac lb的存在或者(相对)量。
阿尔茨海默氏病(AD)是一种进行性神经变性疾病，主要特征为 行为和认知缺陷。AD患者的大脑特点是胞外斑块P-淀粉样(A卩)肽和 胞内神经原纤维缠结的积聚，所述缠结包含过度磷酸化形式的T蛋白。
已经提出，在疾病发展的初始阶段，AP沉积和T蛋白过度磷酸化可 能作为对抗氧化应激的补偿反应和下游适应作用以确保神经元细胞的 存活。但是，在疾病进展期间，这两种介质的抗氧化活性发展成为代 表典型的获得性功能转换的促氧化活性，其能够参与构象改变和清除 机理的削弱。
本发明描述一种新的发现，所述发现确定了一种用于治疗性介入 的新靶标，以控制氧化应激并从而改进神经元存活性以及控制AP生成 和i蛋白过度磷酸化。
我们将DATAS用于阿尔茨海默氏病患者和对照的大脑活组织切 片。DATAS是一种获得专利权的基因表达谱技术(美国专利 6，251，590),其允许分析在两种病理生理情况之间差别剪接的转录产物。该分析显示患病大脑中Rac l基因的外显子3b剪接失调(实施例 1),导致特定剪接同工型Rac lb的过表达。Racl基因可以产生两种 可变剪接的mRNA，所述mRNA编码两种蛋白，Racla和Raclb(图1)。 Raclb是Racla的组成性活化形式，主要参与氧化应激级联的活化。出 乎意料的发现是组成性活化的Rac lb在患病组织中过度表达，因此与 AD患者大脑中氧化应激相对于健康个体的增加相吻合。
这表示第一次证明患有退行性疾病的患者大脑中Raclb失调和表 达增加。 ^
为了证实这种失调的存在和关联性，我们在大鼠皮质细胞上使用 不同浓度的A(325-35来检测Racl基因可变剪接中A(3-诱导的变化。(3 淀粉样肽A卩42是AD大脑中发现的老年斑的主要组分。AP肽作用于 神经元细胞以诱导氧化应激和胞内游离l丐含量的增加，这是调节AP毒 性以及继发兴奋性毒性的必要事件。其他机理是增加T蛋白的磷酸化和 诱导基因转录。A(325-35是包含氨基酸25到35的A(542片段，其复制 A3 42的毒性机理。大鼠皮质原代培养物对A卩中毒(intoxification)敏 感，这导致细胞活性的剂量-依赖性降低。如实施例2所示，我们的结 果出人意料地显示Ap治疗诱导剂量-依赖方式的RaclbmRNA表达。
为了进一步证实Ap治疗、氧化应激和Racl基因向Raclb同工型 的可变剪接的调节之间的联系，我们还利用叔丁基氢过氧化物(TBH) 或者6-羟基多巴胺(6-OHDA)，对SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞施加氧 化应激(实施例3)。我们的结果显示，在该神经元细胞系中，氧化应激 也以剂量-依赖的方式诱导RaclbmRNA表达。
因为Rac lb本身诱导氧化应激途径，在P淀粉样肽治疗后或者TBH 或6-OHDA治疗后诱导其表达很可能增强对细胞的应激。这表示第一 次证明(3淀粉样肽可能通过氧化应激能够诱导神经元细胞中的Rac lb 表达。本发明因此第一次证明Raclb可以被考虑为神经变性疾病的治疗 和诊断靶标。尤其是，本发明显示Raclb抑制剂代表了新的一类用于 退行性疾病治疗的分子。本发明还表明，Raclb代表了一种用于筛选或 者优化治疗退行性疾病的(新)化学实体的有价值的耙标。
因此，本发明的一个方面涉及一种治疗哺乳动物对象退行性疾病 的方法，包括向需要的对象施用有效量的Rac lb抑制剂。
本发明还涉及Raclb抑制剂在制备治疗变性疾病的药物组合物中 的用途。
本发明的另一个方面是一种抑制哺乳动物对象中淀粉样P肽产生 的方法，包括向需要的对象施用有效量的Raclb抑制剂。
本发明的另一个方面是一种抑制哺乳动物对象中淀粉样(3肽产生 的方法，基本上不改变Notch切割或者BACE活性，包括向需要的对 象施用有效量的Rac lb抑制剂。
本发明的另一目的涉及一种治疗哺乳动物对象的退行性疾病的方 法，包括向需要的对象施用一定量的抑制核酸化合物，所述量的抑制 核酸化合物有效降低所述对象中的Raclb表达(例如，转录、剪接和/ 或翻译)。
本发明的另一目的涉及一种治疗哺乳动物对象退行性疾病的方 法，包括向需要的对象施用一定量的抗体，所述量有效降低所述对象 中的Rac lb活性。
本发明的另一目的涉及一种治疗哺乳动物对象的退行性疾病的方 法，包括向需要的对象施用有效量的小药物化合物，所述有效量有效
6降低所述对象中的Rac lb活性。
为了在本发明中使用，Rac lb抑制剂可以在任意药学上可接受的 支持物或者赋形剂存在的条件下配制，它们可以单独使用，或者任选 与任意其他活性剂或者治疗方法一起组合使用。
本发明可用于治疗各种退行性疾病，尤其是淀粉样(3肽-相关疾病， 包括阿尔茨海默氏病，在不同的疾病阶段，任意哺乳动物对象中，优 选人类对象。 -
本发明还涉及检测氧化应激的存在或者易感性(predisposition)， 包括检测对象样品中Rac lb的存在或者(相对)量，Raclb的存在指 示氧化应激的存在或者易感性。
本发明还涉及检测对象中退行性疾病的存在、阶段或者对其的易 感性的方法，包括检测对象样品中Rac lb的存在或者(相对)量，Raclb 的存在指示所述疾病到存在、阶段或者易感性。
本发明的另一个目的是一种制备、鉴定、筛选或者优化候选化合 物的方法，包括一个确定候选化合物是否能够抑制Rac lb的步骤。
本发明还涉及一种制备、鉴定、筛选或者优化用于退行性疾病治 疗的候选化合物的方法，所述方法包括确定测试化合物是否抑制Rac lb， Raclb抑制表明测试化合物是用于退行性疾病治疗的候选化合物。 利用本领域本来己知的生物学/免疫技术，可以在体外(in vitro)、离 体(ex vivo)或者体内评估Rac lb抑制。优选的，进一步评估所述化 合物对Notch切割的活性，优选基本上不改变Notch切割的化合物。
本发明还涉及特异结合Rac lb多肽的抗体，以及特异结合Rac lb 基因或者RNA的核酸分子。
图1 : rac 1 (NM 006908)和rac lb (NM—006908)基因的结构示意 图。箭头表示PCR引物，3b表示raclb中的附加外显子3b。
图2 : p淀粉样肽对Raclb的诱导。用指定剂量的A(3处理大鼠原 代皮质细胞24小时。所示琼脂糖凝胶代表相同细胞中rac 1和rac lb 的PCR扩增。
图3:不同氧化应激对Rac lb的诱导A:过氧化氢物叔丁基氢过 氧化物(TBH); B: 6-羟基多巴胺(6-OHDA)。柱状图表示用指定剂量的 TBH或者6-OHDA处理24小时的SH-SY5Y细胞的细胞存活性，利用 LDH分析确定。所示琼脂糖凝胶代表相同细胞中racl和raclb的PCR扩增。
发明具体内容
本发明尤其根植于以下的意外发现，即在患有退行性疾病的对象 脑组织中，racl/raclb比例随着Racl高度活化的变异体Raclb的出现 发生偏倚。因此本发明涉及利用Racl作为退行性疾病的治疗或者诊断 介入以及开发活性化合物的靶标的组合物和方法。
退行性疾病
术语退行性疾病包括任意神经变性疾病，尤其是淀粉样(3肽-相关 疾病。这些包括，具体是，由淀粉样(5肽尤其是AP40和/或AP42的 增加或者异常生成引起的或者与其有关的所有疾病。
阿尔茨海默氏病(AD)是最常见的神经变性疾病，特征为记忆和 认知能力的进行性丧失。AD的病理特征为存在淀粉样斑块、胞内神经 原纤维缠结和显著细胞死亡。e-淀粉样肽(A13 )是AD大脑中发现 的老年斑的主要组分。AP的42-氨基酸形式(A3 42)在大脑中的过 量生成、胞内积聚、聚集和沉积与家族性AD的早期发病有关。此外， 胞外A3 42在体外和体内对神经元显示有毒性(Selkoe, D. J.综述
8(2001) Physiol. Rev. 81， 741-766)。 AP通过膜整合蛋白，淀粉样前体蛋 白(APP)，通过至少两种翻译后途径蛋白水解而产生。APP的促淀粉 状变切割是P-分泌酶(BACE)启动的APP顺序加工，其在腔内域或 者细胞表面内切割APP，产生AP的N末端。这种切割产生数种膜结 合的蛋白水解C端片段(CTF)，例如99残基0 -CTF (也称为C99)，以 及分泌的APP胞外域sAPP J3 。随后通过Y -分泌酶对CTF的膜内切割 产生AP的C末端，生成AP40或者AP42。残基40-42的切割称为 Y-切害!J，残基49-52的切割称为e-切割。排除AP产生的APP非促淀 粉状变切割，在被认为主要发生于质膜上的反应中由a-分泌酶， 一种 解聚素和金属蛋白酶10 (ADAM-10)和ADAM-17所介导。这种a-分泌 酶的蛋白水解切割发生在AP区内，产生可溶性APP(sAPPa)，主要的 加工产物和残余的膜结合10-kDaCTF(CTFa也称为C83)。和C99相 似，C83是Y-分泌酶的底物，其切割产生非促淀粉状变p3片段。APP 还是半胱天冬酶活性的底物，所述半胱天冬酶活性切割其溶质结构域。
因此这类淀粉样P肽-相关疾病的实例包括选自以下疾病的任意疾 病或者病症阿尔茨海默氏病(例如，用于帮助预防或者延迟阿尔茨 海默氏病的发病，用于帮助减缓阿尔茨海默氏病的进展，用于治疗患 有轻度认知障碍(MCI)的患者和在会从MCI发展到AD的患者中防 止或者延迟阿尔茨海默氏病的发病)，轻度认知障碍(MCI)，唐氏综 合症，有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血，脑淀粉样血管病和其潜 在后果(例如，单次和复发性叶出血)，退行性痴呆，包括混合的血 管和退行性起源的痴呆，与帕金森氏症有关的痴呆，与进行性核上性 麻痹有关的痴呆，与皮质基底退化有关的痴呆，或者弥漫性露易小体 型阿尔茨海默氏病。
治疗
在本申请的上下文中，术语"治疗"包括治疗性和预防性治疗。 尤其是，可以在疾病非常早的阶段，或者在早前发病前，或者在其显 著进展后，使用化合物。术语"治疗"尤其表明患者负担的减轻，例如预防或者延迟疾病的发病或者疾病进展，恢复或者增加对象的认知 功能或者记忆力，降低氧化应激，延迟APP加工，等等。
Raclb
Racl是来自Rho家族例如Rho和Cdc42的小GTP-结合蛋白。这 些小G蛋白通过GTP/ GDP交换活化，调控多种细胞功能例如基因表 达、细胞骨架重组和小泡/分泌运输。活化的CDC42或者Rac然后激活 PAKSer/Thr激酶家族。近来研究显示Rho参与应激纤维的形成，而活 化的Cdc42诱导丝足的形成，所述丝足是包含肌动蛋白束的指状延伸， Rac调控片状伪足或者褶皱(mffles)的形成，所述片状伪足或者褶皱 是经常沿着细胞边缘形成的窗帘样延伸(综述参见Hall， 1998， Science 279,509-514)。在大脑中，小G蛋白参与神经元的形态改变，所述神经 元定位于生长锥、轴突、树突状主干和脊柱(van Leeuwen, F.N., van Delft， S.， Kain， H.E.， van der Kammen， R.A.，禾。Collard, J.G. (1999) Nat. Cell Biol. 1,242-248)。在AD大脑中，与年龄匹配的对照相比，所选的 神经元群体中神经元Cdc42/Rac上调，与致病过程和神经元退化有关 (Zhu, X., Raina, A.K.， Boux, H.， Simmons, Z. L， Takeda, A.,禾口 Smith, M.A. (2000) Int. J. Dev. Neurosci. 18,433-437)。在成熟的大脑中，Racl， 而不是Rho或Cdc42，存在于神经元膜的筏结构域(Kumanogoh， H.， Miyata， S.， Sokawa, Y.，禾卩Maekawa, S. (2001) Neurosci. Res. 39， 189-196)。此外，近来的无偏定量蛋白组学研究显示Racl是筏-结合蛋 白(Foster, L. J.， De Hoog, C. L.,和Mann， M. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci U S A 100, 5813)。其他研究显示Racl的活化伴随其快速募集到脂 筏，而Cdc42未被募集到筏，但被筏-结合部分活化，并且更重要的是， Racl，而不是Rho或Cdc42，调节高尔基体-衍生的脂筏的组装和输出 到细胞膜(Field, K. A" J. R. Apgar， E. Hong-Geller, R. P. Siraganian， B. Baird,禾口 D. Holowka. (2000) Mol. Biol. Cell 11， 3661 ; Rozelle， A. L., L. M. Machesl〈y, M. Yamamoto, M. H. Driessens， R. H. Insall, M. G. Roth, K. Luby-Phelps, G. Marriott, A. Hall,禾卩H. L. Yin. 2000 Curr. Biol, 10:311)。Raclb是Racl的特定剪接形式，其中保留了外显子3b。本申请提 供Raclb的序列，以及外显子3b的序列(参见SEQIDNO: 12的核苷 酸51-170)。这些序列在公共基因文库中也有提供。
在本发明的上下文中，术语Raclb RNA表示任意RNA序列，编 码或者非编码，成熟或者不成熟，最终导致Raclb多肽的表达。
术语"Racl基因"表示编码Racl多肽的任意核酸。它可以是基 因组的(gDNA)、互补的(cDNA)、合成或者半合成的DNA、 mRNA、 合成RNA等等。它可以是重组或者合成核酸，利用生物来源、可获得 的序列或者工业材料，通过本领域技术人员已知的技术制备，例如人 工合成，扩增，酶切割，连接，重组，等等。尽管本发明可能存在不 同的形成，但Rac 1基因通常以双链形式存在。Racl基因的序列在某 些数据库已有提供，例如，特别是，RefSeq， n° NM 009007。本发明 的其他Racl基因序列可以从样品分离，或者收集，或者可以合成。
术语Raclb多肽尤其表示包括外显子3b编码的氨基酸的任意Racl 多肽。术语Raclb多肽还包括，广义来说，上述鉴定的序列的任意生 物活性天然变异体，由例如多态性、突变，插入、等等造成。
Rac lb抑制剂
在本发明的上下文中，术语"Raclb抑制剂"表示降低或者阻断 Rac lb的活性或者表达的任意化合物或处理。更优选的Raclb抑制剂 是抑制Rac lb-依赖的细胞骨架重排的化合物。最优选的Raclb抑制剂 是选择性抑制剂，例如，它们能够与Rac lb-特异性结构域结合或者反 应，尤其是外显子3b的全部或者部分。优选的Rac lb抑制剂基本上不 直接影响cdc42禾口/或RhoA，即，基本上不分别与cdc42和/或RhoA相 互作用。这类Raclb抑制剂的具体实例包括特异结合Rac lb或者其结构 域、尤其是外显子3b或者其结构域的任意化合物。这类结合化合物包 括，例如，任意抑制性核酸，比如反义RNA，核酶，iRNA， siRNA， ssRNA，微小RNAs，等等，或者任意对应的DNA、 PNA等等。这类 抑制性核酸优选包括与Racl基因的外显子3b的全部或者部分互补的 序列，从而预防、阻断或者降低其在细胞中的转录或者翻译。这类抑 制性寡核苷酸的具体实例在本申请的下文中公开。
这类Rac lb抑制剂的,另一个实例是结合Rac lb的抗体(或者其片 段或者衍生物)。这类抗体通常结合包括在Racl的外显子3b编码的 氨基酸内的表位。抗体可以是多克隆的，或者优选单克隆的。抗体片 段包括，例如，Fab片段，Fab'2片段，CDR区，等等。抗体衍生物包 括单链抗体，人源化抗体，人抗体，双功能抗体，等等。
一种具体的Raclb抑制剂是抗体，优选单克隆抗体(或者其衍生 物或者片段)，其特异结合包括在Rac lb的外显子3b内(即，完全或 者部分地包括在内)的表位。甚至更优选本发明涉及一种抗体，优选 单克隆抗体(或者其衍生物或者片段)，其特异结合包括在SEQ ID NO : 13内的表位。
本发明的另一个方面是一种抗体，优选单克隆抗体(或者其衍生 物或者片段，例如CDR序列)，其特异结合Raclb，该抗体通过用包 括SEQIDNO: 13的多肽免疫非人哺乳动物来制备。本发明的另一个 目的是包括SEQ ID NO: 13的多肽或者其至少5个连续氨基酸的含表位 片段。更具体地，本发明的一个目的是长度小于50氨基酸的多肽，包 括SEQ ID NO : 13或者其至少5个连续氨基酸的含表位片段。
可以通过本领域公知的程序制备抗人Rac lb蛋白的抗体。例如， 可以将蛋白单独或者与合适蛋白偶联注射到非人动物中来制备多克隆 抗体。在合适时段后，对动物取血，利用本领域已知的技术回收和纯化血清(参见Paul， W.E. "Fundamental Immunology" Second Ed.(基石出 免疫学，第二版)Raven press, NY， p. 176, 1989; Harlow等人"Antibodies: A laboratory Manual"(抗体:实验室手册)，CSH Press, 1988 ; Ward等 人(Nature 341 (1989) 544)。例如，通过Kohler-Millstein的技术 (Kohler-Millstein， Galfre, G.,禾口 Milstein， C， Methods Enz. 73 p. 1 (1981))，可以制备单克隆抗体，其涉及免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞 的融合。例如，可以将如上所述的抗原注射入合适的非人哺乳动物(例 如，小鼠)直至在血清中检测到多克隆抗体反应。可以对哺乳动物再 次加强，取出脾，根据各种方法进行与骨髓瘤的融合。首先通过它们 结合免疫抗原的能力，然后通过它们从细胞免疫沉淀rac lb的能力， 可以检测独立个体存活杂交瘤细胞的抗Rac lb抗体分泌。
治疗用途
本发明的一个具体目的涉及一种治疗哺乳动物对象的退行性疾病 的方法，包括向需要的对象施用有效量的Rac lb抑制剂。优选，化合 物的给药量有效减少所述对象中的APP加工。
本发明的另一个方面是一种抑制哺乳动物对象中淀粉样P肽产生 的方法，包括向需要的对象施用一定量的Raclb抑制剂，所述量的 Raclb抑制剂有效减少所述对象中的APP加工。
本发明的另一个方面是一种抑制哺乳动物对象中淀粉样P肽产生 的方法，基本上不改变Notch切割或者BACE活性，包括向需要的对 象施用有效量的Rac lb抑制剂。
本发明的一个具体目的涉及一种治疗哺乳动物对象的阿尔茨海默 氏疾病的方法，包括向需要的对象施用一定量的Rac lb抑制剂，所述 量有效减少所述对象中的APP加工。
本发明的另一个方面是一种抑制哺乳动物对象中淀粉样P肽产生
13的方法，基本上不改变Notch切割或者BACE活性，包括向需要的对 象施用有效量的Rac lb抑制剂。
为了在本发明中使用，所述化合物可以采用药物组合物的形式， 所述药物组合物包括所述化合物中的至少一种和药学上可接受的赋形 剂或者支持物。化合物可以配制为各种形式，包括固态和液态，例如 胶囊，片剂，凝胶，溶液，糖浆剂，悬浮液，粉剂，气雾剂，膏剂，
本发明的这类药物组合物可以包含生理上可接受的稀释剂，填充 剂，润滑剂，赋形剂，溶剂，粘合剂，稳定剂，等等。可用于组合物 的稀释剂包括但不限于磷酸二钙，硫酸钙，乳糖，纤维素，高岭土， 甘露醇，氯化钠，干淀粉，糖粉和用于延长释放的片剂-羟丙基甲基纤 维素(HPMC)。可用于组合物的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶和填 充剂，例如蔗糖，葡萄糖，右旋糖和乳糖。
可用于组合物的天然和合成胶包括但不限于海藻酸钠，印度胶， 羧甲基纤维素，甲基纤维素，聚乙烯基吡咯垸酮和硅酸镁铝。可用于 组合物的赋形剂包括但不限于微晶纤维素，硫酸钙，磷酸氢钙，淀粉， 硬脂酸镁，乳糖和蔗糖。可以使用的稳定剂包括但不限于多糖例如阿 拉伯胶，琼脂，藻酸，瓜耳豆胶和黄芪胶，两性物质例如明胶和合成 和半合成聚合物例如卡波姆树脂、纤维素醚和羧甲基几丁质。
可以使用的溶剂包括但不限于林格氏溶液，水，蒸馏水，溶于水 的50%二甲基亚砜，丙二醇(未搀水的或者溶于水的)，磷酸盐缓冲 盐水，平衡的盐溶液，乙二醇和其他常规液体。
化合物给药的剂量和给药方案将根据剂型、给药方式、待治疗的
病症和待治疗患者的详细情况而变化。因此，最好通过常规试验方法 在当时当地确定最佳治疗浓度。还可以肠道使用本发明的化合物。口服，本发明的化合物合适采
用每天每kg体重10 yg到300 mg的速度给药。所需剂量可以以一份
或者多份给药。对于口服给药，合适的形式是，例如，胶囊，片剂， 凝胶，气雾剂，丸剂，糖衣剂，糖浆剂，悬浮液，乳液，溶液，粉剂
和颗粒； 一种优选的给药方法是利用包含1 mg到大约500 mg活性物 质的合适形式。
本发明的化合物还可以非肠胃给药，采用用于静脉内、皮下或者 肌内输注或者注射的溶液或者悬浮液形式。在这种情况下，本发明的 化合物通常以每天每kg体重大约10 iig到10 mg的速度给药； 一种 优选的给药方法包括利用包含每ml大约O.Ol mg到1 mg活性物质的溶 液或者悬浮液。
本发明的化合物还可以施用于眼睛，采用用于玻璃体内或者眼眶 后(retro-orbitary)注射的溶液或者悬浮液形式。在这种情况下，本发 明的化合物通常以每天每kg体重大约10 Wg到10 mg的速度给药； 一种优选的给药方法包括利用每ml包含大约O.Ol mg到1 mg活性物质 的溶液、悬浮液或者凝胶。
可以釆用与治疗CNS疾病的其他已知药剂基本上相似的方式使用 所述化合物。给药的剂量，不论是单次剂量、多次剂量或者每日剂量， 将随着使用的具体化合物而变化，因为化合物的不同效力、选择的给 药途径、接受者的大小、疾病类型和患者病症的性质。待给药的剂量 不经过明确的限定，但它通常是有效的量，或者与活性药物代谢释放 时给药制剂产生的实现其所需的药理和生理作用的药理活性游离形式 的摩尔基础等同。CNS疾病治疗领域的有经验医师或者医生无需过度 实验就能够确定用于本发明化合物有效给药的合适方案。
所述化合物可以根据不同途径给药，通常通过口服途径或者通过注射，例如局部或者全身注射。口服、静脉内、腹膜内或者皮下给药 是优选的，虽然其他给药途经也可以使用，例如肌内，真皮内，等等。 此外，如果合适的话，可以进行重复注射。
本发明的另--个方面涉及Rac lb抑制剂在制备抑制哺乳动物对象 中淀粉样(3肽产生的药物组合物中的用途，所述哺乳动物对象患有退行
性疾病，尤其是阿尔茨海默氏病。
本发明的另一个目的是Rac lb抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病 的药物组合物中的用途。
药物筛选
本发明第一次涉及Raclb调节APP加工和AP产生。因此，本发 明显示，Rac lb代表筛选用于退行性疾病治疗的药物的有价值靶标。
这方面，本发明的一个具体目的涉及制备、鉴定、筛选或者优化 用于淀粉样P肽-相关疾病治疗的候选化合物的方法，所述方法包括确定 测试化合物是否抑制Rac lb， Racl抑制是测试化合物是用于淀粉样(i 肽-相关疾病治疗的候选化合物的指征。根据本领域本来已知的各种生 物分析法，可以在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或者体内(in vivo) 评估Raclb抑制。
在一个具体实施方式
中，所述方法包括将测试化合物与Rac lb(或 者其片段，通常包括外显子3b的全部或者部分)接触，并确定化合物 是否结合Raclb或者其片段。
在另一个具体实施方式
中，所述方法包括将测试化合物与Rac lb 接触，并确定化合物是否抑制Rac lb-依赖的细胞骨架重排。
在一个具体实施方式
中，利用效应物PAK1下拉(pull-down)分
16析来评估Rac lb抑制。
更优选地，进一步评估所述化合物对其他靶标的活性，尤其是
Notch加工途径(例如，Notch切割)、BACE或者其他小GTP-结合蛋白(例 如，Cdc42禾P/或RhoA)。最优选的化合物是那些基本上不改变Notch 切割和/或基本上不直接抑制BACE、和/或基本上不直接抑制Cdc42和 /或RhoA的化合物。
可以在体外任意合适的装置中进行所述分析，不同的测试化合物 可以平行或者混合分析。
诊断
本发明还涉及检测氧化应激的存在或者易感性的方法，包括检测 对象样品中Rac lb的存在或者(相对)量，Rac lb的存在表示氧化应 激的存在或者易感性。
本发明还涉及检测对象的退行性疾病的存在、阶段或者对其易感 性的方法，包括检测对象样品中Rac lb的存在或者(相对)量，Rac lb 的存在表示所述疾病的存在、阶段或者易感性。
在更优选的实施方式中，上述方法包括测量Rac la和Rac lb同工 型的比例，所述比例内的变化提示疾病的易感性、存在或者阶段。更 具体地，所述方法包括检测包括SEQISNO: 1-8或者12中的任意一种 的核酸分子、或者其互补链或者对应多肽的存在。这类核酸分子和多 肽也代表本发明的特定目的，以及其任意独特的片段或者类似物；特 异结合这类多肽的抗体和特异性核酸探针或者引物。
可以根据本领域本来已知的技术进行检测，例如扩增，杂交，测 序，免疫技术，等等。这方面，本发明公开了具体的寡核苷酸，其特 异区分Rac la和Rac lb，体现了本发明的特定目的。这类寡核苷酸优选结合通过外显子3b剪接或者外显子3b保留产生的接合区(junction region)，和/或结合外显子3b本身。这类寡核苷酸的实例提供于SEQ ID NO: 9-11。本发明包括与Racl外显子3b或者通过保留或者剪接所 述外显子3b产生的接合区特异结合的任意寡核苷酸(优选单链，包括5 至60个碱基，更优选5-50、 5-40、 10-30、 10-25)。
NCBI已经提供Racl的完整人基因组序列，登录号为AJ132695。 外显子3b对应于所述序列的核苷酸位置18413-18530，其复制于下(SEQ ID NO: J2)，从位置18361到18600 (外显子3b采用粗体)
18361 cagtgactta gcttctacac ctgtgactaa ccattttcat tccattctac agctttgaca 18421 attattctgc caatgttatg gtagatggaa aaccggtgaa tctgggctta tgggatacag
18481 ctggacaaga agattatgac agattacgcc ccctatccta tccgcaaaca
gtaaggattg
18541 cagctgactt ttaatgtgtc ttttagagta tataattctc gagcgcttaa ttagtgcatg
本发明的特异性寡核苷酸包括与接合区特异杂交的序列，所述接 合区位于RNA分子内Rac lb外显子3b和侧翼序列之间。这类寡核苷 酸通常包括对外显子3b的5'或者3'末端特异的至少5个核苷酸的结构 域，其直接地融合到至少5个核苷酸的结构域，所述结构域分别对外 显子3b的所述5'或者3'末端的侧翼序列具有特异性。本发明的其他寡 核苷酸与外显子3b剪接产生的接合区特异杂交，S卩，与下列靶接头杂 交tctacgtaag。这类寡核苷酸可以用作引物或者探针，以扩增或者检 测样品中Raclb的存在和/或(相对)量，并体现本申请的特定目的。 本发明的其他特异性寡核苷酸与包含在外显子3b内(即，SEQ ID NO: 12的核苷酸残基51-170内)的序列特异杂交。
本发明的其他方面和优点将在下面的实施例中公开，其应被认为 是说明性的，不是用于限制本申请的范围。所有引用的出版物或者申 请在此完整引入作为参考。实施例
实施例1 : AD大脑中Raclb DATAS标记的鉴定 用于表达谱研究的DATAS技术(DATAS专利号6251590)被用 来比较特征明确的AD患者和健康对照的前额叶皮质中存在的可变的 RNA剪接事件。对照对象未患痴呆、年龄匹配并且死后延迟时间相似， 以筛出表达谱研究中与年龄-相关和mRNA稳定性-相关的改变。
—Racl改变的鉴定 鉴定的克隆中是对应于RAS-相关的C3肉毒素底物l (Racl)的 mRNA的5个片段，表明患有AD的患者大脑中Racl剪接事件的失调。
DATAS片段是EXH-NADC4422-01 ，长度354 (SEQ ID NOl)， EXH- NADC4506-01 (SEQ ID NO 2),长度344， EXH-NADC4513-01 ， 长度354 (SEQ ID NO 3), EXH-NADC4524-01 ,长度354 (SEQ ID N04), EXH-NADC4531-01 ， 长度 348 (SEQ ID NO 5)， EXH-NADC4534-01,长度356 (SEQ ID NO 6)，禾Q EXH-NADC4550-01 长度353 (SEQ ID NO 7)。这些DATAS片段组织成簇，簇13983—2 (SEQ ID NO 8)对应于RefS叫库序列的核苷酸246到782，参照编号 NM—006908。该区域包括可变剪接的57 bp区(外显子3b)，所述57 bp 区存在于转录产物变异体Raclb中，所述Raclb在RefSeq库序列中标 示为NM_018890 (图1)。
实施例2 :诱导A[3剪接Raclb
大鼠原代皮质细胞培养物对AP毒性敏感，其神经毒性涉及不同的 机理例如钙稳态失调、ROS的积聚、继发兴奋性毒性和半胱天冬酶活 化(Zhang等人，J N匿ochem 1996, 67 (4) 1595-1606)。 Ap肽溶于100% HFIP (1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇)，然后干燥，重悬于100%DMSO，在不 含酚红的DMEM/F12中重新稀释。通过在37"C孵育72小时熟化溶液， 然后向7天培养物中添加AP寡聚物24小时。孵育24小时后，利用
19Trizol处理细胞以进行RNA提取。利用下列引物使用巢式PCR方法扩 增rac lb:腿一006，一F1: ATGCAGGCCATCAAGTGTGTGG (SEQ ID NO 9), nm—006908—Rl: TGGCATTGAGTGCGAAGGC (SEQ ID NO 10), nm一006908—F2: AAAGACAAGCCGATTGCCG (SEQ ID NO 11)。利用 引物nm_006908—Fl和nm—006908一R1 ，根据下面所述的第一轮PCR 方案扩增Racl。在这些条件下，在凝胶中未检测到rac lb，因为其单 次PCR扩增后的量较低，而在巢式PCR中利用引物nm—006908_F2和 nm一006卯8—Rl可以很容易检测到。
利用随机引物p(dN)6 (Invitrogen)， 1 mM dNTP混合物，1单位/ u 1 RNAse OUT核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen)禾P 0.5单位/ u 1 Transcriptor逆转录酉每进行逆转录(Transcriptor Reverse Transcriptase, Roche)。利用Platinum Taq DNA高保真聚合酶(Invitrogen)以及0.2 mM dNTP混合物，1.5 mM MgS04, 0.25 /xM各引物(nm—006908—Fl和 nm—006908JU)禾卩0.1单位/jid Platinum 高保真Taq进行第一轮 PCR，如下进行30个循环的扩增变性94'C 30秒，退火60°C l分 钟，延伸68°C 1分钟。利用MicroSpinTM S-300 HR柱(Amersham Bio sciences)纯化PCR扩增子，并利用PCR Master Mix (Promega)和0.2 /zM 各引物(nm—006908—F2和nm—006卯8—Rl)进行第二轮PCR,如下进行 30个循环的PCR扩增94。C变性30秒，6(TC退火1分钟，72"延 伸1分钟。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶分辨。
结果
为了检测AP处理对rac lb的mRNA水平的影响，将皮质细胞与 不同的A(3浓度接触24小时，在巢式PCR方法中特异扩增rac lb，所 述巢式PCR方法顺序使用引物nm—006908—Fl和nm—006908—Rl ，然后 引物nm—006908—F2和nm—006908—Rl。扩增GAPDH作为对照。在两 个独立培养物中获得的结果表明，在11.25和22.5 uM的Ap浓度下， 观察到raclb mRNA的剂量依赖性积聚(图2)。这表明Ap改变 racl/raclb比例，使得racl剪接随着掺入可变外显子3b而偏移。因此，低水平的Ap刺激Racl的高活化变异体出现，主要是GTP-结合的，带
有选择性下游信号。
实施例3 :诱导氧化应激对Raclb的剪接
SKNSH亚克隆SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)是一种被广泛接受的 用于研究氧化应激介导的神经毒性或者神经保护的模型(Zuo等人. 1995)。
有机过氧化氢物叔丁基氢过氧化物(TBH)是11202的稳定类似物。 TBH按照以下事件顺序诱导凋亡，即起始于ROS产生，氧化还原失衡 的丧失，线粒体细胞色素C释放和半胱天冬酶-3的活化。
通常用于产生帕金森氏症动物模型的儿茶酚胺-特异性神经毒素 6-羟基多巴胺(6-OHDA)是多巴胺的羟基化类似物，其导致儿茶酚胺 能细胞的凋亡。该神经毒素诱导凋亡，其毒性与ROS生成有关。可能 涉及数种机理(1)通过自氧化产生活性-氧ROS， (2)单胺氧化酶 脱氨后的过氧化氢产生，(3)线粒体复合物I和IV的直接抑制和蛋白 降解和泛素-蛋白酶体系统活化(Youdim等人.2001)。
为了检验ROS生成是否影响racl/raclb比例，将SH-SY5Y细胞 与指定浓度的不同ROS-诱导剂接触24小时，利用LDH分析(Cytotox96， Promega)检测细胞存活性。
SH-SY5Y细胞接种于24孔板(ATGC， France),初始密度为3X 105 细胞/ L。 24小时后，用指定浓度的不同ROS-诱导剂处理细胞。孵育 24小时后，进行LDH分析显示细胞存活性，并利用Trizol处理细胞以 进行RNA提取。
结果
为了检验ROS生成剂TBH和6-OHDA对racl和raclb的mRNA水平的影响，将SH-SY5Y细胞与指定浓度的不同ROS-诱导剂接触24 小时，利用引物nmj)06卯8—Fl和nm—006卯8—Rl共扩增racl和raclb ， 或者在巢式PCR方法中特异扩增raclb，所述巢式PCR方法顺序利用 引物nm—006卯8—Fl和nm—006卯8—Rl，然后是引物nm—006908—F2和 nm—006卯8—Rl。扩增GAPDH作为对照。
平行地，LDH分析监控相同细胞的细胞存活性。结果显示对于这 两种毒剂，对氧化应激racl水平没有变化(图3)。相反，当使用TBH 和6-0HDA的亚毒性浓度时，观察到rac lb的剂量依赖性积聚。这表 明低水平的氧化应激也改变racl/raclb比例使得racl剪接随着可变外 显子3b的掺入而偏移，因此刺激Racl的高活化变异体Raclb的出现。
权利要求
1. 一种治疗哺乳动物对象中退行性疾病的方法，包括向需要的对象施用有效量的Rac1b抑制剂。
2. —种抑制哺乳动物对象中淀粉样(5肽产生的方法，包括向需要 的对象施用有效量的Rac lb抑制剂。
3. 如权利要求1或者2所述的方法，其中所述化合物基本上不改 变Notch切割或者BACE活性。
4. 如权利要求1或者2所述的方法，用于治疗阿尔茨海默氏病。
5. —种制备、鉴定、筛选或者优化用于退行性疾病治疗的候选化 合物的方法，所述方法包括确定测试化合物是否抑制Rac lb， Rac lb 抑制表明测试化合物是用于退行性疾病治疗的候选化合物。
6. 如权利要求5所述的方法，包括将测试化合物与Raclb接触， 并确定该化合物是否结合Rac lb或者抑制Rac lb-依赖性细胞骨架重排。
7. —种检测氧化应激的存在或者易感性的方法，包括检测对象样 品中Raclb的存在或者(相对)量，Raclb的存在表明AP-相关氧化 应激的存在或者易感性。
8. —种检测对象中退行性疾病的存在、阶段或者易感性的方法， 包括检测对象样品中Rac lb的存在或者(相对)量，Raclb的存在表 明所述疾病的存在、阶段或者易感性。
9. 如权利要求8所述的方法，包括测量Rac la和Rac lb同工型的比例，所述比例内的变化表明疾病的易感性、存在或者阶段。
10. —种寡核苷酸或者一组寡核苷酸，其特异性区分Rac la和Raclb。
11. 一种单链寡核苷酸，包括5至60个碱基，其特异性结合Racl 外显子3b或者通过保留或者剪接所述外显子3b产生的接合区。
12. —种抗体，其结合包括在VGETYGKDITSRGKDKPIA( SEQ ID NO : 13)内的表位。
13. —种长度小于50个氨基酸的多肽，包括SEQIDNO: 13或者 其至少5个连续氨基酸的含表位片段。
全文摘要
本发明涉及用于治疗退行性疾病的组合物和方法。更具体地，本发明涉及利用Rac 1b抑制剂治疗淀粉样β肽-相关疾病尤其是阿尔茨海默氏病的方法。本发明可以在疾病的不同阶段，包括发病期，用于哺乳动物受试者，尤其是人类受试者。本发明还基于对测试化合物抑制Rac1b能力的确定，提供了制备、鉴定、筛选或者优化用于淀粉样β肽-相关疾病治疗的化合物的方法。
文档编号A61K31/7088GK101448508SQ200780004274
公开日2009年6月3日 申请日期2007年1月30日 优先权日2006年2月1日
发明者劳伦特·德西蒙, 塞韦里内·考塔德尔, 法比安·施魏格霍费尔, 维尔日妮·皮卡德 申请人:埃克森希特医疗股份有限公司