更容易被吞噬。
[0126]②将试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石与肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞共培养，利用流式细胞仪检测细胞内吞纳米颗粒的效率。
[0127]图8为试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石对肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a代表人脐静脉内皮细胞，b代表肝癌细胞。
[0128]从图8可以看出，共培养4h和8h后，内吞试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石的肝癌细胞的数量分别是人脐静脉内皮细胞的2.2和2倍，说明试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石更容易被肝癌细胞所吞噬。
[0129]①和②说明试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石对肝癌细胞有明显的靶向性，这是因为肝癌细胞细胞膜上有大量的蛋白受体(ASGP-R)，而乳糖酸是ASGP-R的一种配体，能与ASGP-R发生特异性识别作用，因此，该体系对肝癌细胞有靶向性。
【主权项】
1.一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行: 一、模板剂的准备:将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min?400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到模板剂； 步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1: (4?8);步骤一中所述的模板剂F127与去离子水的质量比为1: (30?100)； 二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备:将K2HPO4.3H20溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3.H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为10?14，再将pH值为10?14的K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min?3.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80?100°C，回流时间为24h?48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80?150°C的真空条件下干燥12h?24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200?300°C下预烧2h?6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500?600°C，煅烧时间为6h?10h，得到介孔轻基磷灰石纳米粒子； 步骤二中所述的K2HPO4.3H20与去离子水的质量比为1: (10?13);步骤二中所述的pH值为10?14的K2HPO4S液中的K 2ΗΡ04.3H20质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为(2?5):1 ; 三、介孔羟基磷灰石的氨基化:将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min?600r/min下搅拌1min?30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60?80°C的水浴锅中回流24h?48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石； 步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为Ig: (50?100)mL ;步骤三中所述的甲苯溶液与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为(8?12):1 ; 四、介孔磷灰石的羧基化:将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在丙酮溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min?600r/min搅拌5.5h?6.5h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将丁二酸酐逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下继续以搅拌速度为300r/min?500r/min搅拌24h?48h，然后依次用蒸饱水和无水乙醇洗涤并离心10?20次，最后冷冻干燥，得到羧基化的介孔磷灰石； 步骤四中所述的氨基化的介孔磷灰石的质量与丙酮溶液的体积的比为Ig: (65?85)mL ;步骤四中所述的氨基化的介孔磷灰石与丁二酸酐的质量比为1: (5.5?8.5); 五、二硫键功能化的介孔磷灰石的制备:将步骤四得到的羧基化的介孔磷灰石、1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在PBS缓冲溶液中，在搅拌速度为300r/min?600r/min条件下搅拌3.5h?4.5h，得到混合溶液A，然后将胱胺盐酸盐加入到混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为200r/min?500r/min搅拌24h?48h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心10?20次，再真空干燥，得到二硫键功能化的介孔磷灰石； 步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的质量比为(1.5?2.5):1 ;步骤五中所述的1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: (3?5);步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石的质量与PBS缓冲溶液的体积的比为Ig: (50?150)mL ;步骤五中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L?0.02mol/L ;步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石与胱胺盐酸盐的质量比为1: (5?20)； 六、具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备:将异氰酸荧光素和步骤五得到的二硫键功能化的介孔磷灰石溶解于PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为200r/min?500r/min搅拌2.5h?3.5h，得到混合溶液B，然后将胶原蛋白、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入到混合溶液B中，继续以搅拌速度为300r/min?500r/min搅拌24h?48h，得到混合溶液C，再将乳糖酸加入到混合溶液C中，继续以搅拌速度为300r/min?600r/min搅拌12h?36h，然后用PBS缓冲液离心洗涤10?20次，再冷冻干燥，得到介孔磷灰石纳米药物载体； 步骤六中所述的异氰酸荧光素与二硫键功能化的介孔磷灰石的质量比为1: (3?10);步骤六中所述的异氰酸荧光素的质量与PBS缓冲溶液的体积的比为Ig: (400?800)mL ；步骤六中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L?0.02mol/L ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与胶原蛋白的质量比为(I?3):1 ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的质量比为(1.5?4):1 ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: (12?18);步骤六中所述的异氰酸荧光素与乳糖酸的质量比为1: (1.2?2.5)。
2.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤一中在搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状液。
3.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中再将PH值为10?14的K2HPO4溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中。
4.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为90°C，回流时间为36h，完成水浴回流反应。
5.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250°C下预烧3h。
6.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为6000C，煅烧时间为8h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子。
7.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60°C的水浴锅中回流36h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石。
8.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为:离心速度为10000r/min，温度为_50°C，干燥时间为48h。
9.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤四中所述的冷冻干燥参数为:温度为-50°C，干燥时间为36h。
10.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤六中所述的冷冻干燥参数为:温度为_55°C，干燥时间为48h。
【专利摘要】一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。本发明是为了解决当前药物载体毒副作用大，难以降解的问题。方法：一、模板剂的准备；二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备；三、介孔羟基磷灰石的氨基化；四、介孔磷灰石的羧基化；五、二硫键功能化的介孔磷灰石的制备；六、具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备。本发明得到的产物能靶向识别肝癌细胞，减少了正常组织对药物的摄取，降低了药物在体内的毒副作用。定时、定量的将药物导入病变组织，提高了药物的利用率。
【IPC分类】A61K47-04, A61P1-16, A61P35-00
【公开号】CN104587473
【申请号】CN201510054587
【发明人】黄玉东, 李大龙, 贺金梅, 程玮璐, 李纪伟, 尉枫
【申请人】哈尔滨工业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月2日