专利名称：一种纳米囊及纳米囊复合微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备用于骨肿瘤治疗的纳米嚢及纳米嚢复合微球的方法。
背景技术：
骨肿瘤治疗是集手术、化疗和放疗相结合的综合治疗，由于四肢恶性骨 肿瘤的保肢治疗，脊柱恶性骨肿瘤毗邻结构复杂，病灶难以彻底切除，术后 防止复发就成为越来越重要的问题，而这一问题和肿瘤切除后骨重建所需大 量植骨材料的缺乏仍是困扰外科医师的难题，是影响骨肿瘤治疗效果和治疗 观念发展的瓶颈，也是目前研究的热点和难点。目前对于骨肿瘤的治疗方法的研究主要集中在肿瘤切除后重建材料和 术后化疗给药方案及途径的研究两个方面，在骨重建替代材料方面目前主要 有自体骨、异体骨、骨水泥和各种人工假体等。术后化疗方案及用药途径方 面主要集中在开发高效低毒的药物或剂型，以及开发不同的给药途径方面。关于术后化疗药物的开发主要的研究方向分为两个方面， 一是研究具有 较高活性同时毒性较低的药物和剂型，目前关于这方面的研究国内外都开展的如火如茶，但还没有理想的药物和剂型应用到临床；另一方面是采用现有 具有良好抗肿瘤活性的药物通过改变其进入体内的方式，使其能够通过外科 植入需要用药的局部，通过药物緩释作用达到在局部具有较长时间的药物存 在，同时在緩释的具有较高的药物浓度，进而发挥较好的局部抗肿瘤活性， 同时由于緩释主要在肿瘤切除后活在在肿瘤所在部位，全身药物浓度相对较 低，因此化疗药物的全身毒副作用相对较小，通过对不同化疗药物的联合载 药可以进行局部联合化疗方案，进而实现较理想的治疗肿瘤作用。现在已经 有了多种的化疗药物緩释剂型的出现，但由于药物緩释时间和缓释的药物浓 度与骨肿瘤局部緩释用药的要求不吻合至今也没有在临床上广泛应用。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种纳米嚢及纳米嚢复合微球的制备 方法，所制备的纳米嚢及纳米嚢复合微球均具者峰值释放药物和平稳释放药 物的特点，体外对骨肉瘤细胞具有较好的长期杀伤作用，在其药物释放的过 程中与直接给药相似。为了解决上述问题，本发明提供了一种纳米嚢的制备方法，包括如下步骤步骤1:取100mg曱氨蝶呤加入到0.25M NaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的曱氨虫某呤石咸性溶液；将100 ~ 200mgPLGA (聚乳酸-羟基乙酸共 聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为20~40mg/ml的 PLGA - CH2C12溶液；步骤2:取20 ~ 100(il曱氨蝶呤碱性溶液注入0.5 ~ 4ml的PLGA - CH2C12 溶液中，超声乳化后得到W/O (水相/油相)初乳；步骤3:将上述初乳加入到1 ~ 4at% (质量百分比)胆酸钠0.5 ~ 4ml中， 超声乳化后得到W/O/W (水相/油相/水相)复乳；步骤4:将所得复乳置于10 ~ 100ml 0.5at。/。胆酸钠中在室温下减压蒸发， 除去CH2Cl2,即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于2~ 10。C下离心、沉淀，并洗去未 包裹的游离MTX (曱氨蝶呤)，纳米嚢粒沉淀用1 ~ 10ml双蒸水吹打分散 后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为3~ 10at%，冷冻干燥即得纳米嚢粒。优选地，在所述步骤2和步骤3中采用超声波细胞粉碎机进行超声乳化。优选地，在所述步骤4中采用旋转蒸发仪进行减压蒸发。本发明还提供了 一种纳米嚢复合微球的制备方法，包括如下步骤步骤a，制备纳米嚢，包括如下步骤步骤1:取100mg曱氨蝶呤加入到0.25MNaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的曱氨蝶呤碱性溶液；将100 ~ 200mgPLGA (聚乳酸-羟基乙酸共 聚物)溶于5ml 二氯甲烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为20~40mg/ml的PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)-CH2Cl2溶液；步骤2:取20 ~ 100^1的曱氨蝶呤碱性溶液注入0.5 ~ 4ml的PLGA -CH2Cl2溶液，超声乳化后得到W/O (水相/油相)初乳；步骤3:将上述初乳加入到0.5 ~ 4ml的1 ~ 4at。/。胆酸钠中，超声乳 化后得到W/0/W (水相/油相/水相)复乳；步骤4:将所得复乳置于10 ~ 100ml 0.5at。/。的胆酸钠中在室温下减 压蒸发，除去CH2Cl2,即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于2~ l(TC下离心、沉淀，洗去 未包裹的游离MTX (曱氨蝶呤)，纳米嚢粒沉淀用1 ~ 10ml双蒸水吹打分 散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为3 ~ 10at%，冷冻干燥即得纳米嚢粒；步骤6:将纳米嚢粒加入到10at。/。的聚乙二醇唬拍酸维他命E (VitaminETPGS)溶液中，充分搅拌混匀；步骤b,制备纳米嚢复合微球，即将100 ~ 250mgPLGA (聚乳酸-羟基 乙酸共聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成20 ~ 50mg/ml的溶 液，取2ml该溶液然后再加入5 15mg MTX (曱氨蝶呤)，用乳匀机分散 均匀，迅速倒入100ml 2 5at。/。聚乙烯醇溶液中，在常温下快速搅拌，再将 步骤6所制备的纳米嚢聚乙二醇琥珀酸维他命E溶液2ml快速倒入并强力搅 拌1~3秒后用微孔滤膜抽滤，用去离子水洗，最后干燥，即制得MTX纳 米嚢复合微球。优选地，在玦述步骤2和步骤3中采用超声波细胞粉碎机进行超声乳化。优选地，在所述步骤4中采用旋转蒸发仪进行减压蒸发。本发明所制备的纳米嚢具有如下优点纳米嚢颗粒大小均匀，粒径大小 为100 -220nm，表面光滑，载药量和包封率较高，制备工艺简单，药物释 放具有峰值释药和平稳释药的特点；本发明所制备的纳米嚢复合微球具有如下优点本纳米嚢复合微球的组 成内部由化疗药物纳米嚢组成，在微球降解的过程中可以释放出完整的化疗 药物纳米嚢微球，纳米嚢复合微球粒径大小为40~50,，微球得载药量为 5.1~8.4%，包封率为65~85%,药物释放具有峰值释药和平稳释药的特点，有效抗肿瘤活性药物释放时间达26 32天。从而使微球释药可以出现 峰值释药和平稳释药交替出现的特点，符合抗肿瘤药物的最佳用药特点，并 且在释药过程中有2~3个高峰释药节段，平稳释药节段在植入局部即可维 持需要的抗肿瘤浓度，峰值释药节段在局部可以达到有效抗肺瘤药物浓度的 20倍，而全省毒副作用较小。
具体实施方式
实施例1(纳米嚢的制备) 本实施例的纳米嚢的制备工艺具体如下步骤1:取100mg曱氨蝶呤加入到0.25M NaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的甲氨蝶呤碱性溶液；将100mgPLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物) 溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为20mg/ml的(聚乳酸 - 羟 基乙酸共聚物)-CH2Cl2溶液；步骤2:取20^1的MTX碱性溶液注入0.5ml的PLGA - 012(:12溶液， 用超声波细胞粉碎机120w连续超声15s乳化后，得到W/O初乳；步骤3:将上述初乳加入到0.5ml的lat。/。胆酸钠中，用超声波细胞粉碎 机120w脉冲超声15s,每次间隔ls乳化后，得到W/0/W复乳；步骤4:将所得复乳置于10ml含有0.5at。/o胆酸钠中，于旋转蒸发仪中 室温减压蒸发，除去CH2Cl2，即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于2。C下11000xg离心45min,弃去 上清液，沉淀，用蒸馏水洗2次，除去未包裹的游离MTX,纳米嚢粒沉淀 用lml双蒸水吹打分散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为3at%，冷冻干燥 即得纳米嚢粒。经过本实施例所制备的纳米嚢的粒径为160士6.2nm。 MTX纳米嚢为球形， 表面光滑，纳米粒大小分布均勻，纳米粒稳定性经ANOVA分析冻干前后粒径 无显著性差异，纳米粒稳定性良好，纳米粒平均载药量为1.3±0.08%;药 物包封率为59.2±0.08%;化疗药物纳米嚢体外药物释放测定，12h药物释 放9. 41 ± 2. 26 % , 24h药物释放16. 56 ± 2. 39 % ， 96h药物释放34. 49 ± 9. 30% ; 20天药物释放86. 4 ± 11. 02 % 。 MTX-NP精密度考察样品日内、日间精 密度RSD均< 5 % 。实施例2 (纳米嚢的制备)本实施例的纳米嚢的制备工艺具体如下步骤1:取100mg曱氨蝶呤加入到0.25M NaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的曱氨蝶呤碱性溶液；将150mgPLGA (聚乳酸-轻基乙酸共聚物) 溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为30mg/ml的(聚乳酸-羟 基乙酸共聚物)-CH2CV溶液；步骤2:取的MTX碱性溶液注入0.5ml的PLGA - CH2Cl2溶液， 用超声波细胞粉碎机120w连续超声15s乳化后，得到W/0初乳；步骤3:将上述初乳加入到2ml的lat。/。胆酸钠中，用超声波细胞粉碎机 120w脉冲超声15s，每次间隔ls乳化后，得到W/0/W复乳；步骤4:将所得复乳置于40ml含有0.5at。/o胆酸钠中，于旋转蒸发仪中 室温减压蒸发，除去CH2Cl2,即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于4。C下11000xg离心45min，弃去 上清液，沉淀，用蒸馏水洗2次，除去未包裹的游离MTX,纳米嚢粒沉淀 用5ml双蒸水吹打分散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为5at%,冷冻干燥 即得纳米嚢粒。经过本实施例所制备的纳米嚢的粒径为121土5.4nm。 MTX纳米嚢为球形， 表面光滑，纳米粒大小分布均勻，纳米粒稳定性经ANOVA分析冻干前后粒径 无显著性差异，纳米粒稳定性良好，纳米粒平均载药量为1.4±0. 11%;药 物包封率为51.2±0. 14%;化疗药物纳米嚢体外药物释放测定，12h药物释 放10. 41 ± 2. 33 % , 24h药物释放15. 12 ± 2. 44 % ， 96h药物释放36. 32 ± 8. 51 %; 20天药物释》文90. 4 ± 9. 62 % 。 MTX-NP精密度考察样品日内、日间精密 度RSD均< 5 % 。实施例3 (纳米嚢的制备)本实施例的纳米嚢的制备工艺具体如下步骤1:取lOOmg甲氨蝶呤加入到0.25M NaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的曱氨蝶呤碱性溶液；将200mgPLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物) 溶于5ml 二氯甲烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为40mg/ml的(聚乳酸-羟 基乙酸共聚物)-CH2Cl2溶液；步骤2:取100|xl的MTX碱性溶液注入0.5ml的浓度为40mg/ml PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)-CH2CV溶液，用超声波细胞粉碎机120w连 续超声15s乳化后，得到W/0初乳；步骤3:将上述初乳加入到4ml的lato/。胆酸钠中，用超声波细胞粉碎机 120w脉冲超声15s,每次间隔ls乳化后，得到W/0/W复乳；步骤4:将所得复乳置于100ml含有0.5at。/。胆酸钠中，于旋转蒸发仪中 室温减压蒸发，除去CH2Cl2,即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于l(TC下11000xg离心45min，弃去 上清液，沉淀，用蒸馏水洗2次，除去未包裹的游离MTX，纳米嚢粒沉淀 用10ml双蒸水吹打分散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为10at%，冷冻干 燥即得纳米嚢粒。经过本实施例所制备的纳米嚢的粒径为186士11.4nm, MTX纳米嚢为球 形，表面光滑，纳米粒大小分布均匀，纳米粒稳定性经ANOVA分析冻干前后 粒径无显著性差异，纳米粒稳定性良好，纳米粒平均载药量为1.3 ±0.21%; 药物包封率为61.2±2.23%;化疗药物纳米嚢体外药物释放测定，12h药物 释放9. 41±1. 74%, 24h药物释放16. 12± 1.85% , 96h药物释放33. 72 ± 6.98%; 20天药物释放88.4±6.72%。 MTX-NP精密度考察样品日内、日间 精密度RSD均〈5%。实施例4 (纳米囊复合微球的制备)步骤a,制备纳米嚢，按照实施例l的方式制备，将所制备的纳米嚢粒 加入到10。/。的聚乙二醇唬拍酸维他命E (VitaminETPGS)溶液中，充分搅拌 混匀；步骤b，制备纳米嚢复合微球，即先将100mgPLGA (聚乳酸-羟基乙 酸共聚物)溶于5ml二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成20mg/ml的溶液，取 2ml浓度为20mg/ml的PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)-012(312溶液， 然后再加入5mgMTX(曱氨蝶呤)，用乳匀机分散均匀，迅速倒入100ml 2at% 聚乙烯醇溶液中，在常温下快速搅拌，再将步骤a中所制备的纳米嚢的聚乙 二醇琥珀酸维他命E溶液2ml快速倒入并强力搅拌1秒后用微孔滤膜快速抽 滤，用去离子水洗，最后干燥，即制得纳米囊复合MTX药物微球。经过本实施例所制备的微球的粒径为40.40士2.11pm。微球得载药量为5. 4 ±0.31%,包封率为68. 4 ±3. 5%,药物释放具有峰值释药和平稳释药 的特点，具有两个释药高峰，有效抗肿瘤活性药物释放时间达26天。实施例5(纳米嚢复合微球的制备) 步骤a:同实施例4;步骤b:制备纳米嚢复合微球，即先将150mgPLGA (聚乳酸-羟基乙 酸共聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成30mg/ml的溶液，取 2ml浓度为30mg/ml的PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)-CH2C12溶液， 然后再加入10mgMTX (曱氨蝶呤)，用乳匀机分散均匀，迅速倒入100ml 3at。/。聚乙烯醇溶液中，在常温下快速搅拌，再将步骤a所制备的纳米嚢的聚 乙二醇琥珀酸维他命E溶液2ml快速倒入并强力搅拌1秒后用微孔滤膜快速 抽滤，用去离子水洗，最后干燥，即制得纳米嚢复合MTX药物微球。经过本实施例所制备的微球的粒径为48.40士2.16^im。微球得载药量为6. 8 ±0.42%,包封率为61.4±5. 5%,药物释力文具有峰值释药和平稳释药 的特点，具有两个释药高峰，有效抗肿瘤活性药物释放时间达31天。实施例6 (纳米嚢复合微球的制备)步骤a:同实施例4;步骤b:制备纳米嚢复合微球，即先将250mgPLGA (聚乳酸-羟基乙 酸共聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成50mg/ml的溶液，取 2ml浓度为30mg/ml的PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)-CH2Cl2溶液，然后再加入15mgMTX，用乳匀机分散均匀，迅速倒入100ml5at。/。聚乙烯醇 溶液中，在常温下快速搅拌，再将步骤a所制备的纳米嚢的聚乙二醇琥珀酸 维他命E溶液2ml快速倒入并强力搅拌1秒后用微孔滤膜快速抽滤，用去离 子水洗，最后干燥，即制得纳米囊复合MTX药物微球。经过本实施例所制备的微球的粒径为42.60±3.22|xm。微球得载药量为 7. 4 ±0.53%，包封率为58. 4 ±4.9%，药物释放具有峰值释药和平稳释药 的特点，具有两个释药高峰，有效抗肿瘤活性药物释放时间达30天。纳米嚢复合微球的抗肿瘤活性实验步骤l:制作棵鼠皮下骨肉瘤模型18只，将荷瘤棵鼠随机分为A、 B、 C三组，每组6只，当肿瘤长到l.Ox l.Ocm大小时，手术大部分切除肺瘤；步骤2:采用实施例5的方法制得的载MTX纳米嚢复合微球和采用实 施例5方法但不加MTX的空白纳米嚢复合纟敬球。将载MTX纳米嚢复合微 球植入到A组肿瘤切除后的瘤床部位，将空白不含药物的纳米嚢复合微球 植入到B、 C两组的肺瘤切除后的瘤床部位。步骤3: A组观察肿瘤复发的情况，B组按照0.1mg/Kg体重计算连续给 每只棵鼠用药连续10天，C组为对照组，不用任何干预措施。30天后观察并处死三组棵鼠肿瘤复发情况，A组6只棵鼠全部成活， 肿瘤无复发，处死动物后解剖各脏器未发现肿瘤转移；B组用药第8天l只 棵鼠死亡，14、 18天各死亡1例，其余3例成活，有1例肿瘤局部复发， 处死动物后解剖各脏器未发现肿瘤转移；C组第27天死亡1例，其余5例 肿瘤均原位复发，处死动物后解剖各脏器4例有肺转移、3例肝转移。提示 载MTX纳米嚢复合微球具有良好的抗肿瘤活性。综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的 保护范围，因此，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种纳米囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1取100mg甲氨蝶呤加入到0.25M NaOH溶液2ml中，制得50mg/ml的甲氨蝶呤碱性溶液；将100～200mgPLGA溶于5ml二氯甲烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为20～40mg/ml的PLGA-CH2Cl2溶液；步骤2取20～100μl甲氨蝶呤碱性溶液注入0.5～4ml的PLGA-CH2Cl2溶液中，超声乳化后得到W/O初乳；步骤3将上述初乳加入到1～4at％胆酸钠0.5～4ml中，超声乳化后得到W/O/W复乳；步骤4将所得复乳置于10～100ml 0.5at％胆酸钠中在室温下减压蒸发，除去CH2Cl2，即得纳米囊粒悬液；步骤5将所制得的纳米囊粒悬液于2～10℃下离心、沉淀，并洗去未包裹的游离MTX，纳米囊粒沉淀用1～10ml双蒸水吹打分散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为3～10at％，冷冻干燥即得纳米囊粒。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步骤2和步骤3中 采用超声波细胞粉碎机进行超声乳化。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步骤4中采用旋转 蒸发仪进行减压蒸发。
4、 一种纳米嚢复合微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤a,制备纳米嚢，包括如下步骤步骤1:取100mg曱氨蝶呤加入到0.25MNaOH溶液2ml中，制得 50mg/ml的曱氨蝶呤碱性溶液；将100 ~ 200mgPLGA (聚乳酸-羟基乙酸共 聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成浓度为20~40mg/ml的 PLGA-CH2Cl2溶液；步骤2:取20 ~ lOOpl曱氨蝶呤碱性溶液注入0.5 ~ 4ml的PLGA -CH2Cl2溶液中，超声乳化后得到W/O (水相/油相)初乳；步骤3:将上述初乳加入到1 ~ 4at% (质量百分比)胆酸钠0.5 ~ 4ml 中，超声乳化后得到W/O/W (水相/油相/水相)复乳；步骤4:将所得复乳置于10 ~ 100ml 0.5&1%胆酸钠中在室温下减压 蒸发，除去CH2Cl2,即得纳米嚢粒悬液；步骤5:将所制得的纳米嚢粒悬液于2~ l(TC下离心、沉淀，并洗 去未包裹的游离MTX (曱氨蝶呤)，纳米嚢粒沉淀用1 ~ 10ml双蒸水吹打 分散后，加入甘露醇至甘露醇终浓度为3~ 10at%,冷冻干燥即得纳米嚢粒。步骤6:将纳米嚢粒加入到10%的聚乙二醇唬拍酸维他命E (VitaminETPGS)溶液中，充分搅拌混匀；步骤b,制备纳米嚢复合微球，即将100 ~ 250mgPLGA (聚乳酸-羟基 乙酸共聚物)溶于5ml 二氯曱烷中，搅拌后充分溶解制成20 ~ 50mg/ml的溶 液，取2ml该溶液然后再加入5 15mg MTX (曱氨蝶呤)，用乳匀机分散 均匀，迅速倒入100ml 2 ~ 5at。/。聚乙烯醇溶液中，在常温下快速搅拌，再将 步骤6所制备的纳米嚢聚乙二醇琥珀酸维他命E溶液2ml快速倒入并强力搅 拌1 ~3秒后用微孔滤膜抽滤，用去离子水洗，最后干燥，即制得MTX纳 米嚢复合微球。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤2和步骤3中 采用超声波细胞粉碎机进行超声乳化。
6、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中采用旋转 蒸发仪进行减压蒸发。
全文摘要
本发明公开了一种纳米囊及纳米囊复合微球的制备方法，纳米囊的制备方法包括如下步骤步骤1制备甲氨蝶呤碱性溶液和PLGA-CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>溶液；步骤2将甲氨蝶呤碱性溶液注入PLGA-CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>溶液中，超声乳化后得到W/O初乳；步骤3将上述初乳加入到胆酸钠中，超声乳化后得到W/O/W复乳；步骤4将所得复乳置于胆酸钠中在室温下减压蒸发，除去CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>，即得纳米囊粒悬液。纳米囊复合微球的制备方法包括步骤a制备纳米囊；步骤b制备纳米囊复合微球。本发明所制备的纳米囊颗粒大小均匀载药量和包封率较高，药物释放具有峰值释药和平稳释药的特点。
文档编号A61K9/14GK101401792SQ20081004234
公开日2009年4月8日 申请日期2008年9月1日 优先权日2008年9月1日
发明者叶晓健, 吴建峰, 虹 徐, 徐一帆, 舒 蔡, 文 袁, 许国华 申请人:中国人民解放军第二军医大学