专利名称：能拮抗促肾上腺皮质激素释放因子受体1的多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质学和分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一组能与促肾上腺皮质激素释放因子受体I(CRFRl)特异性结合并拮抗其功能的多肽及其用途。
背景技术：
促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-Releasing Factor, CRF)是由41个氨基酸组成的神经肽，协调应激相关的自主神经、免疫、生理和行为反应，为参与机体应激反应的关键因子。CRF在体内分布广泛，下丘脑的室旁核、大脑、小脑、杏仁-海马复合体、肾上腺、腺垂体、胃肠道、胸腺、皮肤、胎盘及炎症细胞中都有较高的表达。CRF主要通过促肾上腺皮质激素释放因子受体(CRFR)介导生物学效应。CRFR是典型的G蛋白偶联受体，膜内的第3个环区是G蛋白的偶联区，主要通过AC-cAMP-PKA、PLC-IP3、DAG-PKC、ERK-MAPK等信号途径介导信号转导。CRFR主要有两种亚型，即CRFRl和CRFR2。大量研究证实，CRF-CRFR1 信号途径与应激状态下内分泌、自主运动、行为改变以及内脏反应密切相关。应激条件下，CRF由下丘脑室旁核释放，经垂体门脉系统到达垂体前叶，激活垂体前叶促皮质素细胞上的CRFR1，诱导促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌，ACTH进入体循环后促使肾上腺皮质分泌糖皮质激素，即通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(ΗΡΑ轴)发挥其生理功能。正常情况下，HPA轴存在负反馈抑制，血浆中的糖皮质激素可通过海马、下丘脑、垂体上的糖皮质激素受体(GR)抑制过高的HPA轴活性，而长期处于应激环境的条件下，CRF分泌过多，GR受体功能低下，HPA轴负反馈遇到障碍，引起HPA轴活性过高，从而参与抑郁症等情感性疾病病理。临床研究证明，重度抑郁症患者HPA轴功能亢进，脑脊液中CRF水平过高，并通过CRFIU介导了 HPA功能亢进和抑郁样行为。此外，CRFRl在许多人类肿瘤细胞中高表达，如人神经母细胞瘤，乳腺癌细胞，淋巴瘤细胞等。CRF及其相关肽通过CRFRl刺激肿瘤血管的生成，激活procaspase-3，最终促进肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞凋亡。综上所述，CRFRl有望成为抗抑郁症和抗肿瘤治疗的新靶标。近几十年来，多肽类药物以其独特的优势，如活性高、用药剂量小、毒副作用低 (代谢终产物为氨基酸)，较小的肽几乎没有免疫原性等优点已引起科学界的高度重视。开发多肽类药物最经典和最有效的手段是噬菌体肽库展示技术。该技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段与噬菌体的衣壳蛋白融合表达在噬菌体表面。利用靶分子采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能特异结合靶分子的目的噬菌体。目前该技术已广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物开发等各个方面。这项技术通过“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选过程，可以将展示特异性外源肽的噬菌体从噬菌体肽库筛选出来，经扩增可以得到上千倍乃至IO8倍的富集，从而可以很容易地对所筛选的克隆进行序列测定，最终确定表达的外源肽的氨基酸序列。因此，利用噬菌体表面肽库筛选到新的CRFRl激动剂或拮抗剂具有重要的实用价值。
发明内容
本发明人利用噬菌体表面展示技术，通过表达、纯化CRFRlN端胞外区，得到纯化蛋白，然后以该蛋白为靶标，筛选环七肽库和十二肽库，令人意外地得到了 7种与N端胞外区结合活性较高的多肽。基于上述实验，本发明人完成了本发明。第一方面，本发明涉及具有促肾上腺皮质激素释放因子受体1结合活性的多肽或其药学上可接受的盐，其中所述多肽的氨基酸序列为WLPVDWH、NPAFELM、FWGDDGY、LLWLDWH、 YLDAffENEVINF, DGYNGEPffIffQQ 或 YA⑶FWDLDALA。在该方面的一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列为DGYNGEPWIWQQ。第二方面，本发明涉及一种融合肽，其可操作地连接有上述第一方面所述的一个或几个肽，其中所述肽可以相同或不相同。第三方面，本发明涉及一种融合蛋白，其可操作地连接有上述第一方面所述的一个或几个肽，以及一种起靶向作用的蛋白或方便纯化的蛋白，其中所述肽可以相同或不相同。第四方面，本发明涉及DNA或RNA序列，其编码上述第一方面任意一个实施方案所述的多肽。第五方面，本发明涉及一种载体，其含有上述第四方面任意一个实施方案所述的 DNA或RNA序列。第六方面，本发明涉及上述第一至第五方面任意一个实施方案所述的多肽或其药学上可接受的盐、融合肽、融合蛋白、DNA、RNA序列或载体在制备药剂中的用途，所述药剂用于促肾上腺皮质激素释放因子受体1的靶向治疗。第七方面，本发明涉及上述第一至第三方面任意一个实施方案所述的多肽或其药学上可接受的盐、融合肽或融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况。在该方面的一个可替代的方面，本发明涉及一种预防或治疗受试者中促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况的方法，其包括将有效预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况的量的上述第一至第三方面任意一个实施方案所述的多肽或其药学上可接受的盐、融合肽或融合蛋白给予所述受试者。在该方面的一个实施方案中，所述促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况是抑郁症或肿瘤疾病。第八方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含第一至第三方面任意一个实施方案所述的多肽或其药学上可接受的盐、融合肽或融合蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。本领域的普通技术人员可以通过本领域中的已知技术和知识制备得到本发明的多肽、蛋白、DNA、RNA序列或载体、融合肽或融合蛋白以及药物组合物。例如，本领域的普通技术人员可以通过多肽自动合成仪，使用已知的方法和技术制备本发明的多肽。本发明中使用的各科技术语和短语具有本领域技术人员通常理解的含义，但是对于在本说明书中有明确定义的科技术语和短语，如果所定义的含义与本领域技术人员通常理解的含义不一致，则以本说明书中定义的含义为准。本发明多肽的氨基酸序列中的单字母代码具有本领域中公认的含义。例如，DGYNGEPffIffQQ表示天冬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-脯氨酸-色氨酸-异亮氨酸-色氨酸-谷胺酰胺。本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂。特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。例如，可以作为药学上可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合齐 、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。本发明的化合物或药物组合物可以通过本领域中常用的任意方式和任意形式给药。例如，本发明的药物组合物，可以通过口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内等方式给予本发明的化合物或药物组合物。一般而言，以有效预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况的量给予本发明的化合物。至于具体的精确量，临床医师可以根据相关情况，例如被治疗的病症、选择的给药途径、实际给予的化合物、个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重性等进行确定。本发明中所述的“有效预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况的量”是指本发明的多肽，当被给予有其需要的受试者时，能够在临床上实现所述促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况的预防或治疗的量。本发明的药物组合物除了包含本发明的多肽或其药学上可接受的盐外，还可以进一步包含其它的药物活性成分。本发明人用HER293稳定表达CRFRl，通过促cAMP释放功能试验检测了本发明多肽的活性，发现其可显著拮抗CRF通过CRFRl刺激的促cAMP释放功能。本发明筛选出的多肽对CRFRl具有较高的亲和力并且对CRFRl功能有明显的影响，提示这些多肽对以CRFRl为靶标的疾病(即促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况)的防治具有潜在的应用价值。本发明的多肽或蛋白还可以用于开展CRFRl相关的基础研究，以及用于探索以其为靶标治疗相关疾病的可行性。
图1表示SDS-PAGE检测GST-CRFR1N片段的表达及纯化图2表示通过ELISA确认筛选到的噬菌体克隆与GST-CRFR1N的结合。其中，上图为12肽克隆，下图为环7肽克隆。图3表示通过ELISA确认筛选到的与GST-CRFR1N的结合亲和力较高的噬菌体克隆的结合饱和实验。图4稳定表达CRFRl的HEK293细胞株的表达鉴定及功能检测。其中，图A表示 Western blot鉴定蛋白的表达；图B表示免疫荧光鉴定CRFRl蛋白的表达及膜定位。图5为CRF促胞内cAMP释放标准曲线。图6表示本发明多肽P6拮抗CRF刺激的cAMP释放呈浓度依赖方式。
具体实施例方式下面将提供实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于举例说明本发明，而不应被视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 =CRFRlN端胞外区的克降、表汰与纯化1.实验材料大肠杆菌BL21 (DE3)菌株购自博迈德公司；GSTrap FF纯化柱购自于Wiarmacia Biotech公司；溶菌酶购自于!Iomega公司；超声波碎仪购自于宁波新芝科技有限公司，高保真Taq酶和内切酶购自TAKARA公司。原核表达载体pGEX-4T2购自于Pharmacia Biotech 公司。人类 CRFRl 质粒购自于 UMR cDNA Resource Center。2.实验方法(1) PCR和表达载体的构建以CRFRl质粒为模板进行扩增。上游引物为5，-GCGCTCGAGTCAATTGAGGATCTCCTGG C-3，(SEQ No. 8)；下游引物为 5，-CGCGAATTC CCGTCTCTGCCTCCCTCC-3，(SEQ No. 9), PCR ψ 增程序为95°C，5分钟；94°C，1分钟；55°C，1分钟；72°C，1分钟；35个循环。将得到的PCR 产物纯化，连接到PGEX-4T2，转化到大肠杆菌BL21(DE!3)菌株中。对转化子进行酶切鉴定和测序。(2)表达菌株的培养与目标蛋白的诱导表达取上述构建好的载体菌株20微升接种于LB培养基中，37°C空气摇床培养过夜，次日按5% (体积百分比)的比例转种于LB培养基，37°C空气摇床培养约3小时，当OD6tltl值达到0. 7时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导4_5小时，收获细菌。(3) CRFRlN片段的纯化将上述收获的细菌离心后弃去上清，将菌体进行超声破碎，将超声处理后的菌液于4°C，12，000转/分钟离心10分钟。SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式，证明目的蛋白以可溶性形式存在，分子量约为36kD。将离心上清用GSTrap FF亲和纯化柱进行纯化。首先将样品结合于纯化柱，然后用10倍体积的PBS洗去非特异结合的杂蛋白，用lOmmol/L还原型谷胱甘肽(用50mMol/L的Tris-HCl缓冲液配制，pH 8. 0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE 检测纯化效果。3.实验结果结果表明，获得了与预期分子量相符并且纯度较高的靶标蛋白(图1)。实施例2 :CRFR1N端胞外区结合肽的筛选1.实验材料噬菌体随机环七肽库和十二肽库均购自New England Biolab。2.实验方法在得到实施例1中纯化的CRFRlN端胞外区蛋白的基础上，以其为靶标从噬菌体随机环七肽库和十二肽库中，分别经过三轮筛选得到了特异的与CRFRlN端胞外区蛋白结合的肽(筛选方法参照随机肽库说明书)。利用ELISA对筛选得到的结合肽噬菌体进行鉴定。具体方法为用浓度为50 μ g/ml的GST-CRFR1N端胞外区融合蛋白和50 μ g/ml的GST蛋白100微升4°C包被过夜。10% 奶粉37°C封闭1小时；然后每孔各加100微升(约IO11PfuAil)单克隆噬菌体上清，37°C作 用1小吋；每孔加1 5000倍稀释的HRP-抗M13 ニ抗100微升，37°C反应1小吋；加入100 微升TMB显色液显色，反应10分钟后加50微升2M的H2SO4终止反应，测OD (450nm)值。3.实验结果由图2和图3可以看出，有18个噬菌体克隆表现出了对靶标融合蛋白较高的亲和 力，与阴性对照(标签蛋白GST)的亲和カ差异显著，表明它们与CRFRlN端胞外区结合而不 是标签蛋白GST。通过DNA序列分析，得到其相应的结合肽氨基酸序列，共得到了如下7种CRFRlN 端胞外区结合肽。
代号氨基酸序列序列号
plwlpvdwhseq no. 1
p2npafelmseq no. 2
p3fwgddgyseo no. 3
p4llwldwhseq no. 4
P5YLDAWENEVINFSEQ No. 5
P6DGYNGEPWIWQQSEQ No. 6
P7YAGDFWDLDALASEQ No. 7为进一歩探索这些结合肽是否具有拮抗CRFRl的功能，选择结合活性较好的P6进 行后续的功能研究。实施例3 =CRFRl稳定表达细胞株的建立为了进一歩探索筛选到的多肽是否具有拮抗CRFRl的功能，需要建立CRFRl稳定 表达细胞株。1.实验材料HEK293细胞购自中国医科大学细胞库，人类CRFRl质粒购自于UMR cDNA Resource Center。G418购自AMRESC0公司。HA抗体购自Sigma公司，HRP标记和FITC标记的山羊 抗小鼠ニ抗及β-肌动蛋白抗体购自于北京中杉公司。蛋白Marker(High Range Protein Molecular Weight Marker)购自于全式金生物技术公司。脂质体Lipofectamine 2000购 自hvitrogen公司。PVDF购自于Millipore公司。垂直式电泳槽购自于BIO-RAD公司。 荧光显微镜，德国CarlZeiss公司。2.实验方法(l)HEK293-hCRFRl稳定表达细胞株的建立转染按照脂质体Lipofectamine 2000试剂说明书进行。在转染前一天，用无抗生素的培养基将对数生长期的HEK293细胞以2 4X IO5/ 孔接种于6孔板内，置37°C、5% CO2培养箱培养M小吋。当細胞生长达80 90%融合吋， 即可用于DNA转染。
操作步骤①准备两个无菌EP管，每个加入250微升无血清培养基。其中一管加入4微克 hCRFRl质粒混合，另一管加入10微升脂质体混合。室温孵育5分钟。②将稀释好的质粒DNA与稀释好脂质体混合，轻柔混勻，室温孵育20分钟。③将质粒DNA与脂质体混合物500微升加入待转染细胞中，前后左右方向轻柔混勻。④37°C孵育4 6小时，换新鲜的完全培养基，2毫升/孔，继续培养。⑤48小时后，换含800 μ g/ml G418的选择培养基培养细胞，3天更换一次选择培养基。约3周后挑取单克隆鉴定。(2)HEK293-hCRFRl稳定表达细胞株的鉴定①Western blot法鉴定CRFRl蛋白的表达蛋白提取将待处理细胞用冰冷的PBS浸洗两遍，于冰上用细胞刮刀将细胞刮下， 2000rpm离心2分钟，弃上清，离心间隙配制裂解液100微升RAPI加蛋白酶抑制剂混合物 PMSF ImM，抑肽酶，亮肽素(Ieup印tin)，胃蛋白酶抑制剂各lmg/ml。将裂解液加入细胞沉淀中，吹打均勻，冰浴中缓摇20 30分钟后，4°C 12500g，离心30分钟，将上清转移至另一干净的EP管中，取5微升测定蛋白浓度，剩余样品冻存于_70°C冰箱。电泳与转膜各样品加入2X上样缓冲液，煮沸5分钟。12% SDS-PAGE凝胶电泳分离(每孔蛋白上样量为35微克)。电泳结束后转膜，转膜电流为150mA，转膜时间为60 分钟。封闭5%脱脂奶粉做封闭液，室温缓慢摇动，封闭2小时。与一抗HA抗体或β -肌动蛋白抗体杂交将封闭后的PVDF膜用 T-TBS(TBS+0. 05%吐温)洗液振荡洗涤3次，每次10分钟。洗涤后的膜置于一抗中4°C过夜(一抗稀释度为1 1000)。与HRP标记的山羊抗小鼠二抗杂交=T-TBS振摇洗膜3次，每次10分钟。之后，将膜与二抗(稀释度1 5000)孵育，室温下缓慢摇动1小时。酶联化学发光法显色T-TBS振摇洗膜3次，每次10分钟。洗涤后的PVDF膜与发光反应液置于杂交袋中，暗室中轻摇2分钟；X-胶片曝光1分钟；显影、定影，流水冲洗，干燥保存。检测结果见图4A，CRFRl蛋白的分子量与文献报道相符。②免疫荧光法鉴定CRFRl蛋白的表达将转染好的细胞提前接种于铺有多聚赖氨酸玻片的二十四孔板中。3%多聚甲醛-20°C固定15分钟 30分钟后用PBS清洗，FBS 4°C封闭过夜。加入HA—抗(用3% BSAWl 100 1 200稀释)37°C孵育1小时，FITC标记的山羊抗小鼠二抗(用3% BSA以1. 34 100稀释)，室温避光孵育45分钟。加入PBS，荧光显微镜检测。3.实验结果检测结果见图4B，与阴性对照空载体组相比，可见明显的胞质及膜定位红色荧光， 与文献报道相符。以上结果表明，已成功建立稳定高表达CRFRl的细胞株。实施例4 :P6对CRF刺激CRFRl释放cAMP的影响
为详细观察筛选到的多肽对CRF刺激胞内cAMP释放的影响，首先观察了不同浓度 CRF刺激cAMP释放的曲线并进行拟合，选择EC8tl值(即产生80%效应时所需的CRF浓度) 作为后续实验应用的浓度。1.实验材料LANCE cAMP 384 试剂盒(AD0262-500 Assay points)，PerkinElmer 公司。酶标仪，2104Envision PerkinElmer 公司。384 孔发光板，PerkinElmer 公司。CRF 购自 sigma 公司。P6由赛百盛公司合成。2.实验方法按照PerkinElmer 公司的 LANCE cAMP 384 试剂盒(AD0262-500 Assay points) 说明书进行。所用的试剂除CRF外，均为试剂盒所带。①上述稳定表达CRFRl细胞用versene消化液消化3分钟左右，以HBSS终止反应。 离心，IOOOrpmX 5分钟，用HBSS重悬细胞。②离心，IOOOrpmX 5分钟，用反应缓冲液(含终浓度为0. 5mM的IBMX)重悬细胞。 细胞计数，确保细胞数目为3000个/6微升。③加入抗体(1 100稀释)溶液。384孔板中每孔分别加入6微升不同浓度的 CRF (或CRF与P6的混合物)，然后加入6微升含有抗体的细胞悬液(其中应有3000 5000 个细胞)，避光室温孵育30分钟。④加入12微升检测复合物，避光室温孵育1-4小时，室温下进行荧光测定。⑤用5. 0进行数据分析与拟合。3.实验结果实验结果表明，CRF的EC8tl值为32nM，见图5。本发明多肽P6显著拮抗CRF刺激的胞内cAMP的释放，其IC50约为0. InM，见图6。
权利要求
1.具有促肾上腺皮质激素释放因子受体1结合活性的多肽或其药学上可接受的盐，其中所述多肽的氨基酸序列为 WLPVDWH、NPAFELM、FffGDDGY, LLffLDffH, YLDAffENEVINF, DGYNGEPffIffQQ 或 YA⑶FWDLDALA。
2.根据权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐，其中所述多肽的氨基酸序列为 DGYNGEPWIWQQ。
3.一种融合肽，其可操作地连接有权利要求1的一个或几个肽，所述肽可以相同或不相同。
4.一种融合蛋白，其可操作地连接有权利要求1的一个或几个肽，以及一种起靶向作用的蛋白或方便纯化的蛋白，其中所述肽可以相同或不相同。
5.DNA或RNA序列，其编码权利要求1所述的多肽。
6.一种载体，其含有权利要求5所述的DNA或RNA序列。
7.权利要求1或2所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况。
8.权利要求3或4所述的融合肽或融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗促肾上腺皮质激素释放因子受体1介导的疾病或病况。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述药物用于预防或治疗抑郁症或肿瘤疾病。
10.一种药物组合物，其含有1或2所述的多肽或其药学上可接受的盐或权利要求3或 4所述的融合肽或融合蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及能拮抗促肾上腺皮质激素释放因子受体1的多肽及其用途。本发明的多肽具有如下氨基酸序列WLPVDWH、NPAFELM、FWGDDGY、LLWLDWH、YLDAWENEVINF、DGYNGEPWIWQQ或YAGDFWDLDALA。本发明还涉及这些多肽的变异体、编码多肽的基因序列，以及这些多肽作为CRFR1拮抗剂和在制备CRFR1靶向治疗药物中的用途。本发明的多肽在探索CRFR1的生物学功能、研究CRFR1相关疾病的病理机制及其治疗方面具有潜在的应用价值。
文档编号A61K38/08GK102558300SQ20101061121
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者于金梅, 郑建全, 闫海涛, 马晓芸, 魏晓莉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所