[0022] 本发明的积极进步效果在于：
[0023]目前临床上治疗类风湿性关节炎一般采用非甾类抗炎药（NSAIDs)、抗风湿药 (DMARDs)或者生物制剂。非留类抗炎药主要通过抑制环氧合酶（COX)活性，减少前列腺 素合成而具有抗炎、止痛、退热及减轻关节肿胀的作用，但其存在一定的不良反应，包括 胃肠道症状、肝和肾功能损害以及可能增加的心血管不良反应。而改善病情的抗风湿药 (DMRDs)较非甾类抗炎药发挥作用慢，大约需要1~6个月，且副作用较大，常对肝、肾及 造血系统造成损害。另外，目前治疗类风湿性关节炎的生物制剂主要包括肿瘤坏死因子 (TNF)-a拮抗剂、白细胞介素（IL)-I和IL-6拮抗剂、抗CD20单抗以及T细胞共刺激信号抑 制剂等，虽然这类生物制剂靶向性强，但其强大的免疫抑制作用，仍会带来一些不良反应。
[0024] 而本发明所述的多肽或多肽衍生物能够特意性地与细胞内的TRB3结合，从而阻 断TRB3与P62蛋白的相互作用，温和地激活自噬，有效改善在类风湿性关节炎发病过程中 免疫细胞由于自身自噬阻断而造成的炎症反应。同时，该肽段的衍生物P印2-Al，P印2-A2， P印2-A3可以改善人工诱导的动物关节炎症，不再出现类风湿性关节炎症状。
【附图说明】
[0025] 图1为免疫共沉淀方法验证P62蛋白与TRB3蛋白之间存在相互作用。
[0026] 图2为实施例3中，正常组、模型组、MTX组、高剂量多肽组治疗CIA大鼠5周后足 趾肿胀及踝关节病理切片照片。其中，A和F为正常组，HEXlOO ;B和G为模型组，HEXlOO; C和H为MTX治疗组，HEX 100 ;D和I为高剂量多月太治疗组，HEX 100。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0028] 下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：
[0029] MTX:甲氨喋呤；
[0030] CIA:胶原诱导性关节炎；
[0031] KHB:Krebs_Henseleit缓冲液；
[0032] Laminin:层粘连蛋白；
[0033] HEPES:羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
[0034] BSA:牛血清白蛋白；
[0035] EDTA:乙二胺四乙酸；
[0036] NP40:乙基苯基聚乙二醇；
[0037] TBST:含吐温-20的Tris缓冲液；
[0038] PBS:pH7.4的磷酸缓冲液
[0039] Leu(Leupeptin，亮肽素）、Pep(Pepstatin，胃酶抑素）、Apr(Aprotinin，胰蛋白 酶抑制剂)、DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇）：均为蛋白酶抑制剂。
[0040] 下述实施例中，序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的多肽分 别称为Al、A2和A3,其连接P印2细胞穿膜肽（P印2的氨基酸序列为HLYVSPW，如序列表中 SEQ ID N0:4所示）后形成的嵌合多肽分别称为P印2-Al、P印2-A2和P印2-A3,上述多肽或 嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。AU A2和A3通过两个谷氨酸链连接 到P印2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：
[0041] P印2-A1序列为：
[0042] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-M et- "C"（其序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示)。
[0043] P印2-A2的序列为：
[0044] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-L eu-Gln-Thr-Lys- "C"（其序列如序列表中 SEQ ID N0:11 所不）。
[0045] P印2-A3的序列为：
[0046] "N" -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-I I e- "C"（其序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示)。
[0047] 下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15~25°C。
[0048] 实施例1类风湿性关节炎体外模型制备
[0049] I. 1模型构建
[0050] 1)收集类风湿性关节炎患者膝盖或手腕滑膜切除术或关节置换术中获得滑膜或 骨样本。
[0051] 2)无菌条件下，样本被切成2立方毫米小块并分成数份置于2块24孔板中。
[0052] 3)样本利用 MEM(Gibco, Grand Island, NY, USA)完全培养基(含有 2mM L-谷氨酰 胺、lOOU/ml青霉素、50mg/ml庆大霉素、20mM N-2-羟乙基哌嗪-N' -2-乙基磺酸缓冲溶液和 1%胎牛血清）每孔2mL，37°C，5%C02,95%湿度培养过夜。
[0053] 4)剪碎的组织块在培养基中培养，待组织块内的炎性细胞及其他细胞进入培养基 中，作为次日药物治疗实验的工具细胞。
[0054] 1. 2治疗活性检测
[0055] 1)按照I. 1制备类风湿性关节炎体外模型，分成多肽处理组及未处理对照组，每 组6个复孔。
[0056] 2)多肽处理组中使用P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3处理滑膜或骨骼培养物，将 P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3多肽干粉用生理盐水溶解，直接加入到培养孔中，经细胞培养 基稀释至终浓度为50M，未处理组加等体积生理盐水，培养24h。
[0057] 3) 24h后收集各孔细胞培养上清，使用商业化细胞因子检测试剂盒(请给出型号） (包括人IL6定量ELISA检测试剂盒D6050、人IL-Ibeta定量ELISA检测试剂盒DLB50和人 TNF-alpha定量ELISA检测试剂盒DTA00C，均购自R&D System公司），按照试剂盒说明书进 行操作，双夹心酶联免疫吸附法检测培养液中IL-I P、IL-6、TNF-a等含量。
[0058] 1. 3统计学处理
[0059] 数据用X±SD表示，t检验统计分析各组差异显著性，由SPSS13. 0统计软件分析。
[0060] 1. 4 结果
[0061] P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3与未处理组相比较，P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以 改善风湿性关节炎相关因子，见表1。
[0062] 与未处理组相比较，三种多肽治疗组的类风湿性关节炎相关细胞因子TNF-a、 IL-6及IL-I P均有明显下降，其中p印2-A2组在三组多肽组中效果最优。
[0063] 表1.比较三种多肽对风湿性关节炎相关细胞因子的影响（n=6, X土SD)
[0064]
【主权项】
1. 一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防类风湿 性关节炎的药物中的应用； 所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列 中的任一种； 所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0:4~SEQ ID N0:9中的任一种所示。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一种的多肽的N端与细胞穿膜肽连接。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一种的多肽的C端与细胞穿膜肽连接。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽 的衍生物作为单一活性成分在制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽 的衍生物与其他治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物联合作为活性成分在制备治疗和/ 或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。
7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎 引起的滑膜炎。
8. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎 引起的炎症细胞浸润。
9. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎 引起的足趾肿胀。
10. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎 引起的纤维组织增生。
【专利摘要】本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，该肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以治疗或预防类风湿性关节炎引发的各类病症。
【IPC分类】A61K38-08, A61K47-48, A61P29-00, A61K45-00, A61P19-02
【公开号】CN104740603
【申请号】CN201310729055
【发明人】胡卓伟, 花芳, 孙巍
【申请人】胡卓伟
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月25日