专利名称：用于抑制糖皮质素受体(gcr)基因表达的组合物和方法
用于抑制糖皮质素受体(GCR)基因表达的组合物和方法本发明涉及双链核糖核酸(dsRNAs)，及其介导RNA干扰来抑制GCR基因的表达的应用。此外，将所述dsRNAs用于治疗/预防与GCR基因表达相关的广泛范围的疾病/病症，如糖尿病、异常脂血症(dyslipidemia)、肥胖、高血压、心血管病或忧郁症的应用是本发明的部分。糖皮质素负责若干生理学功能，包括对应激的反应、免疫和炎性反应以及肝糖异生的刺激和周边处的葡萄糖利用。糖皮质素通过属于细胞核类固醇受体家族的胞内糖皮质素受体(GCR)起作用。非活化的GCR位于细胞胞质中并与若干伴侣蛋白结合。当配体激活该受体时，复合物在细胞核内转移并与位于若干基因启动子中的糖皮质素反应元件相互作用。该受体可以在细胞核中作为同二聚体或杂二聚体起作用。而且，若干相关辅激活物或辅阻遏物也可以与该复合物相互作用。这种大范围的可能的组合导致若干GCR构象和若干可能的生理学反应，这使得难以鉴定可以担当完全和特定GCR抑制剂的小化学实体。病理学如糖尿病、库欣综合征(Cushing' s syndrome)或忧郁症与中度至严重的皮质醇增多症(hypercortisolism)相关(Chiodini 等，Eur. J. Endocrinol.(欧洲内分泌学杂志)2005，卷 153，第 837-844 页；Young, Stress (应激)2004，卷 7 ，第 205-208 页)。 已经证明GCR拮抗剂施用在忧郁症中(Flores等，Neuropsychopharmacology (神经精神药理学)2006，卷31，第6沘-636页)或在库欣综合征中(Chu等，J. Clin. Endocrinol. Metab. (临床内分泌代谢杂志)2001，卷86，第3568-3573页)具有临床活性。这些临床证据举例说明有效的和选择性GCR拮抗剂在许多适应证如糖尿病、异常脂血症、肥胖、高血压、心血管病或忧郁症中的潜在临床价值(Von Geldern等，J. Med. Chem.(医学化学杂志)2004， 卷 47 (17)，第 4213-4230 页；Hu 等，Drug Develop. Res.(药物发展研究)2006，卷 67，第 871-883 页；Andrews, Handbook of the stress and the brain (应激禾口大脑手册)2005, 卷15，第437-450页)。该方法还可以改善外周胰岛素灵敏性(Zinker等，Meta. Clin. Exp. (代谢临床实验)2007，卷57，第380-387页)并保护胰腺β细胞(Delauney等，J.Clin. Invest.(临床研究杂志)1997，卷(100，第 2094-2098 页)。糖尿病患者具有增高水平的空腹血糖，这在临床上已经与受损的糖异生控制相关联(DeFronzo, Med. Clin. N.Am.(北美医学临床)2004，卷88第787-835页)。肝糖异生过程受控于糖皮质素。非特异性GCR拮抗剂(RU486/米非司酮(mifepristone))的临床施用急性导致正常志愿者中空腹血浆葡萄糖的降低(Garrel等，J. Clin. Endocrinol. Metab. (临床内分泌代谢杂志)1995，卷8(K2)，第379-385页)并慢性导致库欣患者中血浆HbAlc 的降低(Nieman等，J. Clin. Endocrinol. Metab.(临床内分泌代谢杂志)1985，卷61 (3)，第 536-540页)。而且，向瘦蛋白缺陷性动物提供该药物标准化空腹血浆葡萄糖(ob/ob小鼠， Gettys等，Int. J. Obes.(国际肥胖杂志)1997，卷21，第865-873页)以及糖异生酶活性 (db/db 小鼠，Friedman 等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)1997，卷 272 (50)第 31475-31481 页)。已经产生肝特异性敲除小鼠并且这些动物在禁食48h时展示中度低血糖，从而最小化严重低血糖的风险(Opherk等，Mol. Endocrinol.(分子内分泌学)2004，卷18 (6)，第 1346-1353页)。此外，使用反义方法在糖尿病小鼠(db/db小鼠)中引起的肝和脂肪组织GCR沉默导致血糖的显著降低(Watts等，糖尿病(Diabetes)，2005，卷M，第1846-1853 页)。肾上腺水平的内源性皮质激素(corticosteroid)分泌可以通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)来调节。低血浆水平的内源性皮质激素可以经由反馈机制激活该轴， 所述反馈机制导致血液中循环的内源性皮质激素的增加。已知跨越血脑屏障的米非司酮刺激HPA轴，其最终导致血液中循环的内源性皮质激素的增加(Gaillard等，Pro. Natl. Acad. Sci.(国家科学院学报)1984，卷81，第3879-3882页)。米非司酮在长期处理后(长至1 年，综述参见Sitruk-Ware等，2003，Contrac印tion(避孕法)，卷68，第409-420页)，还诱导一些肾上腺功能不全症状。而且，由于其缺乏组织灵敏性，米非司酮在临床前模型以及人中抑制外周的糖皮质素作用(Jacobson等，2005 J. Pharm. Exp. Ther.(药物实验治疗杂志) 卷 314(1)第 191-200 页；Gaillard 等，1985 J. Clin. Endo. Met.(临床内分泌代谢杂志)， 卷 61 (6)，第 1009-1011 页)。关于将在适应证诸如糖尿病、异常脂血症、肥胖、高血压和心血管病中使用的GCR 调节剂，必需限制激活或抑制HPA轴和抑制除肝以外其他器官外周处的GCR的风险。如近期证明地，在肝细胞中直接沉默GCR可以是调节/标准化肝糖异生的方法。然而，该作用仅在相当高浓度下观察到(在25nM范围内的体外IC50/Watts等，糖尿病(Diabetes)，2005， 卷M，第1846-1853页)。为了最小化脱靶(off-target)作用的风险以及为了限制除肝以外其他器官外周处的药理学活性，必需获得更有效的GCR沉默试剂。双链核糖核酸(dsRNA)分子已经显示出以高度保守的调节机制，已知为RNA干扰(RNAi)阻断基因表达。本发明提供能够选择性和有效地减少GCR表达的双链核糖核酸 (dsRNA)分子。GCR RNAi的使用提供用于治疗性和/或预防性治疗疾病/病症的方法，其与糖皮质素途径的任何调节异常相关。这些疾病/病症可以由于内源性糖皮质素的系统或局部过量产生或由于使用合成的糖皮质素处理(例如使用高剂量的糖皮质素处理的患者中的糖尿病样症状)而发生。具体的疾病/病症状态包括2型糖尿病、肥胖、异常脂血症(dislipidemia)、糖尿病型动脉粥样硬化(diabetic atherosclerosis)、高血压和忧郁症的治疗性和/或预防性治疗，该方法包括向人或动物施用靶向GCR的dsRNA。此外，本发明提供用于治疗性和/或预防性治疗代谢综合征X(Metak)Iic Syndrome X)、库欣综合征， 艾迪生病(Addison' s disease)，炎性疾病诸如哮喘、鼻炎、和关节炎，过敏，自身免疫性疾病，免疫缺陷，厌食，恶病质，骨丢失或骨脆弱，和伤口愈合的方法。代谢综合征X指一组风险因子，其包括肥胖、异常脂血症(dyslipidimia)、特别高的甘油三酸酯、葡萄糖不耐受 (glucose intolerance)、高血糖禾口高血压。在一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子能够抑制GCR基因表达至少70 %，优选至少80%，最优选至少90%。本发明还提供使用GCRdsRNA特异性靶向肝的组合物和方法， 其用于治疗由GCR基因表达引起的病症和疾病，包括上述那些。在其他实施方案中，本发明提供特异性靶向其他受损组织或器官，包括但不仅限于，脂肪组织、下丘脑、肾或胰腺的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供用于抑制GCR基因表达，特别地，哺乳动物或人GCR基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。 所述dsRNA包括包含第一序列的有义链和可以包含第二序列的反义链，参见序列表中提供的序列和附表1和4中关于特异性dsRNA对的规定。在一个实施方案中，有义链包括与编码GCR的mRNA的至少一部分具有至少90%同一性的序列。所述序列位于有义链与反义链互补的区域内，优选在反义链5’端的核苷酸2-7内。在一个优选的实施方案中，dsRNA特别靶向人GCR基因，在另一个优选的实施方案中，dsRNA靶向小鼠(Mus musculus)和大鼠 (Rattus norvegicus) GCR 基因。在一个实施方案中，反义链包括与编码所述GCR基因的mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列，且互补区最优选长度小于30个核苷酸。此外，优选地，本文中所述的本发明的dsRNA分子的长度(双链体长度)在约16-30个核苷酸的范围内，特别地在约18- 个核苷酸的范围内。在本发明上下文中特别有效的是约19、20、21、22、23或对个核苷酸的双链体长度。最优选19、21或23个核苷酸的双链体序列段。所述dsRNA，在与表达GCR基因的细胞相接触时，体外抑制GCR基因表达至少70 %，优选至少80 %，最优选90 %。附表13涉及根据本发明作为dsRNA使用的优选分子。修饰的dsRNA分子也提供在本文中并具体地公开在附表1和4中，提供本发明的修饰的dsRNA分子的示范性实例。如本文以上指出地，表1提供本发明的修饰的dsRNA的示范性实例(由此相应的有义链和反义链提供在该表中)。表13中所示的未修饰优选分子与表1中的修饰的dsRNA的关系图示在表14中。然而，本发明的dsRNA的这些成分的示例性修饰作为修饰的实例提供在本文中。表2和3提供本发明的某些dsRNA分子的选择性生物学、临床和药物相关参数。最优选的dsRNA分子提供在附表13中并且，尤其地且优选地，其中有义链选自由 SEQ ID Nos 873、9 、1021、1023、967和905所示的核酸序列组成的组且反义链选自由SEQ ID Nos 874、930、1022、10对、968和906所示的核酸序列组成的组。因此，本发明的(181 離分子可以，尤其，包括选自由 SEQ ID NOs :873/874,929/930,1021/1022,1023/1024,967/968 和905/906组成的组的序列对。在本文中提供的特定dsRNA分子的上下文中，SEQ ID Nos 对涉及相应的有义链和反义链序列(5‘至3')，其也如所附的和所包括的表中所示。在一个实施方案中，所述dsRNA分子包括具有1-5个核苷酸长度，优选1_2个核苷酸长度的3'突出端的反义链。优选，所述反义链的突出端包括尿嘧啶或与编码GCR的mRNA 互补的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子包括具有1-5个核苷酸长度，优选 1-2个核苷酸长度的3'突出端的有义链。优选，所述有义链的突出端包括尿嘧啶或与编码 GCR的mRNA同一的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子包括具有1-5个核苷酸长度，优选 1-2个核苷酸长度的3'突出端的有义链，和具有1-5个核苷酸长度，优选1-2个核苷酸长度的3'突出端的有义链。优选，所述有义链的突出端包括尿嘧啶或与编码GCR mRNA至少 90%同一的核苷酸且所述反义链的突出端包括尿嘧啶或与编码GCR mRNA至少90%互补的
核苷酸。最优选的dsRNA分子提供在下表1和4中并且，尤其地且优选地，其中有义链选自由SEQ ID NOs :7，31，3，25，33，55，83，747和764所示的核酸序列组成的组，反义链选自由SEQ ID NOs :8，32，4，26，；34，56，84，753和772所示的核酸序列组成的组。因此，本发明的 dsRNA 分子可以，尤其，包括选自由 SEQ ID NOs :7/8，31/32，3/4，25/26，33/34，55/56， 83/84，747/753和764/772组成的组的序列对。在本文中提供的特定dsRNA分子的上下文中，SEQ ID Nos对涉及相应的有义链和反义链序列(5‘至3')，其也如所附的和所包括的表中所示。本发明的dsRNA分子可以包括天然存在的核苷酸或可以包括至少一个修饰的核苷酸，诸如2' -0-甲基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸基的核苷酸，反转(inverted) 脱氧胸苷和与胆留醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。2'修饰的核苷酸可以具有另外的优势，即当体内，例如在医学装置中使用本发明的dsRNA分子时抑制某些免疫刺激性因子或细胞因子。备选地且非限制性地，该修饰的核苷酸可以选自下组 2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、 2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和包含非天然碱基的核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子包括以下修饰的核苷酸中的至少一种2' -0-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸基的核苷酸和脱氧胸苷。在另一个优选的实施方案中，有义链的的所有嘧啶均是2' -0-甲基修饰的核苷酸，且反义链的所有嘧啶均是2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸。在一个优选的实施方案中，在dsRNA 分子的两条链的3’处存在两个脱氧胸苷核苷酸。在另一个实施方案中，dsRNA分子的两条链的3’端的这些脱氧胸苷核苷酸中的至少一个包括5'-硫代磷酸基。在另一个实施方案中，有义链中后跟腺嘌呤的所有胞嘧啶和后跟腺嘌呤、鸟嘌呤或尿嘧啶的所有尿嘧啶是 2' -0-甲基修饰的核苷酸，且反义链中后跟腺嘌呤的所有胞嘧啶和尿嘧啶是2' -0-甲基修饰的核苷酸。包含修饰的核苷酸的优选dsRNA分子提供在表1和4中。在优选的实施方案中，本发明的dsRNA分子包括如表1和4中提供的序列所详述的核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明的dsRNA分子包括选自由SEQ ID NOs :7/8， 31/32，3/4，25/26，33/34，55/56和83/84组成的组的序列对，且包括如表1中所详述的修饰。在另一个实施方案中，本发明的dsRNA包括在与表1和4中公开的那些不同的位置上修饰的核苷酸。在一个优选的实施方案中，dsRNA分子的两条链的3’处存在两个脱氧胸苷核苷酸。在另一个优选的实施方案中，两条链的3’处的这些脱氧胸苷核苷酸中的一个是反转脱氧胸苷。在一个实施方案中，本发明的dsRNA分子包括有义链和反义链，其中两条链均具有至少9小时的半衰期。在一个优选的实施方案中，本发明的dsRNA分子包括有义链和反义链，其中两条链在人血清中均具有至少9小时的半衰期。在另一个实施方案中，本发明的 dsRNA分子包括有义链和反义链，其中两条链在人血清中均具有至少M小时的半衰期。在另一个实施方案中，本发明的dsRNA分子是非免疫刺激性的，例如不体外刺激 INF- α 禾口 TNF- α。本发明还提供包含至少一种本发明的dsRNA的细胞。所述细胞优选是哺乳动物细胞，诸如人细胞。此外，在本发明中还包括包含本文定义的dsRNA分子的组织和/或非人生物体，其中所述非人生物体特别用于研究目的或作为研究工具，例如也用在药物测试中。另外，本发明涉及在细胞、组织或生物体中抑制GCR基因的表达，具体地哺乳动物或人GCR基因的表达的方法，所述方法包括下列步骤(a)将如本文定义的双链核糖核酸(dsRNA)引入所述细胞、组织或生物体中；(b)在足以获得GCR基因的mRNA转录体降解的时间内维持在步骤(a)中产生的所述细胞、组织或生物体，由此在给定的细胞中抑制GCR基因的表达。本发明还涉及包含本发明的创造性dsRNAs的药物组合物。这些药物组合物特别用于抑制细胞、组织或生物体中的GCR基因的表达。包含本发明的一种或多种dsRNA的药物组合物也可以包含药用载体、稀释剂和/或赋形剂。在另一个实施方案中，本发明提供治疗、预防或处理病症的方法，所病症与2型糖尿病、肥胖、异常脂血症、糖尿病型动脉粥样硬化、高血压和忧郁症相关，所述方法包括向需要所述治疗、预防或处理的受试者施用治疗或预防有效量的本发明一种或多种dsRNAs。优选地，所述受试者是哺乳动物，最优选地是人患者。在一个实施方案中，本发明提供治疗患有由GCR基因的表达介导的病理学病症的受试者的方法。所述病症包括与糖尿病和肥胖相关的病症，如上所述。在该实施方案中， dsRNA用作控制GCR基因表达的治疗剂。所述方法包括向患者(例如人)施用本发明的药物组合物，从而使GCR基因的表达沉默。因为它们的高度特异性，本发明的dsRNAs特异性靶向GCR基因的mRNAs。在一个优选的实施方案中，所述dsRNAs特异性减少GCRmRNA水平并且不直接影响细胞中的脱靶基因的表达和/或mRNA水平。在另一个优选的实施方案中， 所述dsRNAs特异性减少GCR mRNA水平以及正常由GCR激活的基因的mRNA水平。在另一个实施方案中，本发明的dsRNAs体内减少葡萄糖水平在一个优选的实施方案中，所述dsRNA体内减少肝中的GCR mRNA水平至少70%， 优选至少80%，最优选至少90%。优选地，本发明的dsRNAs在不改变肝转氨酶的条件下减少糖血。在另一个实施方案中，所述dsRNAs在至少4天内体内减少GCR mRNA水平。在另一个实施方案中，所述dsRNAs在至少4天内体内减少GCR mRNA水平至少60%。关于治疗性dsRNAs特别有效的是靶向小鼠和大鼠GCR的dsRNAs组，其可以用于在动物或细胞培养物模型中评估个体dsRNAs的毒性、治疗功效、有效剂量和体内半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供用于抑制细胞中的GCR基因表达的载体，具体地这样的GCR基因，其包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含用于抑制细胞中GCR基因的表达的载体的细胞。所述载体包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列。此外，优选地，除了所述调节序列之外，所述载体包含编码本发明的dsRNA的至少一条“有义链”和所述dsRNA的至少一条“反义链”的序列。还意欲所要求保护的细胞包含两个或多个载体，所述载体除了所述调节序列之外，还包含本文定义的编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的序列。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含dsRNA的组合物，其中所述dsRNA包含与待治疗的哺乳动物的GCR基因的RNA转录体的至少一部分互补的核苷酸序列。如上面所指出，还可以将包含编码本文定义的dsRNA分子的至少一条链的核酸分子的载体和细胞用作药物组合物，并且其因此也可以用于本文公开的治疗需要医学干预的受试者的方法。还要注意，涉及药物组合物和涉及相应治疗(人)受试者的方法的这些实施方案也涉及如基因治疗方案的方案。还可以将本文提供的GCR特异性dsRNA分子或编码这些本发明dsRNA 分子的各个链的核酸分子插入载体中并将其用作人患者的基因治疗载体。可以通过例如， 静脉内注射、局部施用(见美国专利5，328，470)或通过立体定位(stereotactic)注射(见例如 Chen 等(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA)(美国国家科学院学报)91 =3054-3057)将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可以包含包埋基因递送载体的缓慢释放基质。备选地，其中完整的基因递送载体可以完整地从重组细胞中产生，例如反转录病毒载体，所述药物制剂可以包括生成基因递送系统的一种或多种细胞。在本发明的另一个方面中，调节GCR基因表达活性的GCR特异性dsRNA分子自被插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(见，例如Skillern，Α.，等，国际PCT公开号WO 00/22113)。这些转基因可以作为直链构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以被整合并且作为整合到宿主基因组中的转基因遗传。还可以构建转基因从而使其作为染色体外质粒进行遗传(Gassmann，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)(1995)92 1292)。可以通过在两个单独表达载体上的启动子转录dsRNA的各条链并且将其共转染到靶细胞中。备选地，dsRNA的每条链可以通过都位于同一表达质粒上的启动子进行转录。在优选的实施方案中，dsRNA作为通过接头多核苷酸序列连接的反转重复表达从而使 dsRNA具有茎和环结构。重组dsRNA表达载体优选地是DNA质粒或病毒载体。可以基于，但不限于下列物质来构建表达dsRNA的病毒载体腺伴随病毒(综述，见Muzyczka，等，Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158 :97-129))；腺病毒(见，例如，Berkner，等，BioiTechniques (生物技术)(1998)6 :616)，Rosenfeld 等(1991，Science (科学)252 :431-434)，和 Rosenfeld 等 (1992)，Cell (细胞)68 :143-155))；或甲病毒属(alphavirus)以及本领域已知的其它病毒载体。将反转录病毒用于将各种基因体外和/或体内引入许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞中(见例如，Danos和Mulligan，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美国国家科学院学报)(199 85 :6460-6464)。可以通过将重组反转录病毒基因组转染到适合的包装细胞系如PA317和I^si-CRIP中来产生能够转导和表达被插入细胞的基因组中的基因的重组反转录病毒载体(Comette 等，1991 ,Human Gene Therapy (人基因疗法)2 :5-10 ；Cone 等，1984， Proc. Natl. Acad. ki. USA(美国国家科学院学报)81 :6349)。可以将重组腺病毒载体用于感染敏感宿主(例如，大鼠、仓鼠、狗和猩猩)中的广泛多样的细胞和组织(Hsu等，1992， J. Infectious Disease (传染病杂志)，166 :769)，并且还具有不需要有丝分裂活性细胞进行感染的优势。在本发明的DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核生物RNA 聚合酶I (例如，核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II (例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或UlsnRNA启动子)或优选地RNA聚合酶III启动子(例如，U6 snRNA或7SK RNA启动子)或原核生物启动子，例如T7启动子，如果所述表达质粒也编码从T7启动子转录所需要的T7RNA聚合酶。所述启动子也可以将转基因表达定位于胰腺(见，例如，关于胰腺的胰岛素调节序列(Bucchini等，1986，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美国国家科学院学报)83 2511-2515))。此外，转基因的表达可以例如通过使用可诱导的调节序列和表达系统如对某些生理调节剂例如循环葡萄糖水平、或激素敏感的调节序列(Docherty等，1994，FASEB J. 8 20-24)进行精确地调节。适合控制细胞或哺乳动物中的转基因表达的这些可诱导的表达系统包括通过蜕皮素、通过雌激素、通过孕激素、通过四环素、通过二聚作用的化学诱导剂以及通过异丙基-β-Dl-硫代半乳糖吡喃糖苷(EPTG)进行调节。本领域技术人员能够基于 dsRNA转基因的意欲应用选择适合的调节/启动子序列。优选地，能够表达dsRNA分子的重组载体如下所述递送，并且在靶细胞中持续。备选地，可以使用提供dsRNA分子的瞬时表达的病毒载体。所述载体可以根据需要重复地进行施用。一旦被表达，所述dsRNAs结合靶RNA并且调节其功能或表达。表达dsRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用从患者移出随后再引入患者的靶细胞，或通过允许引入到需要的靶细胞的任何其它手段进行。典型地，将dsRNA表达DNA质粒作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine) 或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKO )的复合物转染到靶细胞中。本发明还预期在一周以上的时期内进行关于靶向单一 GCR基因或多种GCR基因的不同区域的 dsRNA-介导的敲降的多种脂质转染。可以使用多种不同的已知方法来监测本发明的载体向宿主细胞中的成功引入。例如，瞬时转染可以用报道分子来发信号，所述报道分子如荧光标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。可以使用这样的标记来确保先体外后体内细胞的稳定转染，所述标记给转染的细胞提供对特定的环境因子的抗性(例如，抗生素和药物)，如潮霉素B抗性。下列详细的描述公开了怎样制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物从而抑制靶 GCR基因的表达，以及用于治疗由所述GCR基因的表达所导致的疾病和病症的组合物和方法。定义为了方便，在下面提供在说明书、实施例和后附的权利要求中所用的某些术语和短语的含义。如果该术语在本说明书的其它部分中的使用和其在本小节中提供的定义之间有明显的歧义，则以在本小节的定义为准。“ G，“ “ C，“ “ A"，“ U"和“T”或“dT”分别地，每种一般代表分别包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶和脱氧胸苷作为碱基的核苷酸。然而，术语“核糖核苷酸”或 “核苷酸”也可以指修饰的核苷酸，如下进一步详述，或替代置换结构部分。包含所述置换结构部分的序列是本发明的实施方案。如下所述，本文所述的dsRNA分子也可以包含“突出端”，即未配对的悬垂的核苷酸，其不直接包含在正常情况下由本文定义的“有义链”和“反义链”对形成的RNA双链体结构内。通常，这样的悬垂序列在3’端包含脱氧胸苷核苷酸，在大多数实施方案中，包含2脱氧胸苷。所述突出端将在下面详细描述和举例说明。术语“GCR”用于本文时，特别涉及胞内糖皮质素受体(GCR)并且所述术语涉及相应的基因，也称为NR3C1基因，编码的mRNA，编码的蛋白/多肽及其功能片段。优选人 GCR基因。在其他优选的实施方案中，本发明的dsRNAs靶向大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)的GCR基因，在另一个优选的实施方案中，本发明的dsRNAs靶向人 (H. sapiens)和食蟹猴(Macaca fascicularis) GCR基因。术语“GCR基因/序列”不仅涉及野生型序列，还涉及包含在所述基因/序列内的突变和变更。因此，本发明不限于本文提供的特定的dsRNA分子。本发明还涉及包含这样的反义链的dsRNA分子，所述反义链与包含这样的突变/变更的GCR基因的RNA转录体的相应核苷酸序列至少85%互补。用于本文时，“靶序列”指在GCR基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。用于本文时，术语“包含链的序列”指包含核苷酸链的寡核苷酸，其由使用标准核苷酸命名法所提及的序列描述。然而，如本文所述时，所述“包含链的序列”也可以包含修饰，如修饰的核苷酸。用于本文时，并且除非另外指出，术语“互补的”，当用于与第二核苷酸序列相关描述第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。用于本文时，“互补”序列也可以包括非-沃森-克里克碱基对和/或从非天然的和修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足了上述关于它们杂交能力的要求。被称为“完全互补”的序列包括在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的完整长度上，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。然而，当在本文称第一序列与第二序列为“基本互补”时，所述两条序列可以完全互补，或它们在杂交后可以形成一个以上，但是优选地不超过13个错配的碱基对。在本文术语“互补的”，“完全互补的”和“基本互补的”可以关于在dsRNA的有义链和反义链之间，或在dsRNA的反义链和靶序列之间的碱基配对使用，如从它们使用的情形中所理解的。术语“双链RNA”、“dsRNA分子”、或“dsRNA”，用于本文时，指这样的核糖核酸分子或核糖核酸分子复合物，其具有包含两条反向平行并且基本互补的核酸链的双链体结构。 形成所述双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或它们可以是单独的 RNA分子。如果两条链是一个较大分子的部分，并且因此通过形成双链体结构的在一条链的3’ -端和各自的另一条链的5’ -端之间的连续核苷酸链连接时，将所述连接RNA链称为 “发夹环”。如果两条链通过除了形成双链体结构的在一条链的3’-端和各自的另一条链的 5’-端之间的连续的核苷酸链之外的其它方式共价连接时，将所述连接结构称为“接头”。所述RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。除了双链体结构之外，dsRNA可以包含一个或多个核苷酸突出端。在所述“突出端”中的核苷酸可以包含0-5个核苷酸，其中“0”意为没有形成“突出端”的另外的核苷酸，而“5”意为在dsRNA双链体的每条链上的5个另外的核苷酸。这些任选的“突出端”位于每条链的3’端。如下所详述，仅在两条链中的一条中包含 “突出端”的dsRNA分子也可以是有用的，并且甚至在本发明的情形中是有利的。所述“突出端”优选地包含0-2个核苷酸。最优选地，在dsRNA的两条链的3’端可见2个“dT” (脱氧胸苷)核苷酸。而且，2个"U"(尿嘧啶)核苷酸可以用作dsRNA的两条链的3’端的突出端。因此，“核苷酸突出端”指当dsRNA的一条链的3'-端延伸出另一条的5'-端时，或反之亦然，从dsRNA的双链体结构突出的未配对的一个或多个核苷酸。例如，反义链包含23个核苷酸且有义链包含21个核苷酸，从而在反义链的3’端形成2个核苷酸的突出端。优选地，该2个核苷酸的突出端与靶基因的mRNA完全互补。“平的”或“平端”意为在 dsRNA的该末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端”dsRNA是在其完整长度上都是双链，即在所述分子的任一端都没有核苷酸突出端。术语“反义链”指这样的dsRNA链，其包含与靶序列基本互补的区域。用于本文时， 术语“互补性区域”指与序列，例如靶序列基本互补的反义链上的区域。如果互补性区域未与所述靶序列完全互补，则错配最常见于反义链5’末端的核苷酸2-7外。术语“有义链”用于本文时，指包含与反义链的区域基本互补的区域的dsRNA的链。“基本互补的”意为优选地在有义链和反义链中的重叠核苷酸的至少85%是互补的。“引入细胞中”，当涉及dsRNA时，意为促进摄取或吸收到细胞中，如由本领域技术人员所理解的。dsRNA的吸收或摄取可以通过独立的扩散性或主动的细胞过程，或通过辅助试剂或装置来进行。该术语的含义不限于体外细胞；dsRNA也可以“被引入细胞中”，其中所述细胞是活生物体的部分。在这样的情形中，引入细胞中包括递送到生物体中。例如，对于体内递送，可以将dsRNA注射到组织位点或全身性施用。例如，设想将本发明的dsRNA分子施用于需要医疗干预的受试者。这样的施用可以包括将本发明的dsRNA、载体或细胞注射到所述受试者的患病侧，例如注射到肝组织/细胞或注射到癌组织/细胞，如肝癌组织中。然而，还设想在患病组织紧邻处的注射。体外引入细胞中包括本领域已知的方法如电穿孔和脂转染。术语“沉默”，“抑制...的表达”和“敲降(knock down) ”，只要它们涉及GCR基因， 在本文都是指至少部分抑制GCR基因的表达，如通过可以从第一细胞或细胞组(其中GCR 基因被转录并且已经进行了处理从而使GCR基因的表达被抑制)分离的GCR基因转录的 mRNA与第二细胞或细胞组(基本与第一细胞或细胞组相同，但是其没有进行处理(对照细胞))比较在量上的减少所证实的。抑制的程度通常用下式表示
(在对照细胞中的mRNA^K在处理的细胞中的mRNA) _ · 100%
(在对照细胞中的mRNA)备选地，抑制的程度可以根据与GCR基因转录函数相关的参数的减少来确定，所述参数例如是由细胞分泌的由GCR基因编码的蛋白的量，或显示某些表型的细胞的数量。如在本文提供的后附的实施例和后附的表中所举例说明的，本发明的dsRNA分子在体外测定法中，即在体外能够抑制人GCR的表达至少约70 %，优选至少80 %，最优选至少 90%。术语“体外”用于本文中时，包括但不仅限于细胞培养测定。在另一个实施方案中， 本发明的dsRNA分子能够抑制小鼠或大鼠GCR的表达至少70%，优选至少80%，最优选至少90%。本领域技术人员能够容易地确定这样的抑制率以及相关作用，特别是根据本文提供的测定法。术语“脱靶(off-target)”用于本文时指由在计算机芯片上(in silico)方法基于序列互补性预期与所述dsRNAs杂交的转录组的所有非靶mRNAs。本发明的dsRNAs优选地特异性抑制GCR的表达，即不抑制任何脱靶的表达。特别优选的dsRNAs提供，例如，在附表1和2(其中以5'至3'的方向提供有义链和反义链序列)，最优选的dsRNAs提供在表2中。术语“半衰期”用于本文时，是化合物或分子的稳定性的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的方法进行评估，尤其是结合本文提供的测定法进行评估。术语“非免疫刺激性”用于本文时，指本发明的dsRNA分子缺乏对免疫应答的任何诱导。确定免疫应答的方法是本领域技术人员公知的，例如通过评估细胞因子的释放进行，如本文实施例部分所述。术语〃治疗(treat)“，“治疗(treatment)“，等在本发明的上下文中，意指涉及GCR表达的病症，如糖尿病、异常脂血症、肥胖、高血压、心血管病或忧郁症的减轻或缓和。用于本文时，“药物组合物”包含药用有效量的dsRNA和药用载体。然而，所述“药物组合物”也可以包含所述dsRNA分子的每条链或本文所述的包含与编码包含在本发明的 dsRNAs中的有义链或反义链的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列的载体。 还设想，可以将表达或包含本文定义的dsRNAs的细胞、组织或分离的器官用作“药物组合物”。用于本文时，“药用有效量，” “治疗有效量”或简单地，“有效量”指有效产生意欲的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。术语“药用载体”指施用治疗剂的载体。所述载体包括，但不限于盐水、缓冲盐水、 右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。术语特别排除了细胞培养基。关于口服施用药物，药用载体包括，但不限于药用赋形剂，如本领域技术人员已知的惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、风味剂、着色剂和防腐剂。特别设想药用载体允许全身施用本发明的dsRNAs，载体或细胞。而除了设想肠道施用之外，肠胃外施用以及透皮或透粘膜(例如吹入、颊含、阴道、直肠)施用以及吸入药物也是向需要医疗干预的患者施用本发明的化合物的便利方式。当使用肠胃外施用时，这可以包括将本发明的化合物直接注射到患病组织或至少注射在其紧邻处。然而，本发明化合物的静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜内、皮内、鞘内和其它施用也在技术人员，例如主治医师的技术之内。关于肌内、皮下和静脉内应用，本发明的药物组合物通常在被缓冲到适合的pH和等渗性的无菌水溶液或混悬液中提供。在优选的实施方案中，载体只由缓冲水溶液组成。在该情形中，“只”意指无可能影响或介导dsRNA在表达GCR基因的细胞中的摄取的辅助试剂或包封物质存在。根据本发明的水性混悬液可以包括悬浮剂如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮和黄芪胶，和湿润剂如卵磷脂。用于水性混悬液的适合的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。根据本发明使用的药物组合物还包括包封的制剂以保护dsRNA免于被身体快速去除，如控制释放的制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。还可以将脂质体混悬液用作药用载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如如在PCT公开WO 91/06309中所述，将其结合在本文作为参考。用于本文时，“转化的细胞”是其中引入了至少一种载体的细胞，dsRNA分子或所述 dsRNA分子的至少一条链可以在其中表达。所述载体优选地是包含调节序列的载体，所述调节序列与编码包含在本发明的dsRNAs中的有义链或反义链的至少一条的核苷酸序列可操纵地连接。可以合理地预期包含在一端或两端仅减去数个核苷酸的表1和4的序列之一的更短dsRNAs与上述dsRNAs比较可以具有类似的效果。如上指出，在本发明的大多数实施方案中，本文提供的dsRNA分子包含约16-约30个核苷酸的双链体长度(即没有“突出端”)。 特别有用的dsRNA双链体长度是约19-约25个核苷酸。最优选的是具有19个核苷酸长度的双链体结构。在本发明的dsRNA分子中，所述反义链与有义链至少部分互补。在一个优选的实施方案中，本发明的dsRNA分子包含表13中提供的序列的核苷酸 1-19。本发明的dsRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在优选的实施方案中，本发明的dsRNA包含不超过13个错配。如果dsRNA的反义链包含与靶序列的错配，那么优选地，错配区不位于反义链5’末端的核苷酸2-7内。在另一个实施方案中，优选地，错配区不位于反义链5’末端的核苷酸2-9内。如上提及，所述dsRNA的至少一个末端/链可以具有1-5个，优选地1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。与它们的平端对应物相比，具有至少一个核苷酸突出端的dsRNAs 具有出人意料的优越的抑制性质。而且，发明人发现仅一个核苷酸突出端的存在加强了 dsRNA的干扰活性，而不会影响其总的稳定性。仅具有一个突出端的dsRNA已经证实了在体内，以及在多种细胞、细胞培养基、血液和血清中是特别稳定和有效的。优选地，单链突出端位于反义链的3'-端末端，或备选地，位于有义链的3'-端末端。dsRNA也可以具有平末端，其优选地位于反义链的5’ -端。优选地，所述dsRNA的反义链在3’端具有核苷酸突出端，并且5’-端是平的。在另一个实施方案中，在突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸取代。还可以对本发明的dsRNA进行化学修饰以增强稳定性。可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰本发明的核酸，如在〃 Current protocols in nucleic acid chemistry (目前在核酸化学中的方案)“，Beaucage, S. L.等(Edrs.)，John ffiley&Sons, Inc.，New York, NY, USA中所述的那些，将其特此结合在本文作为参考。化学修饰可以包括，但不限于2’修饰，引入非天然碱基、与配体共价连接和用硫代磷酸连接取代磷酸连接。 在该实施方案中，双链体结构的完整性被至少一个，优选地两个化学连接所加强。化学连接可以通过多种公知的技术的任一种来实现，例如通过引入共价键、离子键或氢键；通过疏水相互作用、范德华相互作用或堆积相互作用(stacking interactions)；通过金属-离子配位的方式，或通过使用嘌呤类似物来实现。优选地，可以用于修饰dsRNA的化学基团包括， 但不限于亚甲蓝、双官能基团，优选地双-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基-N' -(ρ-乙醛酰苯甲酰)胱胺；4-硫代尿嘧啶；和补骨脂素。在一个优选的实施方案中，所述接头是六甘醇接头。在该情形中，所述dsRNA通过固相合成产生，并且所述六甘醇接头根据标准方法(例如， Williams, D. J.，和 K. B. Hall，Biochem.(生物化学)(1996)35 :14665-14670)结合。在具体的实施方案中，反义链的5'-端和有义链的3'-端通过六甘醇接头化学连接。在另一个实施方案中，dsRNA的至少一个核苷酸包含硫代磷酸或二硫代磷酸基团。在dsRNA的末端的化学键优选地通过三股螺旋键形成。在某些实施方案中，化学键可以通过一个或多个键合基团形成，其中所述键合基团优选地是聚-(氧基磷酸亚基氧基-1，3-丙二醇)-和/或聚乙二醇链。在其它实施方案中，化学键也可以通过被引入双链结构中取代嘌呤的嘌呤类似物的方式来形成。在其它实施方案中，化学键可以通过被引入双链结构中的氮杂苯单位(azabenzene units)来形成。 在另一些实施方案中，化学键可以通过被引入双链结构中的核苷酸的替代物-支链核苷酸类似物来形成。在某些实施方案中，化学键可以由紫外线诱导。在又一个实施方案中，在两条单链的一条或两条处的核苷酸可以被修饰从而防止或抑制细胞酶，例如某些核酸酶的激活。用于抑制细胞酶的激活的技术是本领域已知的， 包括，但不限于，2’ -氨基修饰、2’ -氨基糖修饰、2’ -F糖修饰、2’ -F修饰、2’ -烷基糖修饰、不带电荷的骨架修饰、吗啉代修饰、2’-0_甲基修饰、反转胸苷和氨基磷酸酯(见，例如， Wagner, Nat. Med.(自然医学)(1995) 1 :1116-8)。因此，在dsRNA上的核苷酸的至少一个 2’_羟基被化学基团取代，优选地被2’-氨基或2’-甲基取代。此外，可以将至少一个核苷酸进行修饰从而形成锁定核苷酸。所述锁定核苷酸包含亚甲基桥接，其连接核糖的2’ -氧与核糖的4’ -碳。将锁定核苷酸引入寡核苷酸中改善了对于互补序列的亲和性，并且将解链温度提高了几度。本发明的化合物可以利用一种或多种反转核苷酸，例如反转胸苷或反转腺嘌呤来合成(见，例如，Takei，等，2002，JBC 277(26) :23800-06)。本文提供的dsRNA分子的修饰可以正向影响它们的体内以及体外稳定性并且还可以改善它们向(患病的)靶侧的递送。此外，所述结构和化学修饰可以正向影响针对施用后的dsRNA分子的生理反应，例如优选地被抑制的细胞因子释放。这些化学和结构修饰是本领域中已知的，并且特别在Nawrot Q006) Current Topics in Med Chem，6，913-925 中举例说明。配体与dsRNA的缀合可以增强其细胞吸收以及向特定的组织的靶向。在某些情形中，将疏水配体与所述dsRNA缀合以促进细胞膜的直接渗透。备选地，与dsRNA缀合的配体是受体-介导的内吞作用的底物。已经将这些方案用于促进反义寡核苷酸的细胞渗透。例如，已将胆固醇与各种反义寡核苷酸缀合，导致形成这些的化合物，其与它们的非缀合类似物比较具有实质上更强的活性。见M. Manoharan Antisense&Nucleic Acid Drug Development反义和核酸药物开发)2002，12，103。已缀合于寡核苷酸的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-0-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸-受体-介导的内吞作用进入细胞。携带叶酸的dsRNA 化合物将通过叶酸-受体介导的内吞作用有效地被运输进入细胞。将叶酸连接于寡核苷酸的3，-末端导致寡核苷酸的增加的细胞摄取(Li，S. ；Deshmukh, H. M. ；Huang, L. Pharm. Res. 1998，15，1540)。已经被缀合于寡核苷酸的其它配体包括聚乙二醇、碳水化合物簇、交联剂、吓啉缀合物和递送肽。在某些情形中，阳离子配体与寡核苷酸的缀合通常导致对核酸酶的提高的抗性。阳离子配体的代表性实例是丙基铵和二甲基丙基铵。有趣的是，当阳离子配体分散到整个寡核苷酸中时，反义寡核苷酸被报道保持了它们对于mRNA的高结合亲和性。见 M. Manoharan Antisense&Nucleic Acid Drug Development (反义禾口核酸药物开发)2002， 12，103以及其中的参考文献。本发明的配体-缀合的dsRNA可以通过使用这样的dsRNA进行合成，所述dsRNA 具有悬垂(pendant)的反应官能度(functionality)，如由连接分子连接到dsRNA上所衍生的那些官能度。这种反应性寡核苷酸可以直接与商购配体、具有多种保护基的任一种的合成的配体或具有连接于其上的连接结构部分的配体进行反应。本发明的方法在一些优选的实施方案中，通过使用这样的核苷单体来促进配体-缀合的dsRNA合成，所述核苷单体已经适当地与配体缀合并且可以进一步连接于固体-支持物物质。任选地与固体-支持物物质连接的这些配体-核苷缀合物根据本发明方法的一些优选实施方案，通过选定的血清-结合配体与位于核苷或寡核苷酸5'位置上的连接结构部分的反应进行制备。在某些情形中， 具有连接于dsRNA的3’-末端的芳烷基配体的dsRNA通过首先将单体结构单元与可控孔度玻璃支持物通过长链氨基烷基基团进行共价连接来进行制备。接着，将核苷酸通过标准的固相合成技术与结合于固体支持物的单体结构单元结合。单体结构单元可以是核苷或其它与固相合成相容的有机化合物。在本发明的缀合物中所用的dsRNA可以通过固相合成的公知技术方便和常规地制备。还已知使用类似的技术来制备其它的寡核苷酸，如硫代磷酸和烷基化的衍生物。关于特定修饰的寡核苷酸的合成技术可以见于下列美国专利美国专利号 5，218，105，涉及多胺缀合的寡核苷酸；美国专利号5，541, 307，涉及具有修饰的骨架的寡核苷酸；美国专利号5，521，302，涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸；美国专利号 5，539，082，涉及肽核酸；美国专利号5，554，746，涉及具有β -内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利号5，571，902，涉及用于合成寡核苷酸的方法和物质；美国专利号5，578，718，涉及具有烷硫基的核苷，其中所述基团可以用作针对在核苷的多个位置中任一处连接的其它结构部分的接头；美国专利号5，587，361，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸连接的寡核苷酸； 美国专利号5，506，351，涉及制备2' _0_烷基鸟苷和相关化合物(包括2，6_ 二氨基嘌呤化合物)的工艺；美国专利号5，587，469，涉及具有Ν-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5，587，470，涉及具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5，608，046，两者都涉及缀合的4'-脱甲基核苷类似物；美国专利号5，610，289,涉及骨架修饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6，262, Ml，特别涉及合成2'-氟-寡核苷酸的方法。在本发明的具有序列-特异性连接的核苷的配体-缀合的dsRNA和配体-分子中，所述寡核苷酸和寡核苷可以使用标准的核苷酸或核苷前体或已经具有连接结构部分的核苷酸或核苷缀合物前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或具有结构单元的非核苷配体，在适合的DNA合成仪上进行装配。当使用已经具有连接结构部分的核苷酸-缀合物前体时，序列特异性连接的核苷的合成典型地完成，并且接着将配体分子与连接结构部分反应以形成配体-缀合的寡核苷酸。已经在前描述了具有多种分子如类固醇、维生素、脂质和报道分子的寡核苷酸缀合物 (见Manoharan等，PCT申请W093/07883)。在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及商购的亚磷酰胺，在自动合成仪上合成。在寡核苷酸的核苷中结合2' -0-甲基、2' -0-乙基、2' _0_丙基、2' _0_烯丙基、2' -0-氨基烷基或2'-脱氧-2'-氟基团给所述寡核苷酸赋予增强的杂交性质。此外，包含硫代磷酸骨架的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此。本发明的官能化，连接的核苷可以被加强以包含任一或两种的硫代磷酸骨架，或2' -0-甲基、2' -0-乙基、 2' -0-丙基、2' -0-氨基烷基、2' -0-烯丙基或2'-脱氧-2'-氟基团。在一些优选的实施方案中，在5'-末端具有氨基基团的本发明官能化核苷序列使用DNA合成仪进行制备，并且接着将其与选定配体的活化酯衍生物反应。活化酯衍生物是本领域技术人员公知的。代表性活化酯包括N-氢琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基基团与活化酯的反应产生这样的寡核苷酸，其中所述选定的配体与5'-位置通过连接基团连接。在5'-末端的氨基基团可以使用5'-氨基-改性物C6试剂进行制备。在优选的实施方案中，配体分子可以通过使用配体-核苷亚磷酰胺缀合于寡核苷酸的5'-位置，在所述配体-核苷亚磷酰胺中配体通过接头直接或间接连接于5'-羟基基团。所述配体-核苷亚磷酰胺典型地在自动合成程序结束时使用从而提供在5'-末端具有配体的配体-缀合的寡核苷酸。在本发明方法的一个优选的实施方案中，选择在其上构建配体分子的适合的前体分子开始制备配体缀合的寡核苷酸。典型地，所述前体是常用核苷的适当保护的衍生物。 例如，用于合成本发明的配体-缀合的寡核苷酸的合成前体包括，但不限于2'-氨基烷氧基-5' -ODMT-核苷，2' -6-氨基烷基氨基-5' -ODMT-核苷，5' _6_氨基烷氧基-2'-脱氧-核苷，5' -6-氨基烷氧基-2-保护的-核苷，3' -6-氨基烷氧基-5' -ODMT-核苷，和可以在分子的核苷碱基部分被保护的3'-氨基烷基氨基-5' -ODMT-核苷。合成所述氨基-连接保护的核苷前体的方法是本领域那些技术人员已知的。在许多情形中，在制备本发明化合物的过程中使用保护基。用于本文时，术语"保护的"意为指定的结构部分具有附着于其上的保护基。在本发明的一些优选实施方案中， 化合物包含一个或多个保护基。可以将广泛多样的保护基用于本发明的方法中。通常，保护基使化学官能度对于特定的反应条件呈惰性，并且其可以附着于分子中的所述官能度或从其中去除，而不会明显损害分子的其它部分。代表性羟基保护基，以及其它代表性保护基在Greene和mits，Protective Groups in Organic Synthesis (在有机合成中的保护基)，第 2 章，第 2 版，John ffiley&Sons, New York，1991，禾口Oligonucleotide And Analogues A Practical Approach( 1 禾口gl以物，一种实践的方法)，Ekstein, F. Ed.，IRL Press, N. Y，1991 中公开。对于酸处理稳定的氨基-保护基选择性地用碱处理去除，并且用于制备选择性进行取代的反应性氨基。所述基团的实例是Fmoc (E. Atherton和R. C. Sheppard在The Peptides (Ii )中，S. Udenfriend, J. Meienhofer,编辑，Academic Press, Orlando, 1987, 卷9，第1页)以及由Nsc基团作为举例的各种取代的磺酰基乙基氨基甲酸酯(Samukov等， Tetrahedron Lett.(四面体通讯)，1994,35 :7821。另外的氨基-保护基包括，但不限于氨基甲酸酯保护基，如2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9_芴基甲氧基羰基(Fmoc)和苄氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基，如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基，如2-硝基苯磺酰基；和亚胺和环状二酰亚胺保护基如，苯二甲酰亚氨基和二硫代琥珀酰基。这些氨基-保护基的等价物也涵盖在本发明的化合物和方法中。许多固体支持物是商购的，并且本领域技术人员可以容易地选择固体支持物用于固相合成步骤中。在某些实施方案中，使用通用的支持物。通用的支持物允许制备具有位于寡核苷酸的3’ -末端的罕见或修饰的核苷酸的寡核苷酸。关于通用支持物的进一步详 1"青见 Scott 等，Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis (在固才目合成中的创新和远景)，第3届国际讨论会，1994，编辑Roger Epton，Mayflower Worldwide, 115-124]。此外，已经报道当寡核苷酸通过更容易进行碱性水解的syn-l，2-乙酰氧基磷酸酯基团结合于固体支持物时，所述寡核苷酸可以在更温和的反应条件下从通用支持物上裂解下来。见 Guzaev，Α. I. ；Manoharan, Μ. J. Am. Chem. Soc. 2003，125，2380。
核苷通过含磷或不含磷的共价核苷间连接进行连接。为了鉴定的目的，所述缀合的核苷可以表征为具有配体的核苷或配体-核苷缀合物。在它们的序列中具有缀合于核苷的芳烷基配体的连接的核苷当与未缀合的类似dsRNA化合物比较时显示增强的dsRNA活性。本发明的芳烷基-配体-缀合的寡核苷酸还包括寡核苷酸和连接的核苷的缀合物，其中所述配体直接连接于核苷或核苷酸，而不需要中间存在接头基团。配体可以优选地在配体的羧基、氨基或氧代基团通过连接基团连接。典型的连接基团可以是酯、酰胺或氨基甲酸酯基团。设想用于本发明的配体-缀合的寡核苷酸中的优选修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含修饰的骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如本文定义，具有修饰的骨架或核苷间连接的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。对于本发明的目的，在它们的糖间骨架间不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。在下面描述特定的寡核苷酸化学修饰。不需要对于给定化合物中的所有位置进行均一地修饰。相反地，可以将一个以上的修饰插入单一 dsRNA化合物中，或甚至插入其单一核苷酸中。优选修饰的核苷间连接或骨架包括，例如硫代磷酸、手性硫代磷酸、二硫代磷酸、 磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯，氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)和具有正常3' -5'连接的硼烷磷酸酯 (boranophosphates)，这些的2' -5'连接的类似物，和具有反向极性的那些，其中核苷单位的邻近对是3' -5与5' -3'连接或2' -5与5' -2'连接。还包括各种盐、混合的盐以及游离酸形式。涉及制备上述含磷原子的连接的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号 4，469，863 ；5，023，243 ；5，264，423 ；5，321，131 ；5，399，676 ；5，405，939 ；5，453，496 ； 5，455，233和5，466，677，将其每个结合在本文作为参考。其中不包含磷原子的优选修饰的核苷间连接或骨架(即寡核苷)具有由短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接或一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接(由核苷的糖部分部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含链烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基胼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；和具有混合的N，0，S和CH2成分的其它种类。涉及制备上述寡核苷的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号5，034，506 ； 5，214，134 ；5，216，141 ；5，264，562 ；5，466，677 ；5，470，967 ；5，489，677 ；5，602，240 和 5，663，312，将其每个结合在本文中作为参考。在其它优选的寡核苷酸模拟物中，将核苷单位的糖和核苷间连接，即骨架两者都用新基团替换。保持核苷碱基单位用于与适合的核酸靶化合物的杂交。将已经显示具有优越的杂交性质的一种这样的寡核苷酸，寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，将寡核苷酸的糖骨架用包含酰胺的骨架，具体地氨基乙基甘氨酸骨架替换。核苷碱基保留并直接或间接与骨架的酰胺部分的原子结合。关于PNA化合物的教导可以见于例如美国专利号5，539，082中。本发明的一些优选实施方案使用具有硫代磷酸连接的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷，并且具体为上述提及的美国专利号5，489，677的--CH2--NH--O--CH2-, -CH2--N(CH3) —O-CH2-[已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]，一CH2-O--N (CH3)-CH2-, -CH2-N (CH3) —N (CH3) -CH2-和一0—N (CH3) -CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架表示为一0__p一ο一CH2一]，以及上述提及的美国专利号5，602，240的酰胺骨架。还优选具有在上述美国专利号5，034，506中的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。在本发明的配体-缀合的寡核苷酸中使用的寡核苷酸可以另外或备选地包含核苷碱基(经常在本领域中简称为“碱基”)修饰或取代。用于本文时，“未修饰的"或" 天然的"核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然核苷碱基，如5-甲基胞嘧啶 (5-me-C)，5-羟基甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-烷硫基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代具体地5-溴，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核苷碱基包括在美国专利号3，687，808中公开的那些，在Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering(聚合物禾斗学禾口工禾呈化的简明百科全书)，858-859 页，Kroschwitz, J. I.，编辑 John Wiley&Sons，1990 中公开的那些，由 Englisch 等，Angewandte Chemie, International Edition, 1991，30，613 公开的那些，和由 Sanghvi, Y. S.,第 15 章，Antisense Research and Applications (反义石if究禾口应用), 289-302 页，Crooke, S. T.和 Lebleu，B.，编辑，CRC Press, 1993 公开的那些。这些核苷碱基中的某些种类特别用于增加本发明的寡核苷酸的结合亲和性。这些包括5-取代的嘧啶， 6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和 5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示增加核酸双链体稳定性达0.6-1. 2°C (Id., 276-278页)并且是目前优选的碱基取代，当与2'-甲氧基乙基糖修饰结合时是更特别优选的。涉及制备某些上述指出的修饰的核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的代表性美国专利包括，但不限于上述指出的美国专利号3，687，808，以及美国专利号5，134，066 ； 5，459，255 ；5, 552，540 ；5, 594，121和5，596，091，将其全部特此并入本文作为参考。在某些实施方案中，在本发明的配体-缀合的寡核苷酸中使用的寡核苷酸可以另外或备选地包含一个以上取代的糖结构部分。优选的寡核苷酸在2'位置包含下列之一 OH ；F ；0-, S-,或N-烷基，0-，S-,或N-烯基，或0，S-或N-炔基，其中所述烷基，烯基和炔基可以是取代或未被取代的C1-Cltl烷基或C2-Cltl烯基和炔基。特别优选0 [ (CH2) n0]mCH3,0 (CH2)n0CH3，0 (CH2) nNH2，0 (CH2) nCH3，0 (CH2) η0ΝΗ2，和 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2，其中 η 和 m 是 1 -约 10。其它优选的寡核苷酸在2'位置包含下列之一C1到Cltl低级烷基，取代的低级烷基， 烷芳基，芳烷基，0-烷芳基或 0-芳烷基，SH, SCH3, OCN，Cl，Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2,杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的甲硅烷基，和 RNA裂解基团，报道基团，嵌入剂，用于改善寡核苷酸药物代谢动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团，和具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2' -O-CH2CH2OCH3,也称为2' _0_(2-甲氧基乙基)或2‘ _M0E]，g卩，烷氧基烷氧基基团。其它优选的修饰包括2' - 二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团， 也称为2' -DMA0E，如在提交于1998年1月30日提交的美国专利号6，127，533中所述，将其内容结合在本文作为参考。其它优选的修饰包括2'-甲氧基O' -O-CH3), 2 ‘-氨基丙氧基 (2' -OCH2CH2CH2NH2)和2'-F)。还可以在寡核苷酸上的其它位置上进行类似的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置，或在2' -5'连接的寡核苷酸中。用于本文时，术语"糖取代基"或"2'-取代基基团"包括具有或不具有氧原子的连接于呋喃核糖基结构部分的2'-位置的基团。糖取代基包括，但不限于氟，0-烷基，0-烷基氨基，0-烷基烷氧基，保护的0-烷基氨基，0-烷基氨基烷基，0-烷基咪唑，和式 (0-烷基)m的聚醚，其中m是1-约10。在这些聚醚中特别优选直链和环状聚乙二醇(PEGs)， 以及包含(PEG)的基团，如冠醚，和特别地由Delgardo等公开的那些(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (在治疗药物载体系统中的关键综述)1992，9 : 249)，将其完整内容结合在本文作为参考。另外的糖修饰由CooHAnti-fibrosis Drug Design (抗纤维变性药物设计)，1991，6 =585-607)公开。氟，0-烷基，0-烷基氨基，0-烷基咪唑，0-烷基氨基烷基，和烷基氨基取代在题为〃 Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide (s) with 2' and 5' Substitutions (具有含有 2‘和 5'取代的嘧啶核苷酸的低聚化合物)的美国专利6，166，197中描述，将其全部内容结合在本文作为参考。本发明可使用的其它糖取代基基团包括2' -SR和2' 41 2基团，其中每个R 独立地为氢、保护基或取代或未被取代的烷基、烯基或炔基。2' -SR核苷在美国专利号 5，670，633中公开，将其全部内容结合在本文作为参考。2' -SR单体合成子的结合由Hamm 等(J. Org. Chem.，1997,62 :3415-3420)公开。2 ‘ -NR 核苷由 Goettingen, M.，J. Org. Chem.，1996，61,6273-6281 ；和 Polushin 等，^Tetrahedron Lett.(四面体通讯)，1996，37， 3227-3230公开。本发明可使用的另外的代表性2 ‘ _取代基团包括具有式I或式II之一的那些
权利要求
1.双链核糖核酸分子，其能够体外抑制GCR基因表达至少70%，优选至少80%和最优选至少90%。
2.权利要求1的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包括有义链和反义链，所述反义链与所述有义链至少部分互补，由此所述有义链包括序列，所述序列与编码 GCR的mRNA的至少一部分具有至少90%的同一性，其中所述序列(i)位于所述有义链与所述反义链互补的区域内；且(ii)其中所述序列长度小于30个核苷酸。
3.权利要求1-2的双链核糖核酸分子，其中所述有义链包括SEQID Nos =873,929, 1021，1023，967和905中描述的核酸序列，且所述反义链包括SEQ ID Nos =874,930,1022, 1024,968和906中描述的核酸序列，其中所述双链核糖核酸分子包括选自由SEQ ID NOs 873/874,929/930,1021/1022，1023/1024,967/968 和 905/906 组成的组的序列对。
4.权利要求3的双链核糖核酸分子，其中所述反义链还包括长度为1-5个核苷酸，优选长度为1-2个核苷酸的3'突出端。
5.权利要求4的双链核糖核酸分子，其中所述反义链的突出端包括尿嘧啶或与编码 GCR的mRNA互补的核苷酸。
6.权利要求3-5中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链还包括长度为1-5个核苷酸，优选长度为1-2个核苷酸的3'突出端。
7.权利要求6的双链核糖核酸分子，其中所述有义链的突出端包括尿嘧啶或与编码 GCR的mRNA同一的核苷酸。
8.权利要求1-7中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包括至少一个修饰的核苷酸。
9.权利要求8的双链核糖核酸分子，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组 2' -0-甲基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸基团的核苷酸，和与胆留醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸，2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸，反转脱氧胸苷， 2'-脱氧-修饰的核苷酸，锁定核苷酸，脱碱基核苷酸，2’ -氨基-修饰的核苷酸，2’ -烷基-修饰的核苷酸，吗啉代核苷酸，氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
10.权利要求8和9中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述修饰的核苷酸是 2' -0-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸基团的核苷酸、反转脱氧胸苷和脱氧胸苷。
11.权利要求3-10的双链核糖核酸分子，其中所述有义链和/或所述反义链包括1-2 个脱氧胸苷和/或反转脱氧胸苷的突出端。
12.权利要求1-11中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链选自由在SEQID Nos :3，7，55，25，83，31，33，747和764中描述的核酸序列组成的组，并且所述反义链选自由在SEQ ID Nos 4,8, 56，26，84，32，34，753和772中描述的核酸序列组成的组，其中所述双链核糖核酸分子包含选自由 SEQ ID NOs 3/4, 7/8，55/56，25/26,83/84, 31/32，33/34， 747/753和764/772组成的组中的序列对。
13.核酸序列，其编码包含在权利要求1-12中任一项所定义的双链核糖核酸分子中的有义链和/或反义链。
14.载体，其包含调节序列或包含权利要求13的核酸序列，所述调节序列与编码包含在权利要求1-12中任一项所定义的双链核糖核酸分子中的有义链或反义链的至少一种的核苷酸序列可操纵地连接。
15.细胞、组织或非人生物体，其包含权利要求1-12中任一项所定义的双链核糖核酸分子，权利要求13的核酸分子或权利要求14的载体。
16.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求 13的核酸分子，权利要求14的载体或权利要求15的细胞或组织。
17.权利要求16的药物组合物，其还包含药用载体、稳定剂和/或稀释剂。
18.抑制细胞、组织或生物体中GCR基因表达的方法，所述方法包括下述步骤(a)将权利要求1-12中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求13的核酸分子，权利要求14的载体引入所述细胞、组织或生物体中；和(b)在足以获得GCR基因的mRNA转录体降解的时间内维持在步骤(a)中产生的细胞、 组织或生物体，由此抑制GCR基因在所述细胞中的表达。
19.治疗、预防或处理由GCR基因表达导致的病理性病症和疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗、预防或处理的受试者施用治疗有效量或预防有效量的权利要求1-12中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求13的核酸分子，权利要求14的载体和/或权利要求16或17所定义的药物组合物。
20.权利要求19的方法，其中所述受试者是人。
21.权利要求1-12中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求13的核酸分子，权利要求14的载体和/或权利要求16或17所定义的药物组合物，用于治疗2型糖尿病、肥胖、 异常脂血症、糖尿病型动脉粥样硬化、高血压或忧郁症。
22.权利要求1-12中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求13的核酸分子，权利要求14的载体和/或权利要求15的细胞或组织用于制备药物组合物的应用，所述药物组合物用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症、糖尿病型动脉粥样硬化、高血压或忧郁症。
全文摘要
本发明涉及用于GCR基因表达的双链核糖核酸(ds RNA)。本发明还涉及包含所述ds RNA或编码其的核酸分子或载体以及药用载体的药物组合物；使用所述药物组合物治疗由GCR基因的表达导致的疾病的方法；和用于抑制GCR在细胞中的表达的方法。
文档编号A61P3/10GK102427852SQ201080021373
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月12日 优先权日2009年5月15日
发明者安德烈亚·福斯特, 布里吉特·斯科特, 比吉特·布拉姆利奇, 赖纳·康蒂恩, 阿格内斯·贝纳尔多, 雅克·巴伊, 马尔库斯·霍斯巴赫 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司