5I-F8/IL10的生物分布。
[0207] 利用受测时间点的平均血清或组织浓度计算PK参数。使用药物动力学软件包 WinNonlin(第5. 1版，Pharsight)的非区室数据分析模块。利用线性梯形法（linear trapezoidal method)计算浓度对时间曲线下的面积（AUC)。
[0208] IBD小鼠模型中F8-IL10治疗性处理对血清细胞因子量的效用
[0209] 既已知IL-10会降低促炎细胞因子，我们测试在IBD小鼠模型中施予F8-IL10是 否会影响此模型中的血清细胞因子反应。在开始DSS处理后第3、6和9天，静脉注射施予每 只小鼠 200 yg 的F8-IL10或对照组小型免疫蛋白（small Immune Protein (F8-SIP)) (η = 10只小鼠/组）。此给药方案与胶原蛋白引发的关节炎模型中的有效方案相同（Schwager K, et al. Arthritis Research and Therapy, (2009) 11 :R142)。对照组包括未患病组（一 般水）和未经治疗的患病组（η = 10只小鼠/组）。在开始DSS处理之后的第10天，收集 血液并以如前文针对定位研宄所述的方式取得血清。利用MSD技术平台和小鼠7plex MSD 试剂盒，根据制造商的说明书评估血清中IL-lb、IL-12p40、IFNg、IL-6、KC、IL-10和TNFa 的量（Mesoscale Discovery, Gaithersburg, MD)。图4和5中细胞因子水平表不为每ml血 清中有多少Pg蛋白质。
[0210] EDA表达的人组织染色
[0211] 以免疫组织化学分析OCT包埋的冷冻结肠组织样本，样本是来自患有溃疡性结肠 炎的60岁女性患者和患有克罗恩氏病（Crohn's disease)的42岁男性患者。两个样本均 以SIP形式的F8抗体和冯维勒布兰德因子（von Willebrand factor)进行探测。
[0212] 此外，来自患有克罗恩氏病或溃疡性肠炎的相同患者（η = 3克罗恩氏病 患者和n = 5UC患者）的患部和非患部冷冻活检样本是自Analytical Biological Services(Wilmington，DE)取得的。将冷冻样本置于干冰上以避免融化，将其包埋于充满 O.C.T.化合物（Tissue_Tek#4583)的 Cryomolds 标准模具（Tissue-Tek 4557)中并在经过 干冰冷却的异戊烷中快速冷冻。将组织块以Leica CM1850冷冻切片机切片为4微米，将切 片放置于玻片上并储存于_80°C直到进行免疫组织化学染色（IHC)为止。开始IHC时，将组 织浸入冷的（-20F)甲醇（Fisher Scientific A412P-4)中以除去储存中可能形成的任何 水分，并在室温风干20分钟。接着将组织浸入冷的（-20F)丙酮（ACROS CAS#67-64-l)10 分钟，并在室温风干10分钟。
[0213] 以适当的Ventana条形码标记组织玻片，并将其置入Ventana Discovery XT 进行Fibronectin F8SIP或KSF SIP(对照组抗体）IHC。将内源性生物素以Ventana S Block(Ventana 760-4212)中的 5 % 正常小鼠血清（Jackson Tmmuno Research 015-000-120)封闭 20 分钟，并以 Ventana Biotin Blocking kit (Ventana 760-050)封闭 8分钟。将纤维连接蛋白F8SIP或KSF以1:200浓度（每片玻片IOOul)稀释在Dako抗体 稀释液（S0908) (Dako North America, Carpinteria, CA)中，并孵育 40 分钟。在完成该轮 程序前，将玻片以苏木色素（hematoxylin)和蓝色试剂进行负染色（各4分钟）。将玻片取 出并置入Ventana Symphony，以进行接下来的脱水和封片。IHC的代表性图像显示于图7。 来自溃疡性肠炎患者UH0501-34(上）和克罗恩氏病患者UH0405-09(下）的非患部（左） 和患部（右）组织样本的IHC。
[0214] 结果
[0215] 结肠放射自显影
[0216] 图2显示非患病小鼠（水）（第1和3泳道）或患病小鼠（经DSS处理）（第2和 4泳道）的结肠在施予经放射标记的F8-IL10后第6小时（第1和2泳道）或第24小时 (第3和4泳道）的放射自显影。此结果显示F8-IL10在发炎结肠中的累积确实比正常结 肠多。F8-IL10在患病结肠部位的斑块状外观，与此模型中沿结肠长度所观察到的发炎和 EDA表达水平的多变性相符合，进一步支持F8-IL10会区域定位于发炎处的理论。
[0217] 125I-F8_IL10在患病小鼠和健康小鼠中的生物分布
[0218] 图3显示患病（DSS)小鼠与正常（水）小鼠比较，125I-F8-IL10在第6、24和96小 时时间点在结肠和肠系膜淋巴结（L.N.)中的积累。相似于图2,所述数据显示在经DSS处 理的小鼠中，F8-IL10会靶向至结肠和相关联的淋巴结。从所述研宄亦可看出，血清半衰期 测定为约3. 5小时，而结肠中F8-IL10的半衰期则为约35小时；提高10倍代表了组织持久 性增强。此结果表明，在结肠发炎期间，F8-IL10不仅靶向至结肠和肠系膜淋巴结，而且一旦 抵达后，其相较于在循环中亦滞留更久。总结来说，所述数据代表在结肠发炎的情况下（例 如人的克罗恩氏病和溃疡性结肠炎），F8-IL10倾向于靶向至并滞留于所述位置。
[0219] 来自患病小鼠和健康小鼠的血清中的细胞因子量
[0220] 图4显示相较于对照组，以治疗形式施予F8-IL10使得炎性细胞因子、IL-I β、 IL12p40、IFNy和IL-6的血清水平显著降低。
[0221] 图5显示相较于对照组，以治疗形式施予F8-IL10不会造成TNF-α和角质细 胞衍生趋化因子（KC)升高，而会造成IL-10水平升高。DSS模型中图4的细胞因子水 平的升高与在结肠中该病的诱导有关。图4所述炎性细胞因子的下降与IL-IO的升高 均与 IL-10 的已知生物作用一致（Abbas A, Lichtman A, Pober J.，1994, Cellular and Molecular Immunology. 2nd Ed.Philadelphia:W. B. Saunders Company ；Delves P, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2nd Ed. San Diego: Academic Press) 〇 因此， F8-IL10藉由降低IBD中与发炎作用和病理相关的细胞因子，证实了在此IBD模型中的药理 学活性。因为已知所述促炎细胞因子在IBD患者体内会被上调，因此经由施予F8-IL10而 将所述细胞因子下调揭示了 F8-IL10对于在体内治疗IBD可能是有益的。尤其是已知CD 患者内干扰素 γ和IL_12p70会被上调，本文所公开的数据表明施予F8-IL10很可能在体 内治疗CD中特别有用。
[0222] 免疫组织化学染色
[0223] 图6显示F8SIP抗体会将溃疡性结肠炎患者的新生血管染色，但不会将正常血管 染色。（冯维勒布兰德因子常规被用作为正常血管的标记。）
[0224] 图7显示克罗恩氏病或UC配对活检组织样本，经由EDA免疫组织化学染色的代表 性图像。箭头指出每张图像中的血管。患部血管周围的染色强度较来自相同患者的非患部 样本高。此结果表明在所述人类疾病情形下EDA表达提高可造成更多地靶向至结肠中发炎 区域。总结来说，在鼠类IBD模型中以F8-IL10观察到的结肠靶向分布与血清细胞因子降 低，以及在人克罗恩氏病和溃疡性结肠炎结肠组织中血管周围的EDA表达增加，共同表明 施予F8-IL10可靶向并积极影响患有IBD的患者。
[0225] 本申请所公开的序列
[0226] SEQ ID NO : I (F8 抗体 VH 结构域 CDRl)
[0227] LFT
[0228] SEQ ID NO :2 (F8 抗体 VH 结构域 CDR2)
[0229] SGSGGS
[0230] SEQ ID NO :3 (F8 抗体 VH 结构域 CDR3)
[0231] STHLYL
[0232] SEQ ID NO :4 (F8 抗体 VL 结构域 CDRl)
[0233] MPF
[0234] SEQ ID N0:5(F8 抗体 VL 结构域 CDR2)
[0235] GASSRAT
[0236] SEQ ID N0:6(F8 抗体 VL 结构域 CDR3)
[0237] MRGRPP
[0238] SEQ ID NO : 7 (F8 抗体 VH 结构域）
[0239] EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
[0240] SEQ ID NO :8 (F8 抗体 VL 结构域）
[0241] EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
[0242] SEQ ID NO :9 (F8抗体VH结构域和VL结构域之间的连接子）
[0243] GGSGG
[0244] SEQ ID NO : 10 (F8抗体的VL结构域和IL-10之间的连接子）
[0245] SSSSGSSSSGSSSSG
[0246] SEQ ID NO :1 1 (人 IL-10)
[0247] SPGQGTQSENSCTHFPGNLP匪LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSE MIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSE FDIFINYIEAYMTMKIRN
[0248] SEQ ID NO : 12 (F8 抗体）
[0249] EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYffGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFG QGTKVEIK
[0250] SEQ ID NO :13(F8-IL10)
[0251] EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFG QGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLE DFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKL QEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
【主权项】
1. 一种特异性结合成员，其结合纤维连接蛋白的外结构域A同种型，用于治疗炎性肠 病（IBD)的方法，例如克罗恩氏病（CD)或溃疡性结肠炎（UC)。
2. -种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员用于制造供治疗IBD(例如 ⑶或UC)的药物的用途。
3. -种治疗患者IBD的方法，该方法包含向患者施予治疗有效量的药物，所述药物包 含结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员。
4. 权利要求1的特异性结合成员、权利要求2的用途或权利要求3的方法，其中该特异 性结合成员结合该纤维连接蛋白的ED-A。
5. 权利要求1或4的特异性结合成员、权利要求2或4的用途或权利要求3或4的方 法，其中该特异性结合成员被缀合至免疫抑制性或抗炎性分子，例如IL-10。
6. 权利要求5的特异性结合成员、用途或方法，其中该特异性结合成员经可切割的连 接子缀合至该生物活性分子。
7. -种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员，其用于IBD的诊断方法 中。
8. 权利要求7的特异性结合成员，其中该特异性结合成员结合纤维连接蛋白的ED-A。
9. 权利要求7或8的特异性结合成员，其中该特异性结合成员被缀合至可检测标记或 放射性同位素。
10. -种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员，其用于将缀合至该特异 性结合成员的分子递送至IBD组织的新生血管。
11. 权利要求10的特异性结合成员，其中该特异性结合成员结合纤维连接蛋白的 ED-A0
12. 权利要求10或11的特异性结合成员，其中该分子是免疫抑制性或抗炎性分子，例 如IL-10。
13. 权利要求1和4-12中任一项的特异性结合成员、权利要求2的用途或权利要求3的 方法，其中该特异性结合成员包含VH结构域，其包含构架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2 和HCDR3,其中 HCDRl具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列， HCDR2具有SEQIDNO:2的氨基酸序列， HCDR3具有SEQIDNO:3的氨基酸序列； 或其中该VH结构域包含一组互补决定区，其在互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3中具 有十个或更少个氨基酸取代。
14. 权利要求13的特异性结合成员、用途或方法，其中该VH结构域构架是人种系构架。
15. 权利要求14的特异性结合成员、用途或方法，其中该VH结构域具有SEQIDNO: 7 的氨基酸序列。
16. 权利要求13-15中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该特异性结合成员 进一步包含VL结构域，所述VL结构域包含一组互补决定区IXDR1、IXDR2和IXDR3和构架。
17. 权利要求16的特异性结合成员、用途或方法，其中 LCDRl具有SEQIDNO:4的氨基酸序列， LCDR2具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，和 LCDR3具有SEQIDNO:6的氨基酸序列； 或其中该VL结构域包含一组互补决定区，其在该互补决定区IXDR1、IXDR2和IXDR3中 具有十个或更少个氨基酸取代。
18. 权利要求16或17的特异性结合成员、用途或方法，其中该VL结构域构架是人种系 构架。
19. 权利要求18的特异性结合成员、用途或方法，其中该VL结构域具有SEQIDNO:8 的氨基酸序列。
20. 权利要求17-19中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该特异性结合成员 包含单链Fv。
21. 权利要求20的特异性结合成员、用途或方法，其中该结合成员是小型免疫蛋白 (SIP)〇
22. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD不是溃疡性结 肠炎（UC)。
23. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是胶原性结肠 炎。
24. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是淋巴细胞性 结肠炎。
25. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是缺血性结肠 炎。
26. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是分流性结肠 炎。
27. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是贝赛特氏 病。
28. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是未定型结肠 炎。
29. 前述权利要求中任一项的特异性结合成员、用途或方法，其中该IBD是克罗恩氏 病。
30. -种缀合物，其包含缀合至IL-10的结合纤维连接蛋白ED-A同种型的结合成员，其 中该缀合物具有如SEQIDNO: 13所示的序列。
【专利摘要】结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员，其可用于炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的治疗、诊断、检测和/或成像方法中，和/或用于将缀合至该特异性结合成员的分子递送至IBD组织。该特异性结合成员可(例如)缀合至免疫抑制性或抗炎性分子，例如白介素-10。
【IPC分类】A61K38-00
【公开号】CN104768563
【申请号】CN201280076034
【发明人】G·内里, K·施瓦格尔, M·鲁热克, D·奥哈拉, 陈建清
【申请人】菲罗根股份公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2012年10月3日
【公告号】CA2886152A1, EP2903629A1, WO2014055073A1