纯化而分离或获得，或其他经由基因 重组而获得，或经由化学合成，且其可包括如下文所述的非天然氨基酸。包含抗体的抗原结 合位点的抗体片段包括（但不限于）诸如Fab、Fab'、Fab' -SH、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双功 能抗体的抗体分子。
[0088] 有可能获得单克隆抗体以及其他抗体，以及使用重组DNA技术产生其他结合标靶 抗原的抗体或嵌合分子。此技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA导入 不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见，例如：EP-A-184187、GB 2188638A或 EP-A-239400,以及后来的大部分文献。可使产生抗体的杂交瘤或其他细胞进行基因突变或 其他改变的处理，其可能会或可能不会改变所产生抗体的结合特异性。
[0089] 因为抗体可经多种方式修饰，所以术语"抗体分子"应被解释为涵盖任何具有所需 特异性和/或结合至抗原的抗体之抗原结合位点的结合成员或物质。因此，此术语涵盖抗 体片段以及衍生物，包括不管是天然的或者是全部或部分人工合成的任何包含抗体之抗原 结合位点的多肽。因此包括含有抗体之抗原结合位点（或相等物）与另一多肽（例如：由 另一物种衍生而来，或属于另一抗体类型或亚型）融合成的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和 表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023,以及后来的大部分文献。
[0090] 抗体工程技术领域中可得到的更进一步技术已使得有可能分离人以及人源化 抗体。例如，人杂交瘤可以由Kontermann&Dubel所述的方式制得（Kontermann&Dubel ( 2001),S,Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC ;ISBN: 3540413545)〇 噬菌体展示，另一种已建立用于产生结合成员的技术，于许多公开文献中已有详细的说 明，诸如：W092/01047(进一步于下文讨论）和美国专利第US5969108号、第US5565332 号、第 US5733743 号、第 US5858657 号、第 US5871907 号、第 US5872215 号、第 US5885793 号、第 US5962255 号、第 US6140471 号、第 US6172197 号、第 US6225447 号、第 US6291650 号、第 US6492160 号、第 US6521404 号和 Kontermann&Dubel(2001)(S,Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC ;ISBN:3540413545)。将小鼠抗体基因去活 化并以人抗体基因功能性取代，同时留下小鼠免疫系统的完整的其他组份的转基因小鼠可 用来分离人抗体（Mendez et al·，（1997) ,Nature Genet, 15 (2) :146-156) 〇
[0091] 合成性抗体分子的制造可藉由从以寡核苷酸合成的手段产生的基因，然后装配在 适合的表达载体内而表达出来，例如：于Knappik等人（2000) (J. Mol. Biol. 296, 57-86)或 Krebs 等人（2001) (Journal of Immunological Methods, 25467-84)发表的文章所述。
[0092] 已显示整个抗体的片段可进行结合抗原的功能。结合片段的实例为（i)由VL、 VH、CL和CHl结构域组成的Fab片段；（ii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；（iii)由 单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；（iv)dAb片段（Ward et al. (1989)Nature 341, 544-546 ；McCafferty et al. , (1990)Nature, 348, 552-554 ；Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490)，其是由 VH 或 VL 结构域组成；（V)分离的 CDR 区域；(vi)F(ab'）2片段，一种包含两个相连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分 子（scFv)，其中VH结构域和VL结构域经由肽连接子连接，使得此两个结构域能缔合形 成抗原结合位点（Bird et al. (1988)Science, 242, 423-426 ;Huston et al. (1988)PNAS USA，85,5879-5883) ;(viii)双特异性的单链 Fv 二聚物（PCT/US92/09965);和（ix)因基因 融合构建成的"双功能性抗体（diabodies)"、多价或多特异性片段（W094/13804 ;Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448)。Fv、scFv 或双功能性抗体分子 可藉由掺入二硫基桥连接该VH与VL结构域予以稳定化（Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245)。亦可制造包含连接至CH3结构域的scFv的微体（minibodies) (Hu et al. (1996), Cancer Res. , 56 (13) : 3055-61)。结合片段的其他实例为Fab'，其与 Fab 片段的差异为在重链CHl结构域的羧基末端处添加了一些残基，包括一个或多个来自该抗 体绞链区的半胱氨酸，以及Fab' -SH，其是恒定区的半胱氨基酸残基带有游离巯基基团的 Fab'片段。
[0093] 本发明所用的抗体片段可从任何本文所述的抗体分子（例如：包含VH和/或VL 结构域或任何本文所述的抗体的CDR的抗体分子）开始，利用诸如酶（例如：胃蛋白酶或木 瓜蛋白酶）消化的方法和/或利用化学还原打断二硫桥的方法而得到。于另一方法中，本 发明的抗体片段可利用本领域熟练技术人员熟知的基因重组的技术制得，或利用其他肽合 成方法，例如，使用诸如Applied Biosystems等公司所提供的自动肽合成器，或核酸合成以 及表达制得。
[0094] 本发明的功能性抗体片段包括任何半衰期经化学修饰（特别是聚乙二醇化）或经 掺入脂质体中而延长的功能性片段。
[0095] dAb (结构域抗体）是一种抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变 区（Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21,484-490)。VH dAbs 天然存在于胳 驼科（例如：骆驼、骆马）中，可经由以标靶抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞， 和直接从个别B细胞中克隆dAb基因而产生。dAb亦可于细胞培养物中生产。它们的小尺 寸、良好的溶解性以及温度稳定性使得它们特别有利于生理上的应用，适合用于选择以及 亲和力成熟。本发明的结合成员可为包含实质上如本文所述的VH或VL结构域的dAb，或包 含含有实质上如本文所述的CDR组的VH或VL结构域的dAb。
[0096] 本文中所用的词组"实质上如…所述"代表本文中所述的结合成员的VH或VL结 构域的相关CDR的特征会与本文中所示的序列的指定区域相同或高度相似。针对一个或多 个可变结构域的指定区域使用的表达"高度相似"，意指可以在CDR和/或VH或VL结构域 中进行1至约5个（例如至4个，包括1至3个，或1或2个，或3个或4个）氨基酸取 代。
[0097] 双特异性或双官能性抗体形成第二代单克隆抗体，在其中两个相异的可变区于相 同分子中组合（Holliger and Bohlen 1999Cancer and metastasis rev. 18:411-419)。由 所述能够恢复新的效应子功能或将许多分子靶向至肿瘤细胞表面的能力，已证实它们在诊 断领域以及治疗领域内的应用。使用双特异性抗体时，它们可为常见的双特异性抗体（其 可以各种方法制成（Holliger et al. (1993b) ,Current Opinion Biotechnol 4,446-449)， 例如：由化学方法制得或从杂合杂交瘤制得），或可为如前文所述的双特异性抗体片段中 的任一种。所述抗体可经由化学方法（Glennie et al.，（1987) J. Immunol. 139, 2367-2375 ; Repp et al·，（1995) J.Hemat. 377-382)或体细胞方法（Staerz U.D· and Bevan M.J· (1986)PNAS 83 ;Suresh et al. (1986)Method.Enzymol. 121:210-228)制得，同样可由 基因工程技术制备，其使得异源二聚体化作用加速，并因而促进所搜寻的抗体的纯化过程 (Merchant! et al.，1998Nature Biotech. 16:677-681)。双特异性抗体的实例包括那些具有 BiTE?技术者，其中可使用具有不同特异性的二种抗体的结合结构域，并通过短的柔性肽直 接连接。这样将二个抗体组合在短的单一多肽链上。双功能性抗体和scFv可在没有Fc区 域的情况下仅使用可变区构建，有可能会降低抗独特型反应的效用。
[0098] 双特异性抗体可构建为完整IgG、双特异性Fab' 2、Fab' PEG、双功能性抗体或其他 双特异性scFv。再者，二个双特异性抗体可使用技术领域熟知的例行方法连接在一起以形 成四价抗体。
[0099] 与双特异性完整抗体相反，双特异性双功能性抗体亦可特别有用，因为它们可轻 易地建构成且可在E. coli中表达。使用噬菌体展示系统（W094/13804)，可从文库中轻易 地选择具有适当结合特异性的双功能性抗体（和许多其他多肽，诸如抗体片段）。假如该 双功能性抗体的一个臂需要保持恒定（例如，具有针对标靶抗原的特异性），则可建立一个 文库，其中另一臂是可变的，并选择具有适当特异性的抗体。双特异性完整抗体可经由在 Ridgeway等人发表的文献（1996) (Protein Eng. ,9,616-621)中所述的替代性工程方法制 得。
[0100]
技术领域中有各种方法可用于获得抗标靶抗原的抗体。该抗体可为单克隆抗体， 特别是人、鼠科动物、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，其可依照熟谙此技术人士所熟知的 标准方法制得。
[0101] 一般而言，在制备单克隆抗体或其功能性片段（特别是鼠科动物来源）的方面， 可能参照特别地在手册"Antibodies"（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y. , pp. 726, 1988)中描 述的技术，或由Kohler和Milstein (1975, Nature, 256:495-497)所述的从杂交瘤制备的技 术。
[0102] 单克隆抗体可从，例如，经A-FN或其含有可被该单克隆抗体识别的表位的片段 (例如：包含或由ED-A组成的片段，或ED-A的肽片段）中之一免疫的动物细胞取得。该 A-FN(或其片段之一）可特别地根据一般的操作方法，利用基因重组从编码A-FN(或其片 段）的cDNA序列中所含的核酸序列开始，利用肽合成从A-FN和/或其片段的肽序列中所 包含的氨基酸序列开始，来加以制造。
[0103] 例如，单克隆抗体可在亲和柱（于其上A-FN或所述含有可被该单克隆抗体识别的 表位的片段（例如：包含或由ED-A组成的片段，或ED-A的肽片段）之一已预先被固定在其 上）上纯化。单克隆抗体可经由层析于蛋白质A和/或蛋白质G上纯化，接着使用或不使 用离子交换层析，其目的为消除残留的蛋白质污染物以及其本身中的DNA与LPS，接着使用 或不使用Sepharose凝胶上的排阻层析法，其目的为消除因二聚物或其他多聚物的存在而 可能产生的凝聚。可同时使用或依续使用所述技术的全体。
[0104] 抗原结合位点
[0105] 此术语描述结合至并互补于标靶抗原的全部或部分的分子部分。在抗体分子中， 其代表抗体的抗原结合位点，并包含结合至并互补于标靶抗原的全部或部分的抗体部分。 当抗原较大时，抗体可能仅结合至该抗原的特定部分，此部分被称为表位。抗体之抗原结合 位点可由一个或多个抗体可变结构域提供。抗体之抗原结合位点可包含抗体轻链可变区 (VL)和抗体重链可变区（VH)。
[0106] 分离
[0107] 分离意指一种状态，其中本发明使用的特异性结合成员或编码此特异性结合成员 的核酸，通常与本发明一致。因此，如本发明的特异性结合成员、VH和/或VL结构区，可 (例如）从其天然环境中分离和/或纯化而得，呈实质上纯的或均质形式，或在核酸的情况 下，呈无或实质上无除编码具有所需功能的多肽的序列外的其他来源的核酸或基因。分离 的成员以及分离的核酸无或实质上无与其天然相关的材料，诸如其他于所述的天然环境中 发现的多肽或核酸，或当于体外或体内实施重组DNA技术制备时，于其制备的环境（例如： 细胞培养物）中可发现的多肽或核酸。特异性结合成员和核酸可以稀释剂或佐剂配制，且 为实用目的仍是分离的，例如：该成员通常可与明胶或其他载体（若有使用）混合，以涂覆 在供免疫分析使用的微滴定板，或当应用于诊断或治疗时，可与药学可接受的载体或稀释 剂混合。特异性结合成员可为天然糖基化的，或经异源真核细胞（例如：CHO或NSO (ECACC 85110503))细胞体系糖基化的，或其可为（例如，假如是于原核细胞中表达而产生）非糖基 化的。
[0108] 包含抗体分子的异源制品亦可用于本发明。例如，此制品可为具有全长重链与缺 少C端赖氨酸的重链，具有各种糖基化程度和/或衍生化氨基酸（诸如N端谷氨酸的环化， 以形成焦谷氨酸残基）的抗体的混合物。
[0109] 抗原（例如：A-FN、纤维连接蛋白的ED-A)的一个或多个特异性结合成员可藉由使 本发明的特异性结合成员文库与抗原或其片段（例如：包含ED-A或由ED-A组成的片段，或 ED-A的肽片段）接触，并选择该文库中能够与该抗原结合的一个或多个特异性结合成员来 获得。
[0110] 抗体文库可利用 Iterative Colony Filter Screening(ICFS)筛选。ICFS 中，含 有编码多种结合特异性的DNA的细菌生长在液体培养基中，当已达指数生长阶段时，将数 十亿细菌分散在由合适预处理的薄膜滤纸组成的生长支持物上，并培养直到完全汇聚的菌 落出现为止。第二捕获基底（trap substrate)由另一薄膜滤纸（经预先湿润并以所需要 的抗原覆盖）组成。
[0111] 接着将该捕获薄膜滤纸置于含有适当培养基的板上，并以生长薄膜覆盖，其中被 菌落覆盖的面朝上。将所得到的夹层结构物在室温培养约16小时。因此有可能得到扩散状 的抗体片段scFv编码基因的表达，因而捕获与存在于该捕获膜上的抗原特异性结合的片 段。接着将该捕获薄膜以常规用于此目的的比色技术处理以将结合的抗体片段指示出来。
[0112] 该捕获滤纸上彩色斑点的位置使得能够回溯至存在于生长薄膜上并制造被捕捉 的抗体片段的对应菌落，收集这样的菌落并使细菌生长一将数以百万计的该细菌重复前述 步骤而分散在新的培养薄膜上。进行类似的循环直到捕获薄膜上的阳性信号对应于单一阳 性菌落为止，各阳性菌落代表针对筛选中所用抗原的单克隆抗体片段的可能来源。ICFS描 述于例如W00246455。
[0113] 文库亦可展示在颗粒或分子复合体（例如：可复制的基因封包，诸如噬菌体（例 如：T7)颗粒或其他体外展示系统）上，各粒子或分子复合体含有展示于其上的抗体VH可 变结构域的编码核酸，以及任选地所展示的VL结构域的编码核酸（如存在的话）。噬菌体展 示法描述于W092/01047和例如：美国专利第US5969108号、第US5565332号、第US5733743 号、第 US5858657 号、第 US5871907 号、第 US5872215 号、第 US5885793 号、第 US5962255 号、 第 US6140471 号、第 US6172197 号、第 US6225447 号、第 US6291650 号、第 US6492160 号和第 US6521404 号。
[0114] 筛选能够结合抗原并展示在噬菌体或其他文库粒子或分子复合体上的结合成员 之后，可从展示该被选定的结合成员的噬菌体或其他粒子或分子复合体取得核酸。该核酸 可用于后续结合成员或抗体VH或VL可变结构域的制造，其是藉由从带有取自展示该被选 定结合成员的噬菌体或其他粒子或分子复合体的核酸序列的核酸进行表达而得到的。
[0115] 带有该被选定结合成员的抗体VH可变结构域的氨基酸序列的抗体VH可变结构域 可以分离形式提供，包含这样的VH结构域的结合成员也可以分离形式提供。
[0116] 可进一步检测结合A-FN或纤维连接蛋白的ED-A或其他标靶抗原或同种型的能 力，例如：与抗ED-A抗体F8竞争与A-FN或A-FN的片段（例如：纤维连接蛋白的ED-A)相 结合的能力。
[0117] 本发明使用的特异性结合成员可特异性结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。 本发明的特异性结合成员可以与抗ED-A抗体F8(例如：scFv形式）相同或更好的亲和力 结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。本发明使用的特异性结合成员可以K d为3 X KT8M 或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。优选地，本发明使用的特异性结合 成员以Kd为2 X KT8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。更优选地， 本发明使用的特异性结合成员以K d为I. 7 X KT8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连 接蛋白的ED-A。进一步更优选地，本发明使用的特异性结合成员以K d为I. 4 X KT8M或更好 的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。最优选地，本发明使用的特异性结合成员 以K d为3 X KT9M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。
[0118