肽及其用途

肽及其用途
【专利摘要】本发明提供一种用于治疗和/或预防与T细胞介导的慢性炎性疾病相关的病症的方法，所述方法通过向患者施用抑制T细胞迁移的包含N’-SVTEQGAELSNEER-C’(SEQ?ID?NO:1)的肽或其类似物。本发明还提供用于治疗和/或预防所述病症的方法的肽或其类似物。
【专利说明】肽及其用途
[0001]本发明涉及对T细胞(包括自身反应性T细胞)的迁移具有抑制作用的分泌自B细胞的肽的用途。这可应用于治疗和/或预防与这样的T细胞相关的病症，最显著地是I型糖尿病。
[0002]引言
[0003]胰岛反应性T细胞在β细胞破坏中起核心作用并因此在I型糖尿病(TlD)的发病机制中起核心作用。明显地，在TlD胰腺中T细胞包含大部分的胰岛渗入物，并且靶向T细胞的免疫抑制性药物保持β细胞功能。理解胰岛反应性T细胞从血液募集，越过发炎的内皮，并进入胰岛中的机制在TlD中没有被很好地检查。
[0004]这是特别相关的，因为健康的人也可以具有不表现为有害的循环胰岛反应性T细胞。因此，我们认为在TlD中，禁止反应性T细胞运输到胰腺中的内源性机制失效，并且如果这样的调控途径可以再建立，则会有可能排除自身反应性T细胞并保持β细胞功能。来源于脂肪细胞的细胞因子脂连蛋白在调控T细胞迁移中起作用，但是情景比当在TlD中脂连蛋白的循环水平似乎不波动时更复杂。
[0005]惊人地，我们已发现某种肽可以抑制T细胞迁移。尽管这种肽是已知的，但是我们证实的是，脂连蛋白通过诱导从B淋巴细胞释放的介体而实现其对T细胞迁移的作用。这种介体(一种肽)看起来是T细胞跨内皮迁移的抑制剂。
[0006]发明概述
[0007]所述肽具有序列N’ -SVTEQGAELSNEER-C’或是其抑制T淋巴细胞迁移的类似物。
[0008]因此，在第一个方面，本发明提供一种用于治疗和/或预防与T细胞介导的慢性炎性疾病相关的病症的方法，所述方法通过向有需要的患者施用包含N’-SVTEQGAELSNEER-C’的肽。所述肽还可以是其抑制T淋巴细胞迁移的类似物或变体。
[0009]所述病症任选地选自由以下各项组成的组:T细胞自身反应性，T细胞介导的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。备选地，所述病症可以是T细胞自身反应性或T细胞介导的慢性炎性疾病或自身免疫疾病。
[0010]应当理解，术语T细胞和T淋巴细胞在本文中可以互换。T细胞的迁移任选地是夸内皮的。内皮任选地是分隔胰岛细胞与血液供给的胰腺微血管系统的内皮。
[0011]所述肽任选地是分离的肽。所述肽可以是合成的(即化学合成的，例如以与小分子药物相同的方式)或它可以重组地生产，例如在单独的细胞系统(细胞培养物)或动物中。
[0012]我们已发现是有用的肽的氨基酸序列为SVTEQGAELSNEER(SEQ ID NO:1)。这个序列可以包含在更大的肽或蛋白质、或嵌合或融合蛋白内。备选地，所述肽可以仅由SEQID NO:1构成。所有这些都落入如本文所用的肽的定义中。根据SEQ ID NO:1的肽表示14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白的氨基酸28-41，其又是YWHAZ基因的245个氨基酸的产物。
[0013]还优选的是，可以使用所述肽的类似物或变体。这方面特别优选的是基于保守氨基酸置换的类似物(或变体)。优选的肽为14个氨基酸长，尽管所述肽也可以少达13、12、11或10个氨基酸或多达15、16、1718、19或20个氨基酸。当插入或去除氨基酸时，这些优选插入到所述肽的N和/或C末端或从其N和/或C末端去除。保护所述肽免于体内降解或清除的化学结构的其他修饰也是优选的变体，例如但不限于，利用本领域已知的接头或间隔物的PEG化(PEGylat1n)。最优选地，相比于SVTEQGAELSNEER，任何类似物应保留或改进所期望的功能，即抑制T细胞迁移。这可以通过对互有关系的受体(cognate receptor)的亲和性的变化或改变所述肽在体内的药代动力学特征的变化。应当理解，现在在现有技术中是改变肽化学来增加肽在体内的药理‘特征’，并且这些变化不仅是基于氨基酸置换。
[0014]本文将提及肽，但应理解，除非另有说明，这也涵盖其任何类似物。
[0015]肽的作用可以作为其互有关系的受体的激动剂。
[0016]T细胞迁移的抑制可以是例如从血液中将所述细胞募集至胰腺。
[0017]任选地，T细胞是自身反应性T细胞。这些可以优选地靶向胰腺，尤其是胰腺的胰岛细胞。T细胞可以是⑶4+或⑶8+。
[0018]在一个特别优选的实施方案中，所述肽用于抑制(即减少)自身反应性T细胞募集至胰腺的胰岛。
[0019]应当理解，所述肽作用于其施用的个体。同样，任何T细胞的自身反应性是针对来自该个体的自身(即胰腺的胰岛细胞)的反应性。所述个体是哺乳动物，任选地，啮齿动物如大鼠或小鼠，或灵长类动物，特别是猿和人。
[0020]当肽的存在用于抑制T细胞的迁移时，增加个体被暴露的肽的量将用于进一步抑制所述迁移。任选地，迁移的抑制水平使得迁移减少至少50% (依据被募集的T细胞的数量)，但最优选地这种减少为至少60 %，更优选地至少70 %，更优选地至少80 %，更优选地至少90 %，更优选地至少95 %，更优选地至少99 %并且最优选地减少至可忽略水平。当然，理想地，没有T细胞将迁移，但这可能不现实，并且事实上，所需的一切在于，靶组织(例如胰岛细胞)的正常功能被很大程度上保持和/或回转(或至少尽可能接近正常水平或期望减轻要治疗的病症)。
[0021]本发明的肽因此最可用于治疗大量病症。这些包括其中T细胞在与T细胞自身反应性相关的病理学或病症中起作用的那些疾病。这些可以包括T细胞介导的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。糖尿病(I型)是特别优选的。还预期青少年型糖尿病(juvenile onsetdiabetes),类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和克罗恩氏病(Crohn’s disease),动脉粥样硬化(atherosclerosis),银屑病(psoriasis),炎性和纤维化肝病(包括脂肪性肝炎(steatohepatitis)和肝硬化(cirrhosis))以及葡萄膜炎(uveitis)。因此所述肽优选发挥作用以治疗任何上述疾病，但最优选地是I型糖尿病(TlD)。所述肽可以被视为用于挽救或保持剩余的胰腺功能。这可以是由于自身反应性T细胞攻击所致而发生的丧失功能。所述肽可以被视为用于改善糖尿病结果，即减少TlD的症状。所述肽还可以被视为用于改善与胰腺功能丧失相关的其他病状，其包括与胰腺功能丧失相关、(又)与TlD相关的肾(例如肾病；糖尿病肾病)，神经(例如外周神经病)和心血管并发症(例如由于加速的动脉粥样硬化所致的糖尿病视网膜病和心脑疾病)。因此，所述肽可以最有用于治疗和/或预防上述病症，特别是TlD及其共发病(如所述的)。
[0022]本发明还提供编码所述肽的多核苷酸序列，其也可用于治疗和/或预防任何上述病症。所述多核苷酸可以是DNA，RNA或DNA/RNA杂交物(DNA/RNA hybrid)。这种多核苷酸编码所述肽或其类似物。尽管存在相当大量的可能组合，但是我们提供编码SVTEQGAELSNEER (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的多核苷酸的至少两个实例。它们是:
[0023]5， -AGU GUU ACU GAA CAA GGU GCU GAG UUA UCU AAU GAG GAG AGA-3，
[0024](SEQ ID NO:2);或
[0025]5， -AGC ⑶C ACC GAG CAG GGC GCC GAA UUG UCC AAC GAA GAG AGG-3’
[0026](SEQ ID NO:3)。
[0027]以上序列仅是实例，并且以RNA形式给出，但是本发明还提供其DNA形式(其中T替代U)和DNA/RNA杂交形式，以及RNA，DNA和RNA/DNA杂交形式的互补序列(该互补序列为RNA，DNA或DNA/RNA)。优选具有至少80 %序列同源性的变体，该变体编码例如与SEQID NO:1至少50%同样有效的肽。还优选具有至少功能85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少99%序列同源性的变体(舍入成最接近的整数)。这例如可以通过程序如BLAST确定。
[0028]还提供质粒(即构建体)，所述质粒包含编码所述肽(或其类似物或变体)的多核苷酸。该多核苷酸优选可操作地连接于合适启动子。该启动子可以是例如胰腺-特异性启动子。
[0029]编码所述肽的多核苷酸可以通过施用含有所述多核苷酸或与其结合的合适载体进行递送。实例包括所谓的基因枪(gene gun)，其中所述多核苷酸可以附着于被发射通过皮肤的金粒子。备选地，并且更优选地，多核苷酸(例如包含其的质粒)可以封装在病毒载体或衣壳内。优选的实例包括腺病毒载体。优选祀向胰腺的那些。
[0030]肽的施用可以通过肽本身的递送，例如以药用制剂的形式，或通过编码所述肽的多核苷酸的递送和表达，例如以上述形式。这些例如可以通过注射被递送至血液。这可以是肌肉内或皮下地。这些也可以经由粘膜如口腔粘膜、鼻粘膜或直肠粘膜递送。这些也可以以喷雾或片剂的形式或者以栓剂的形式递送。这些也可以经口摄入到胃中，尽管在肽的情况下，这可能需要提供前药形式的肽以减轻或对抗GI消化的作用。
[0031]尽管一方面可用，但应当理解，不必需是这样的情况，即所述肽或编码其的多核苷酸是或需要是靶向在或至胰腺(至少对于TlD)。任选地，因此，对于肽递送，增加的血浆中的系统呈现是所需的一切。不需要特定地递送至胰腺。然而，在备选的实施方案中，可以使用特定地递送至胰腺，因为这可以增加效力。这同样适用于多核苷酸。
[0032]直接靶向至胰腺被考虑，作为靶向的基因疗法的一部分，包括编码所述肽的多核苷酸。
[0033]还提供了一种药用组合物或制剂，其包含本文中所述的肽、多核苷酸、质粒或病毒载体。任选地，所述药用组合物包含所述肽并且适用于注射或摄入。
[0034]如上解释的，预期治疗和/或预防上述病症，特别是与T细胞介导的慢性炎性疾病相关的病症，包括T细胞自身反应性，T细胞介导的慢性炎性疾病和自身免疫疾病的方法。糖尿病(I型)是特别优选的。还预期青少年型糖尿病，类风湿性关节炎和克罗恩氏病，动脉粥样硬化，银屑病，炎性和纤维化肝脏疾病(包括脂肪性肝炎和肝硬化)和葡萄膜炎，以及任何上述病状。所述方法可以包括以本文中描述的任何方式向有此需要的患者施用治疗量的所述肽或多核苷酸。
[0035]因此，提供一种方法，所述方法治疗和/或预防T细胞介导的慢性炎性疾病相关的病症，包括T细胞自身反应性，T细胞介导的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。特别地，所述病症是糖尿病(I型)。然而，所述病症也可以选自由以下各项组成的组:青少年型糖尿病；类风湿性关节炎；克罗恩氏病；动脉粥样硬化；银屑病；炎性和纤维化肝脏疾病(包括脂肪性肝炎和肝硬化)；和葡萄膜炎；或所述病症可以选自由以下各项组成的组:肾病；糖尿病肾病；外周神经病；糖尿病视网膜病；和心脑疾病。
[0036]所述方法可以是用于治疗所述病症或者是治疗所述病症的方法。备选地，所述方法可以是用于预防所述病症或者可以是预防所述病症的方法。备选地，所述方法可以是它们的任意组合。
[0037]还提供用于治疗和/或预防本文所述的病症的肽和/或编码其的多核苷酸。本文中方法的提及包括这样的用途。
[0038]附图简述
[0039]现在将参考附图描述本发明，其中:
[0040]图1:脂连蛋白抑制外周血淋巴细胞(PBL)的跨内皮细胞迁移；
[0041 ] 图2:用化合物C抑制AMPK恢复PBL的迁移；
[0042]图3:来自TlD患者的PBL释放自脂连蛋白对跨内皮细胞迁移的抑制作用；
[0043]图4:脂连蛋白受体在PBL上的表达在患有TlD的患者中减少；
[0044]图5:脂连蛋白受体在TlD或健康对照受试者中的表达与通过脂连蛋白的淋巴细胞迁移的抑制相关联；
[0045]图6:脂连蛋白受体在不同血细胞亚类上的表达；
[0046]图7:B细胞介导T细胞迁移的脂连蛋白诱导的抑制；
[0047]图8:B细胞通过分泌肽调节PBL变移(transmigrat1n)；
[0048]图9显示分泌的肽的序列和14.3.3蛋白质的不同同种型；
[0049]图10:来自B细胞上清的MS/MS母离子m/z 774.88和合成形式的所述肽的比较；
[0050]图11:在体外所述肽抑制穿过内皮细胞的T细胞迁移；和
[0051]图12:在有或没有所述肽下在野生型或B细胞敲除小鼠的发炎的腹膜中的T细胞的绝对数量。
[0052]图13:脂连蛋白(Aq)对外周血淋巴细胞的跨内皮细胞迁移的作用。
[0053](A)在静态粘附测定中进行的EC50为?40nM的剂量响应。
[0054](B)在基于流动的测定(模拟血液流动)中的15 μ g/ml Aq对淋巴细胞迁移的作用。
[0055](C)抑制途径对于分离自不同组织(HUVEC =脐带；HSAVEC =隐静脉；HSEC =肝窦内皮细胞；HDMEC =真皮微血管内皮)的内皮细胞是有效的。
[0056]⑶AMP-激酶抑制剂对脂连蛋白的作用的影响。AMPK是脂连蛋白_受体信号转导所需的信号转导连接物。
[0057]图14:脂连蛋白介导的T细胞运输的抑制需要B细胞。
[0058]15 μ g/ml的Aq显著减少穿过内皮细胞的淋巴细胞迁移。从外周血淋巴细胞制剂除去B细胞完全抑制这种响应。这可以使用来自Aq刺激的B细胞的上清重建，也可以有效抑制淋巴细胞迁移，但当上清是在布雷菲德菌素-A (Brefeldin-A)( 一种B细胞分泌的抑制齐U)存在下制备时这种作用丧失。这些数据证实，需要释放自B细胞的可溶性介体。
[0059]图15:释放自B细胞的14氨基酸肽调控T细胞运输
[0060]图16:PEPITEM抑制T细胞变移
[0061]A)合成的肽在抑制淋巴细胞的变移方面高度有效，而对照肽，包括打乱的(scrambled)形式(天然肽序列的随机重组)在抑制淋巴细胞迁移方面无效。
[0062]B)所述肽具有的EC50为?20pM。由于它有效地抑制穿过内皮细胞的淋巴细胞迁移，所以我们将所述试剂称为跨内皮迁移的肽抑制剂；“PEPITEM”。
[0063]图17:PEPITEM抑制T细胞迁移并且促进抗炎调节性T细胞的募集
[0064]PEPITEM以与脂连蛋白相同模式抑制穿过EC的T细胞迁移㈧；它在抑制记忆性⑶4+和⑶8+T细胞的迁移方面有效，但它对嗜中性粒细胞或单核细胞(包括⑶16-和⑶16+亚类)没有作用。天然淋巴细胞没有在这种分析进行评估，因为它们不粘附至内皮细胞单层(B)。令人关注地，调节性T细胞(T-regs)(其具有抗炎功能)的迁移的效率通过PEPITEM增加(C)。
[0065]图18:PEPITEM不直接调节T细胞迁移。
[0066]同样，PEPITEM作用的最明显模式是通过直接调节T细胞的迁移功能。然而，事实并非如此。当PBL用PEPITEM处理并且所述试剂在内皮上测定之前被洗掉时，淋巴细胞迁移的效率不受影响。然而，用PEPITEM预处理内皮细胞导致对淋巴细胞运输的抑制。因此，PEPITEM通过刺激内皮细胞释放抑制T细胞运输的试剂而运行。
[0067]图19:通过内皮细胞的鞘氨醇-1-磷酸(SlP)合成的诱导抑制T细胞迁移。
[0068]由于PEPITEM不直接抑制淋巴细胞迁移，所以我们测试了这样的假设，即其他组织中的淋巴细胞运输的已知调节剂鞘氨醇-1-磷酸(SlP)是此途径中的最终步骤。
[0069]A) SlP-受体拮抗剂(W146)从脂连蛋白的抑制作用释放淋巴细胞
[0070]B) SlP-受体拮抗剂(W146)从PEPITEM的抑制作用释放淋巴细胞
[0071]C)加入外源性SlP剂量依赖性地抑制T细胞迁移
[0072]D)内皮细胞表达鞘氨醇激酶-1 (SPHKl)但不表达鞘氨醇激酶_2 (SPHK2)
[0073]E) SPHKl的抑制剂从PEPITEM的抑制作用释放淋巴细胞
[0074]图20:当细胞被固定在ICAM上并且用IP1(CXCL1)活化时，SlP调节淋巴细胞整联蛋白 LFA-1 (CDlla/CD18 ; a LP 2)的亲和性
[0075](A) KMl27用于中间亲和位点，和
[0076](B)抗体24用于用SlP处理的记忆性T细胞上的高亲和性表位。
[0077]图21:在有或没有所述肽存在下在野生型或B细胞敲除小鼠的发炎的腹膜中的T细胞的绝对数量。
[0078]A T细胞募集到Jh-/-(B-细胞敲除动物)的腹膜中在基线处(即在用PBS攻击后)大于野生型动物。在用酵母聚糖(zymosan)腹膜内注射攻击后，T细胞数量在野生型动物中增加。在B细胞敲除小鼠中T细胞数量显著且明显增加并且这在PEPITEM存在下显著减少，但在打乱的肽存在下不是这样。
[0079]B当相比于野生型动物时，在用无伤寒沙门氏菌感染攻击后，T细胞到B细胞敲除动物的肝中的募集增加。
[0080]图22:脂连蛋白/PEPITEM途径在患有I型糖尿病的患者中改变
[0081]在I型糖尿病患者中，相比于健康的老化的匹配的对照，脂连蛋白受体的表达显著减少(A和B)。通过脂连蛋白的淋巴细胞运输的抑制与B细胞上的脂连蛋白受体的表达水平显著相关(C)，使得患者和健康的群体在相关性图表上分成离散的簇。重要地，尽管患者淋巴细胞对通过脂连蛋白的刺激是顽固的(D)，但是对这些细胞，通过添加外源性PEPITEM,抑制途径可以被重现。
[0082]发明详述
[0083]W02007127935涉及组蛋白脱乙酰酶HDAC7。其着手鉴别脱磷酸化HDAC7的磷酸酶并且发现大量结合至HDAC7的蛋白质，包括本文中描述为SEQ ID NO NO:1的肽。该文献的重点在于肌球蛋白磷酸酶(MYPTl)的“靶亚基”也结合HDAC7，并且因此教导是针对经由肌球蛋白磷酸酶的该亚基的HDAC7和肌球蛋白磷酸酶之间的相互作用。没有提及我们的肽具有任何价值，也没有提及它干扰HDAC7-肌球蛋白磷酸酶相互作用。US2002164668(A1)和US20030064411(A1)关于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)披露了我们的肽以及包含其的药物制剂/组合物。US20040053309(A1)也披露了我们的肽，但涉及鉴别与对毒性效应物的肾脏响应相关的蛋白质和蛋白质同种型。然而，没有任何现有技术公开我们的肽或其类似物的用途。
[0084]我们已关注于来源于脂肪细胞的细胞因子(脂连蛋白)调节人T细胞到发炎的内皮的募集的能力。之前，脂连蛋白缺陷小鼠显示在白细胞粘附至内皮细胞方面具有两倍增加，并且重要地，白细胞募集通过加入重组脂连蛋白正常化。在我们的体外研究中，我们使用静态transwell测定，以及基于流动的粘附测定来跟踪T细胞(其在外周血淋巴细胞[PBL]的粗分离物中)穿过TNF-α和IFN-Y刺激的内皮细胞的迁移。脂连蛋白剂量依赖性地阻断T细胞迁移(图1)。
[0085]脂连蛋白对T细胞变移的作用由通过脂连蛋白受体(ARl和AR2)的信号转导介导。AMP-活化的蛋白质激酶(AMPK)是自ARl和AR2的下游信号转导中的关键中间体，并且当PBL用AMPK抑制剂(化合物C)预处理30分钟时，脂连蛋白对T细胞迁移的抑制的作用被消除，即T细胞迁移恢复到在没有脂连蛋白下观察到的水平(图2)。化合物C在没有脂连蛋白下对迁移不具有任何作用。
[0086]重要地，我们发现脂连蛋白介导的T细胞迁移的抑制在患有TlD的患者中显著受损，即在我们的体外迁移测定中脂连蛋白调节T细胞募集的能力在使用分离自TlD的PBL时丧失(图3)。我们现在已证实，在TlD中的淋巴细胞上，ARl和AR2都被显著下调(图4)，并且在体外脂连蛋白介导的T细胞迁移的抑制的水平强烈地与TlD中这些受体的表达相关，达到这样的程度，即当在内皮细胞变移测定中将受体密度相对于对脂连蛋白的敏感性进行绘图时患者和健康对照群体独立地成簇(图5)。
[0087]我们不认为脂连蛋白代表在TlD中用于调节T细胞募集的合适靶标。其在循环中的浓度在TlD中没有改变，表明不同于其生物利用度的脂连蛋白生物学的特征是功能的重要决定者。此外，脂连蛋白是在代谢稳态中具有重要作用的多效试剂，这提高严重脱靶副作用的可能性。
[0088]相反，我们认为靶向脂连蛋白(其调节T细胞迁移)下游的途径将提供更大精确性的治疗方式。因此，我们现在继续明确地证实，脂连蛋白通过诱导新的介体来实现其对T细胞迁移的作用，该介体我们认为是释放自B淋巴细胞的跨内皮迁移的肽抑制剂。重要地，B淋巴细胞表达脂连蛋白受体，所以可以以适当方式响应于通过此试剂的刺激(图6)。
[0089]此外，如果B细胞从混合的淋巴细胞制剂(PBL)中去除，则通过脂连蛋白的T细胞迁移的抑制丧失，并且如果将分离的B细胞添加至T细胞的纯化的制剂中，则重新获得T细胞迁移的抑制(图7a)。令人关注地，自然杀伤淋巴细胞(NK细胞)，其也表达高水平的脂连蛋白受体(图6)，不能够调节T细胞的迁移(图7b)，表明T细胞迁移的调节排他地通过B淋巴细胞而不是PBL群的其他细胞组分介导。
[0090]B细胞通过分泌所述肽而介导其在这种系统中的作用。因此，通过脂连蛋白刺激的B细胞调节的上清可以有效地抑制T细胞迁移(图8)。此外，当布雷菲德菌素A(其是B细胞分泌途径的抑制剂)用来抑制所述肽从B细胞释放到该调节的介质中时，调节的上清的作用丧失，参见(图8)。
[0091]我们现在已经确定地鉴别了响应于脂连蛋白刺激的释放自B细胞的分泌的肽。利用质谱分析，脂连蛋白调节的B细胞上清，以及相关对照上清通过LC-MS/MS纯化并分析。蛋白质序列数据库的比较分析揭示了对脂连蛋白调节的B细胞上清独特的单个候选肽，其描述于下表I中。
[0092]
~洗脱时间(min)评分修饰相关蛋白质序列 774.88 13.263.1 NA14-3-3 ζ/δ SVTEQGAELSNEER
[0093]表1:通过B细胞上清的比较分析揭示的所述肽的候选肽
[0094]由于断裂分析的统计学严格性，软件能够以高精度概率提供确定的序列并且鉴别14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ )蛋白质作为前体蛋白质。事实上所述肽表示14.3.3 ζ δ蛋白质的氨基酸28-41，14.3.3 ζ δ蛋白质又是YWHAZ基因的245个氨基酸的产物。严格数据库检索证实，所述肽序列对此蛋白质是独特的，并且甚至不是14.3.3蛋白质家族的其他六个成员都有的(图9)。所述肽不是免疫调剂分子的任何已知家族的成员并且由于其化学所致而具有引人关注的治疗潜力。
[0095]我们已经能够成功地合成所述肽。来源于B细胞的肽和合成形式的比较分析显示在质谱分析中的相同质量:电荷比，显示天然肽在从14.3.3.ζ/δ蛋白质切除和从B细胞分泌之前没有经过翻译后修饰(图10)。
[0096]所述肽在体内外都具有效力。使用合成的肽，我们构建了在我们的T细胞迁移的体外测定中的剂量响应曲线(图U)。所述肽在此测定中具有的EC50为?20ρΜ。我们还将所述肽用于急性、酵母聚糖诱导的腹膜炎的体内模型中(图12)。在此模型中，我们第一次证实B淋巴细胞(所述肽的细胞来源)的敲除导致T淋巴细胞募集到腹膜腔中的增加。我们随后在将所述肽注入B细胞敲除小鼠的血液和腹膜腔中后进行实验。所述肽能够显著地减少在用酵母聚糖攻击后T细胞到腹膜的募集(图12)。
[0097]不受理论束缚，我们理解以下表示在炎症期间PEPITEM调节穿过内皮细胞的T细胞运输的范例:脂连蛋白，通过受体Adipo-Rl和Adipo-R2 (AR1/2)操作，刺激免疫调节性肽PEPITEM从B细胞释放，其在发炎期间被募集至内皮细胞表面。PEPITEM通过其相关受体刺激内皮细胞，促进鞘氨醇-1-磷酸(SlP)的形成和释放。SlP又通过SlP-受体S1PR1/4刺激在发炎期间被募集至内皮细胞表面的T细胞，其是一种抑制T细胞穿过内皮细胞屏障并进入发炎组织的运输的能力的信号。
[0098]以下实施例提供对于体内外研究中这种途径的功能的实验证据，证实与人的慢性自身免疫疾病相关的途径功能的变化，并且描述同一性PEPITEM肽。
[0099]实施例1
[0100]脂连蛋白抑制外周血淋巴细胞(PBL)的跨内皮细胞迁移。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-α /IFN-Y刺激24小时。分离PBL并用0.0001至15 μ g/ml的脂连蛋白处理一小时。
[0101]结果示于图1，其中部分(a)显示在静态粘附测定中PBL变移通过脂连蛋白显著且剂量依赖地减少；部分(b)显示如通过线性回归确定的，脂连蛋白具有的EC50为0.94 yg/ml ;并且部分(c)显示在基于流动的粘附测定中脂连蛋白在抑制PBL迁移方面同样有效。数据是至少三个独立实验的代表并且利用t-检验、单向ANOVA和Dunnett的多重比较事后检验(Dunnett，s multiple comparisons post-test)进行分析。*p ^ 0.01,**p ^ 0.001,
***p ^ 0.0001。
[0102]用化合物C抑制AMPK恢复PBL的迁移。
[0103]内皮细胞在低血清培养基中培养并用TNF- a /IFN- Y刺激24小时。将化合物C以10 μ g/ml加入至PBL达30分钟，然后以15 μ g/ml添加脂连蛋白达I小时。脂连蛋白处理诱导变移减少，其在化合物C存在下恢复至正常、对照水平。结果示于图2，其中数据是三个实验的代表并且利用单向ANOVA和Dunnet的多重比较事后检验进行分析。**p ( 0.001，
***p ^ ο.0001。
[0104]来自TlD患者的PBL释放自脂连蛋白对跨内皮细胞迁移的抑制作用。
[0105]内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-a /IFN-Y刺激24小时。结果示于3。部分a)显示脂连蛋白介导的PBL变移的抑制在TID中丧失；并且部分b)显示抑制的百分比通过用在脂连蛋白处理的情况下的变移的百分比除以未处理的PBL的变移的百分比进行计算。HC组η = 13并且TlD组η = 12。数据利用t_检验和单向ANOVA和Bonferonni的多重比较事后检验进行分析。0.0001。
[0106]脂连蛋白受体在PBL上的表达在患有TlD的患者中减少。
[0107]确定每个健康或患病受试者的表达脂连蛋白受体ARl或AR2的PBL的频率并且分别示于图4a)和4b)。数据表示为平均值土SEM并且当数据没有通过Kolmogorov-Smirnov正态性检验时利用t-检验或Mann Whitney t_检验进行分析。
[0108]在TlD或健康对照受试者中的脂连蛋白受体的表达与通过脂连蛋白的淋巴细胞迁移的抑制相关。
[0109]图5a)显示ARl的表达和淋巴细胞迁移的抑制之间的相关性，而图5b)显示AR2的表达和淋巴细胞迁移的抑制之间的相关性。使用线性回归分析确定相关性。
[0110]脂连蛋白受体在不同白细胞亚类上的表达。
[0111]图6a)和b)显示ARl (图6a)和AR2(图6b)在不同细胞型上的表达。数据是平均值土SEM并且是七个健康对照的代表。数据利用单向ANOVA和Bonferonni多重比较事后检验进行分析。***p ( 0.0001。
[0112]B细胞介导脂连蛋白诱导的T细胞迁移的抑制。
[0113]图7a)显示PBL的迁移在其缺少B细胞(Bs)时丧失并且在将B细胞加回到分离的T细胞中时重新获得。图7b)显示自然杀伤细胞的迁移不受脂连蛋白的影响并且NK添加到T细胞中不调节T细胞的迁移。数据是平均值土SEM并且是至少三个独立实验的代表。数据利用单向ANOVA和Bonferonni多重比较事后检验进行分析。^ 0.001,***p ^ 0.0001。
[0114]B细胞通过分泌肽调节PBL变移。
[0115]分离B细胞并在有或没有15 μ g/ml脂连蛋白的情况下进行温育。在一小时后提取上清并加入到Bs-ve PBL中，其显著恢复PBL变移的脂连蛋白抑制。对于一些实验，B细胞用布雷菲德菌素A(B细胞分泌的一种抑制剂)处理。这些上清不能调节T细胞的迁移。这示于图8，其中数据显示为平均值土SEM并且是三个独立实验的代表，利用单向ANOVA和Bonferonni多重比较事后检验进行分析。***p〈0.001, ns =非显著的。
[0116]确定所述肽的序列并且其连同14.3.3蛋白质的不同同种型示于图9。也参见上表
1
[0117]来自B细胞上清的MS/MS母离子m/z 774.88和所述肽的合成形式的比较。
[0118]离子m/z 774.88是分析方案的断裂产物并且通常仅用于使用MS/MS的鉴别，但可以是用于比较的重要参数。
[0119]来自B细胞上清的母离子m/z 774.88和所述肽的合成形式的质谱特征分析的比较示于图10，其揭示了相同了质量:电荷比。这确认了序列同一性并且显示所述肽在分泌之前没有经过翻译后修饰。
[0120]所述肽在体外抑制穿过内皮细胞的T细胞迁移。
[0121]PBL用脂连蛋白(15 μ g/ml，作为阳性对照)或浓度为0.001至10ng/ml的所述肽处理，打乱的肽用作阴性对照(使用的10ng/ml)。还使用其他生物活性肽以证明所述肽的特异性(即10ng/ml的破伤风类毒素肽(TTp)和10ng/ml的胰岛素原(PI))。结果示于图
11。图1la)显示PBL变移在所述肽存在下剂量依赖性地减少，但在打乱的肽、TTp或PI对照存在下非如此。图1lb)显示所述肽的EC50(18.6pM)使用非线性回归分析进行计算。数据是三个独立实验的代表并且利用单向ANOVA和Bonfeironi多重比较事后检验进行分析。*p ^ 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001。
[0122]在有或没有所述肽的情况下在野生型或B细胞敲除小鼠的发炎的腹膜中的T细胞的绝对数量。
[0123]在有或没有所述肽或打乱的肽的情况下，在注射酵母聚糖(或PBS作为对照)48小时后，从腹膜收集白细胞。通过⑶3的表达鉴别T细胞。所述肽或打乱的肽以300 μ g/小鼠的终浓度注射。结果示于图12，其中每个组的数据是平均值并且利用单向ANOVA和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*p < 0.01。
[0124]实施例2
[0125]此实施例显示进行的进一步工作的结果并由此致意实施例1。
[0126]脂连蛋白(AQ)对外周血淋巴细胞(PBL)的跨内皮细胞迁移的作用。
[0127]参考图13。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白的情况下用TNF- a /IFN- Y刺激24小时。分离PBL并用0.0OOl至15 μ g/ml的脂连蛋白处理一小时。部分(a)显示在静态粘附测定中PBL变移通过脂连蛋白显著且剂量依赖地减少，以及如通过线性回归确定的，脂连蛋白具有的EC50为?40nM;并且部分(b)显示在基于流动的粘附测定中，脂连蛋白在抑制PBL迁移方面同样有效；并且部分(c)显示脂连蛋白对分离自不同组织如HUVEC (脐带)，HSEC (肝窦内皮细胞)和DMEC (真皮微血管内皮)的内皮细胞是有效的，但是对HSAVEC(隐静脉)不是有效的。在部分(d)中，化合物C(AMP-激酶抑制剂)以10 μ g/ml添加到PBL中达30分钟，然后添力口 15 μ g/ml的脂连蛋白达I小时。AMPK是脂连蛋白-受体信号转导所需的信号转导连接物。脂连蛋白处理诱导变移减少，其在化合物C存在下恢复至正常对照水平。这些数据表明，脂连蛋白具有强的通过作用于其在PBL上表达的受体而调节淋巴细胞的变移的能力。数据是至少三个独立实验的池并且利用t-检验、单向ANOVA和Dunnett多重比较事后检验进行分析。**p ^ 0.01, ***p ^ 0.0Ol0
[0128]T细胞不具有脂连蛋白受体。
[0129]之前实验的最简单的解释是，T细胞处于Aq的直接控制下。然而，T细胞缺少适当的受体。然而，其他白细胞确实具有Adipo-Rl/2并且单核细胞和B细胞都显示高水平的表达。
[0130]脂连蛋白受体AdipoRl和AdipoR2 二者的表达使用兔抗-人脂连蛋白受体I和2抗体(Phoenix peptides)通过流式细胞术在PBMC上测量。脂连蛋白受体表达相对于PBMC亚群的pan标记物(垂直轴)示于水平轴上。AdipoRl和AdipoR2在单核细胞(⑶14+)上和在B细胞(⑶19+)上高表达，但在T细胞(⑶3+)上以极低水平表达。这表明脂连蛋白不能直接控制T细胞迁移。
[0131]脂连蛋白介导的T细胞运输的抑制需要B细胞。
[0132]参考图14。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白的情况下用TNF- a /IFN- Y刺激24小时。在有或没有脂连蛋白(lSyg/ml)的情况下，在使用小珠阳性选择去除B细胞后和在利用使用小珠阴性选择分离的B细胞重建后测量PBL变移。来自脂连蛋白处理的B细胞或用布雷菲德菌素A处理以阻断蛋白质分离的B细胞的上清加入到PBL 中。
[0133]从外周血淋巴细胞制剂去除B细胞完全抑制这种响应。这可以利用来自脂连蛋白刺激的B细胞(其也可以有效地抑制淋巴细胞迁移)重建，但这种作用在上清在布雷菲德菌素-A (B细胞分泌的抑制剂)存在下制备时丧失。这些数据证实，需要释放自B细胞的可溶性介体。
[0134]数据是至少三个独立实验的池并且利用单向ANOVA和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*p ( 0.05, ***ρ 0.0Olo
[0135]释放自B细胞的14个氨基酸的肽调节T细胞运输
[0136]参考图15。B细胞使用阴性选择分离并用脂连蛋白温育一小时。回收上清并在C18柱上纯化以除去大尺寸蛋白质并通过质谱获取。利用来自AQ刺激的B细胞的上清的质谱的蛋白质组分析揭示具有序列SVTEQGAELSNEER的14个氨基酸的肽。将此与公开且预测的序列的计算机中的文库比较，所述肽证实与单个人蛋白质的精确序列同源性，并且表示
14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白质的氨基酸 28-41，该 14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白质又是YWHAZ基因的245个氨基酸的产物。所述肽不是任何已知的免疫调节肽家族的成员，也不与其相关，与其也不具有序列相似性。通过质谱的合成肽的分析显示与天然肽相同的质量:电荷比(m/z = 774.88),证实来源于B细胞的产物在释放之前没有经过任何形式的翻译后修饰。这些数据表明所鉴别的14个氨基酸的肽是在脂连蛋白刺激下由B细胞释放的介体。
[0137]PEPITEM抑制T细胞变移
[0138]参考图16。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小时。PBL用脂连蛋白(15 μ g/ml，作为阳性对照)或浓度为0.001至1ng/ml的所述肽处理，打乱的肽用作阴性对照(10ng/ml)。还使用其他生物活性肽以证实所述肽的特异性(即10ng/ml的破伤风类毒素肽(TTp)和10ng/ml的胰岛素原(PI))。部分(a)显示PBL变移在所述肽存在下剂量依赖性地减少但在打乱的肽、TTp或PI对照存在下不会如此。部分(b)显示所述肽的EC50(18.6pM)利用非线性回归分析计算。数据表明PEPITEM能够类似于脂连蛋白地抑制PBL变移。数据是至少三个独立实验的池(pool)并且利用单向ANOVA 和 Bonferroni 多重比较事后检验进行分析。*p ^ 0.05,**p ^ 0.01,***p ^ 0.001。
[0139]PEPITEM抑制T细胞迁移并且促进抗发炎调节性T细胞的募集
[0140]参考图17。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小时。将PBL以及不同亚类和PEPITEM加入到不同内皮细胞并测量变移。利用用于Treg，CD4+和CD8+记忆性以及天然T细胞的阴性选择分离不同亚类。使用阳性选择来分离不同的单核细胞亚类。
[0141]部分(a)显示在不同内皮细胞型上PEPITEM以与脂连蛋白相同的方式抑制穿过EC的T细胞迁移。部分(b)显示PEPITEM在抑制记忆性⑶4+和⑶8+T细胞的变移方面是有效的，但其对嗜中性粒细胞或单核细胞(包括CD16-和CD16+亚类)没有作用。天然淋巴细胞在此分析中没有评估，因为它们不粘附至内皮细胞单层。部分(c)显示调节性T细胞(Treg)(其具有抗炎功能)的迁移的效率由PEPITEM增加。这些数据表明PEPITEM能够特异性地调节记忆性T细胞和Treg的变移。
[0142]数据是至少三个独立实验的池并且利用t-检验以及单向ANOVA和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*p 5? 0.05,林P ^ 0.01, ***p ^ 0.0Olo
[0143]PEPITEM不直接调节T细胞迁移
[0144]参考图18。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小时。PEPITEM连同PBL加入到内皮细胞上或内皮细胞用PEPITEM预处理并且在洗涤后加入PBL或者PBL用PEPITEM预处理，洗涤并添加至内皮细胞。
[0145]当PBL用PEPITEM处理并且该试剂在内皮上的测定之前被洗掉时，淋巴细胞迁移的效率不受影响。然而，用PEPITEM预处理内皮细胞导致淋巴细胞运输的抑制。这些数据表明PEPITEM通过刺激内皮细胞释放抑制T细胞运输的试剂进行操作。
[0146]数据是三个独立实验的池并且利用配对t-检验进行分析*p ( 0.05，林P < 0.01。
[0147]通过内皮细胞诱导鞘氨醇-1-磷酸(SlP)合成抑制T细胞迁移。
[0148]参考图19。在有或没有(部分a)脂连蛋白(15 μ g/ml)或(部分b) PEPITEM的情况下，在使用SlPR拮抗剂(Ι146，10μΜ)阻断SlP信号转导后，测量穿过IFN-Y/TNF-α处理的HUVEC的PBL或没有B细胞的PBL变移。没有B细胞的PBL用不同浓度(O - 100 μ Μ)的SlP预处理并且测量穿过IFN- Y /TNF- α处理的HUVEC的变移(部分c)。SPHKl和SPHK2mRNA表达的水平通过来自B细胞和HUVEC的RNA的实时PCR确定(部分d，η = 2)。在PEPITEM(10ng/ml)存在下，测量穿过用SPHKl特异性抑制剂(5 μ M)预处理的IFN-y/TNF- α处理的HUVEC的PBL变移(部分e)。
[0149]数据显示SlP受体对T细胞的拮抗作用导致脂连蛋白和PEPITEM对T细胞变移的抑制丧失(部分a、b)。部分(c)显示将SlP加入至没有B细胞的T细胞恢复变移的抑制；并且部分(d)显示在HUVEC中的SlP激酶I和2 (SPHK1和2)的高表达；并且部分(e)显示SPHKl的抑制从PEPITEM的抑制作用释放淋巴细胞。这些数据表明PEPITEM刺激内皮细胞释放S1P，其又抑制淋巴细胞变移。
[0150]数据是至少三个独立实验的池并且利用t-检验以及单向ANOVA和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*p 5? 0.05,林P ^ 0.01, ***p ^ 0.0Olo
[0151]SlP调节淋巴细胞整联蛋白LFA-1的亲和性。
[0152]参考图20。96孔板在4°C用50ug/ml的重组ICAM过夜包被。所述板在室温使用PBS 4% BSA封闭一小时并且加入用IP-10 (10ng/ml)和/或SlP (1uM)处理的PBL达30分钟。洗涤过量的未结合的PBL并且在4°C，使用KM127抗体(10ug/ml)标记PBL的淋巴细胞整联蛋白LFA-1 (⑶Ila/⑶18 ; α Li? 2)的中间亲和性位点并且使用抗体24(10ug/ml)标记高亲和性位点。两个亲和性位点的表达使用平均荧光强度(MFI)在记忆性T细胞上测量。数据显示在ip-?ο刺激后增加的中间和高亲和性位点二者的表达在SlP存在下被下调。数据表明SlP通过调节淋巴细胞变移必需的整联蛋白LFA-1的亲和性而调节淋巴细胞变移。数据是两个独立实验的池。
[0153]在有或没有所述肽的情况下在野生型或B细胞敲除小鼠的发炎的腹膜中的T细胞的绝对数量。
[0154]参考图21。在部分(a)中，野生型或B细胞敲除(Jh_/_)BALB/c小鼠被注射以10ug酵母聚糖。在有或没有所述肽或打乱的肽的情况下，在注射酵母聚糖(或PBS作为对照)48小时后，从腹膜收集白细胞。T细胞通过CD3的表达鉴别。所述肽或打乱的肽以300 μ g/小鼠的终浓度注射。结果示于部分(a)，其中每个组的数据是平均值并且利用单向ANOVA和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*p<0.01。在部分(b)中，野生型或B细胞敲除C56BL/6小鼠被注射以伤寒沙门氏菌(Salmonella typhirium)。在5天后，收集肝脏并且进行对于T细胞的切片染色。部分(b)中的数据显示在肝脏切片中每个感染位置的T细胞的数量。
[0155]数据显示小鼠中缺乏B细胞导致在酵母聚糖诱导的炎症和沙门氏菌感染后的腹膜中更高的T细胞募集。这通过PEPITEM(但不是打乱的对照)在酵母聚糖处理的B细胞敲除小鼠中减少。这些数据表明，通过在炎症位点释放PEPITEM，B细胞对于体内发炎期间调节T细胞的募集是必需的。
[0156]脂连蛋白/PEPITEM途径在患有I型糖尿病的患者中改变
[0157]参考图22。通过流式细胞术确定每个健康或患病受试者的表达脂连蛋白受体ARl或AR2的PBL的频率并分别示于部分(a)和(b)。数据表示为平均值土 SEM并且当数据没有通过Kolmogorov-Smirnov正态性检验时利用t-检验或Mann Whitney t_检验进行分析。内皮细胞在低血清培养基中培养并在没有脂连蛋白下用TNF-α/IFN-Y刺激24小时。PBL分离自健康对照和患有I型糖尿病的患者并用脂连蛋白15 μ g/ml处理一小时。部分(c)显示AdipoR2的表达和淋巴细胞迁移的抑制之间的相关性，利用线性回归分析确定相关性。部分(d)显示来自新诊断患有I型糖尿病、用脂连蛋白或PEPITEM预处理的患者(η=5)的PBL的变移。数据利用t-检验进行分析**p〈0.01。
[0158]结果示于部分(a和b)，两种脂连蛋白受体(AdipoRl/2)在来自患有I型糖尿病的患者的PBL上的较低表达；并且部分(b)显示AdipoR2的表达越低，脂连蛋白抑制淋巴细胞变移的能力越低；并且在部分(d)中，PEPITEM仍然能够抑制淋巴细胞变移。
[0159]数据表明来自患有I型糖尿病的患者的淋巴细胞释放自脂连蛋白的抑制作用，因为它们表达较低的脂连蛋白受体并且这可以通过外源加入PEPITEM而恢复。
【权利要求】
1.用于治疗和/或预防与T细胞介导的慢性炎性疾病相关的病症的方法，所述方法通过向患者施用抑制T细胞迁移的包含N’ -SVTEQGAELSNEER-C’ (SEQ ID NO:1)的肽或其类似物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组:T细胞自身反应性、T细胞介导的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述病症是糖尿病(I型)。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组:青少年型糖尿病；类风湿性关节炎；克罗恩氏病；动脉粥样硬化；银屑病；包括脂肪性肝炎和肝硬化在内的炎性和纤维化肝病；和葡萄膜炎。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组:肾病；糖尿病肾病；外周神经病；糖尿病视网膜病；和心脑疾病。
6.根据任一前述权利要求的方法，其中所述T细胞的迁移是跨内皮细胞的，越过分隔胰岛细胞与血液供给的胰腺微血管系统的内皮。
7.根据任一前述权利要求的方法，其中所述T细胞是自身反应性T细胞。
8.根据权利要求7的方法，其中所述肽用于抑制募集自身反应性T细胞至胰腺的胰岛。
9.根据任一前述权利要求的方法，其中施用编码所述肽或其类似物的多核苷酸序列。
10.根据权利要求9的方法，其中所述多核苷酸选自由以下各项组成的组:SEQIDNO:2 ；SEQ ID NO:3 ;其DNA形式或DNA/RNA杂交形式；及其任意互补序列。
11.根据权利要求10的方法，其中所述多核苷酸可操作地连接至合适的启动子，例如胰腺-特异性启动子。
12.根据权利要求9至11中任一项的方法，其中施用包含所述多核苷酸的质粒。
13.根据权利要求12的方法，其中施用包含所述质粒的病毒载体。
14.根据任一前述权利要求的方法，其中施用药用组合物，所述组合物包含权利要求1-8中任一项所述的肽或其类似物、权利要求9-10所述的多核苷酸、权利要求12所述的质粒或权利要求13所述的病毒载体。
15.权利要求1-8中任一项所述的肽或其类似物、权利要求9-10所述的多核苷酸、权利要求12所述的质粒或权利要求13所述的病毒载体，其用于如权利要求1-8中任一项所述的治疗和/或预防病症的方法。
【文档编号】A61K38/17GK104168910SQ201380013630
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2012年1月13日
【发明者】乔治·爱德华·雷格尔, 帕尔特·纳伦德兰, 海伦·麦格特里克, 马里亚姆·希梅 申请人:伯明翰大学