VL结构域包含互补决定区IXDR1、IXDR2和IXDR3与构架， 且其中：
[0044] HCDRl具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；
[0045] HCDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0046] HCDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
[0047] LCDRl具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
[0048] LCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
[0049] LCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0050] -个或多个⑶R或抗体的一组⑶R可被接枝至构架（例如：人构架）中，以提供 用于本发明的抗体分子。构架区域可包含人生殖细胞基因区段序列。因此，该构架可为种 系化的，藉以改变构架内的一个或多个残基，以使之与最相似的人种系构架中相当位置的 残基相符。本发明使用的特异性结合成员可为具有VH结构域的分离抗体分子，该VH结构 域包含人种系构架中的一组HCDR(例如：DP47)。该特异性结合成员通常亦具有包含一组 LCDR(例如在人种系构架中）的VL结构域。该VL结构域的人种系构架可为DPK22。
[0051] 本发明使用的VH结构域可以优选地具有氨基酸序列SEQ ID N0:7,其是F8抗体的 VH结构域。本发明使用的VL结构域可优选地具有氨基酸序列SEQ ID N0:8,其是野生型F8 抗体的VL结构域。
[0052] 本发明使用的特异性结合成员可为或包含单链Fv(ScFv)，其包含由肽连接子链接 的VH结构域和VL结构域。熟练技术人员可选择连接子的适当长度与序列，例如：至少为5 个或至少为10个氨基酸长，至多约15个、至多约20个或至多约25个氨基酸长。该连接子 可具有氨基酸序列GGSGG(SEQ ID NO:9)。
[0053] 该特异性结合成员可为双功能抗体（diabody)，其是由基因融合所建构的多 价或多特异性片段（W094/13804;Holliger et al. (1993a)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448)。
[0054] 优选地，该特异性结合成员是scFv，其在溶液中形成（稳定的）非共价同型二聚 体。例如：本文所述的F8抗体和F8-IL10缀合物均包含scFv，其预期在溶液中形成（稳定 的）非共价同型二聚体。
[0055] 单链Fv (scFv)可被包含在微型免疫球蛋白（mini-immunoglobulin)或小 型免疫蛋白（small immunoprotein(SIP))中（例如 Li et al·，（l997)，Protein Engineering, 10:731-736所述）。SIP可包含融合至人IgE分泌性同种型IgE-S2的CH4结 构域的 scFv 分子（eS2-CH4;Batista et al·，（1996)，J. Exp. Med. ,184:2197-205)，形成同 型二聚体性的微型免疫球蛋白抗体分子。
[0056] 或者，本发明使用的特异性结合成员可包含非抗体分子中的抗原结合位点，一般 由一个或多个CDR提供，例如：在非抗体蛋白质支架中的一组CDR。特异性结合成员（包括 非抗体和抗体分子）在本文其他部分有更详细的描述。
[0057] 本发明使用的特异性结合成员可为抗体分子，其包含如SEQ ID NO: 7所示的F8抗 体的VH结构域和/或如SEQ ID NO:8所示的F8抗体的VL结构域。本发明使用的特异性 结合成员可为包含如SEQ ID NO: 11所示的序列的抗体分子。本发明的缀合至IL-10的特 异性结合成员可包含如SEQ ID NO: 13所示的序列。
[0058] 本发明使用的特异性结合成员亦可包含抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、 E8或G9或其变体的一个或多个（例如：全部六个）⑶R，或者抗ED-A抗体Hl、B2、C5、D5、 E5、C8、F1、B7、E8或G9或其变体的VH和/或VL结构域。所述抗体的CDR序列与VH和VL 结构域序列公开于W02010/078950。
[0059] 本发明使用的适当变体包含抗体抗原结合位点，其包含本文所述的F8抗体的VH 结构域和VL结构域，其中如SEQ ID NO: 7所示的VH结构域中位置5的亮氨酸（L)残基被 缬氨酸（V)所取代，和/或如SEQ ID NO:8所示的VL结构域中位置18的精氨酸（R)残基 被赖氨酸（K)所取代。
[0060] 本发明的所述和其他方面在下文有更详细的描述。
[0061] 【附图简单说明】
[0062] 图IA显示抗ED-A F8抗体重链（VH)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 7)。抗ED-A F8抗 体的重链CDRl的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)以下划线标出。抗ED-A F8抗体的重链CDR2 的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)以斜体字加下划线显示。抗ED-A F8抗体的重链⑶R3的氨 基酸序列（SEQ ID N0:3)以粗体字加下划线显示。图IB显示VH和VL结构域之间抗ED-A F8抗体连接子序列的氨基酸序列（SEQ ID NO:9)。图IC显示抗ED-A F8抗体轻链（VL)的 氨基酸序列（SEQ ID NO: 8)。抗ED-A F8抗体的轻链CDRl的氨基酸序列（SEQ ID NO: 4)以 下划线显示。抗ED-A F8抗体的轻链⑶R2的氨基酸序列（SEQ ID NO: 5)以斜体字加下划 线呈现。抗ED-A F8抗体的轻链⑶R3的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)以粗体字加下划线显 示。图ID显示当抗体缀合至IL-10时，F8抗体和IL-10之间连接子的氨基酸序列。图IE 显示人IL-10的氨基酸序列。
[0063] 图2显示IBD小鼠和健康小鼠的结肠自显影结果。收集结肠并将其暴露于磷成像 屏（Molecular Dynamics) 24小时，并经由Storm 860成像。第1道：注射后6小时收集自 第0组的结肠（健康小鼠）；第2道：注射后6小时收集自第2组的结肠（IBD小鼠）；
[0064] 第3道：注射后24小时收集自第0组的结肠（健康小鼠）；第4道：注射后24小 时收集自第2组的结肠（IBD小鼠）。
[0065] 图3显示125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分布。图表显示注射后6小时 (A)、注射后24小时（B)和注射后96小时（C) 125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分 布。于96小时，相较于健康小鼠，明显可见125I-F8-IL10倾向累积在患病小鼠的结肠和肠 系膜淋巴结（L.N.)。所述实验中所用的F8-IL10缀合物的序列如SEQIDN0 :13所示。
[0066] 图4显示经F8-IL10处理的小鼠的细胞因子水平。上述图表代表在健康小鼠 (水）、未接受治疗的患病小鼠（3% DSS)、接受小型免疫蛋白（Small Immune Protein)形 式F8抗体的患病小鼠（F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠（F8-IL10)的血清中细胞因子的 水平。报告的细胞因子水平（表示为每ml血清中的pg蛋白质）为：白介素1β (ILl-b)、 白介素12 (IL-12p70)、干扰素 γ (IFNy )和白介素6 (IL6)。
[0067] 图5显示经F8-IL10处理的小鼠中的细胞因子水平。上述图表代表在健康小鼠 (水）、未接受治疗的患病小鼠（3% DSS)、接受小型免疫蛋白（Small Immune Protein)形 式F8抗体的患病小鼠（F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠（F8-IL10)的血清中细胞因子的 水平。报告的细胞因子水平（表示为每ml血清中的pg蛋白质）为：角质细胞衍生的趋化 因子（KC)、白介素 IO(ILlO)和肿瘤坏死因子a (TNFa)。
[0068] 图6显示组织化学分析来自罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者的结肠组织 样本，其中采用SIP形式的F8抗体和冯维勒布兰德因子进行探测。以F8抗体和温韦伯因 子观察到的染色结果显示，F8在罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者中对新形成血管染 色，但不对正常血管染色。（温韦伯因子常规上作为正常血管的标记。）
[0069] 图7显示罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的患部结肠组织样本（右）和非患 部结肠样本（左）的组织化学分析。以F8抗体观察到的染色结果显示F8对患病结肠中新 形成血管更为强烈地染色。
[0070] 术语
[0071] 纤维连接蛋白
[0072] 纤维连接蛋白是一种进行选择性剪接的抗原，如本文在他处所述，目前已知数种 选择性同种型。外结构域-A(Extra Domain-A(EDA或ED-A))也已知为ED、外部III型重复 序列 A (extra type III repeat A(EIIIA))或 EDI。人 ED-A 的序列已经由 Kornblihtt 等 人（（1984) ,Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868)和 Paolella 等人（（1988) ,Nucleic Acids Res. 16,3545-3557)公开。人ED-A的序列亦可在SwissProt数据库，以登录号P02751保存 的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(111型纤维连接蛋白12 ;外结构域2)获得。小鼠 ED-A的 序列可在SwissProt数据库，以登录号P11276保存的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(111 型纤维连接蛋白13 ;外结构域2)获得。
[0073] 纤维连接蛋白的ED-A同种型含有外结构域A (Extra Domain-A (ED-A))。人A-FN 的序列可从相对应的人纤维连接蛋白前体序列推导得到，该前体序列可在SwissProt数据 库以登录号P02751取得。小鼠 A-FN的序列可从相对应的小鼠纤维连接蛋白前体序列推导 得到，该前体序列可在SwissProt数据库以登录号P11276取得。A-FN可为纤维连接蛋白的 人ED-A同种型。ED-A可为人纤维连接蛋白的外结构域A。
[0074] ED-A是90个氨基酸的序列，其是藉由选择性剪接插入纤维连接蛋白（FN)中，并位 于 FN 的结构域 11 与 12 之间（Borsi et al.，1987, J. Cell Biol.，104, 595-600)。ED-A 大 体上不存在于FN的血浆形式中，但在胚胎形成、组织重塑、纤维化、心脏移植和实体肿瘤形 成期间却含量丰富。
[0075] 选择性剪接
[0076] 选择性剪接代表剪接DNA的原始RNA转录体时，发生不同剪接方式而产生不同 mRNA。在切除内含子后，选择作用可决定哪些外显子被剪接在一起而形成mRNA。选择性剪 接产生含有不同外显子和/或不同数量的外显子的不同同种型。例如，一种同种型可包含 对应于一个或多个外显子的额外氨基酸序列，其可包含一个或多个结构域。
[0077] 特异性结合成员
[0078] 此术语描述特异性地彼此结合的一对分子中的一个成员。特异性结合分子对的成 员可为自然衍生或全体或部分由人工合成。该分子对的一个成员在其表面上具有结合至并 因而与该分子对的另一成员的特定空间与极性组织互补的区域或腔。结合分子对类型的实 例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明 涉及抗原-抗体类型反应。
[0079] 特异性结合成员一般包含具有抗原结合位点的分子。例如：特异性结合成员可为 抗体分子或包含抗原结合位点的非抗体蛋白质。本文中所称的特异性结合成员优选是抗体 分子。
[0080] 抗原结合位点可藉由在非抗体蛋白质支架（例如纤维连接蛋白或细胞色素 B 等）上排布互补决定区（⑶R)的方式提供（Haan&Maggos, (2004)，BioCentury，12(5):Al -A6 ；Koide et al., (1998), Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151 ；Nygren et al·，（1997) ,Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469)，或藉由将蛋白质支架 中环的氨基酸残基随机化或突变的方式提供，以赋予对于目标靶的结合特异性。用于在蛋 白质中加工新的结合位点的支架已由Nygren等人详尽回顾（1997) (Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469)。用作抗体模拟物的蛋白质支架公开于W0/0034784,在 该文献中发明人描述了包括纤维连接蛋白III型结构域（具有至少一个随机化环）的蛋白 质（抗体模拟物）。移植一个或多个CDR(例如：一组HCDR)的适当支架可由免疫球蛋白基 因超家族（gene superfamily)的任何结构域成员提供。该支架可为人或非人蛋白质。非 抗体蛋白质支架的优势为其可在相较于至少某些抗体分子而言较小和/或较容易操作的 支架分子中提供抗原结合位点。小尺寸的结合成员可赋予有用的生理特性，例如：能够进 入细胞、穿透至组织深处或到达其他结构内的目标、或结合至目标抗原的蛋白质腔中。抗原 结合位点在非抗体蛋白质支架中的用途回顾于Wess, 2004, In:BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12 (42), A1-A7。典型有具有适当构架和一个或多个可变环的蛋白 质，在其中该环的氨基酸序列被特异性或随机化突变，以创造结合目标抗原的抗原结合位 点。该蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌（S. aureus)的蛋白质A的IgG结合结构域、转铁 蛋白、四连蛋白（tetranectin)、纤维连接蛋白（例如：第10纤维连接蛋白III型结构域） 和脂质运载蛋白（Iipocalin)。其他方式包括基于大环寡肽（cyclotide)的合成"微小体 (Microbody) "（Selecore GmbH) -具有分子内二硫键的小蛋白质。
[0081] 除了抗体序列和/或抗原结合位点之外，本发明使用的特异性结合成员可包含其 他氨基酸例如：形成肽或多肽，诸如折迭结构域，或除了结合抗原的能力外，给予该分子以 另一功能特性的氨基酸。本发明使用的结合成员可带有可检测标记，或可缀合至毒素、具免 疫抑制效果或抗发炎效果的分子或靶向部分或酶（例如：通过肽键或连接子）。优选地，本 发明使用的结合成员缀合至白介素10。
[0082] 例如：结合成员可包含催化位置（如于酶结构域中）以及抗原结合位点，其中该 抗原结合位点结合抗原并因此使该催化位点靶向该抗原。该催化位点可抑制抗原的生物功 能，例如：经由切割。
[0083] 如所述的，虽然⑶R可由非抗体支架携带，但用于携带⑶R或⑶R组的结构通常是 抗体重链或轻链序列或其实质上的部分，其中该CDR或CDR组位于对应于由重排的免疫球 蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋 白可变结构域的结构与位置可参考Kabat等人的文献（1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services.) 以及在互联网上可获得的其更新版本（于immuno. bme. nwu. edu，或使用关键词"Kabat"以 任何搜索引擎检索）确定。
[0084] 提到 CDR 区域或 CDR 时，其意指 Kabat 等人，（1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services(Rabat et al. , (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition,US Department of Health and Human Services, Public Service，NIH，Washington，以及之后的版本）中所定义的免疫球蛋白重链与轻链的高变 区。抗体通常包含3个重链⑶R和3个轻链⑶R。根据情况，本文中所用的术语⑶R意指这 些区域之一或数个，或甚至这些区域的全部，其含有由该抗体对该抗原或其识别的表位的 亲和力负责结合的主要的氨基酸残基。
[0085] 在六个短⑶R序列之中，该重链的第三个⑶R(HCDR3)具有较大的尺寸可 变性（更大的多样性，主要因为产生该HCDR3的该基因重排的机制导致的）。虽然 已知最长的尺寸为26个氨基酸，但其可短如2个氨基酸。在功能上，HCDR3在决定 该抗体的特异性方面起着部分作用（Segal et al.，（1974)，PNAS，71:4298-4302 ; Amit et al., (1986),Science, 233:747-753；Chothia et al., (1987),J. Mol. Biol.,196:901-917;Chothia et al.,(1989), Nature,342:877-883;Caton et al., (1990), J. Immunol. , 144:1965-1968 ；Sharon et al. , (1990a), PNAS, 87:4814-4817 ； Sharon et al., (1990b) ,J. Immunol. ,144:4863-4869 ;Kabat et al., (1991b)，J. Immunol.，147:1709-1719) 〇
[0086] 抗体分子
[0087] 抗体分子描述天然或部分或全部人工合成的免疫球蛋白。该术语亦涉及任何包含 抗体的抗原结合位点的多肽或蛋白质。在此须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是 说它们并非存在于天然环境中，而是已从天然来源经