该核酸表达，例如：藉由将宿主细胞培养在表 达该基因的条件下。所表达产物的纯化可藉由本技术领域中熟练技术者已知的方法实现。
[0162] 核酸可嵌入宿主细胞的基因组（例如：染色体）。可藉由根据标准技术纳入促进 与基因组重组的序列而促进整合。
[0163] 本文亦描述一种在表达系统中利用前文说明的构建体表达如前述的特异性结合 成员或多肽的方法。
[0164] 本发明使用的特异性结合成员被设计用于诊断或治疗人或动物个体（例如：人） 的方法。本发明使用的特异性结合成员可用于诊断或治疗IBD。
[0165] 因此，本发明提供了包含施予如所述的特异性结合成员或包含该特异性结合成员 的药物组合物的治疗方法，和该特异性结合成员用于制造供施予的药物的用途，例如：制造 药物或药物组合物的方法，其包含将特异性结合成员与医药上可接受的赋形剂一起配制。 医药上可接受的载体是众所周知的，并且可由本技术领域中的熟练技术人员根据所选活性 化合物的性质和施予模式进行调整。
[0166] 本发明使用的特异性结合成员通常会以药物组合物的形式施予，其中除该特异性 结合成员以外还可包含至少一种组分。因此，本文所述并根据本发明所用的药物组合物中， 除活性成分外，还可包含医药上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域熟练技术 人员熟知的其它物质。该物质应为无毒的且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的 确切性质将视施予的途径而定，该途径可为口服、吸入或注射（例如：静脉注射）。
[0167] 用于口服施予的药物组合物（诸如例如纳米小体（nanobody)等）亦涵盖在本发 明中。这样的口服配方可为片剂、胶囊、粉剂、液体或半固体形式。片剂可包含诸如明胶的 固体载剂或佐剂。液体药物组合物一般包含诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油 的液体载体。生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二 元醇类可被包括在内。
[0168] 以静脉注射或注射于患部而言，活性成分的形式可以是胃肠外可接受的水溶液， 其不含热源（pyrogen-free)并具有适当的pH值、等张性和稳定性。本技术领域中的那些 相关技术可用来制备合适的溶液，使用例如：诸如Sodium Chloride Injection、Ringer's Injection、Lactated Ringer's Injection的等张媒液。如有需要，可使用防腐剂、稳定剂、 缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。医药配方的许多制备方法为本技术领域中熟练技术 人员所已知。参见例如Robinson ed·，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker，Inc.，New York，1978〇
[0169] 视所治疗的病况而定，组合物可单独进行，或与其他治疗一起同时或依序使用或 作为与其他治疗剂的组合制剂而施予。
[0170] 本发明使用的特异性结合成员可与额外药品组分结合用作组合疗法的部分。组合 治疗可用来提供显著的协同效应，特别是将本发明使用的特异性结合成员与一或多种其他 药品组合。本发明使用的特异性结合成员可同时或依序或作为与其他治疗剂的组合制剂而 施予，用来治疗一或多种本文所列的病况。
[0171] 例如：本发明使用的特异性结合成员可与已有的治疗剂组合使用来治疗IBD。
[0172] 本发明使用的特异性结合成员和一种或多种前述的额外药品组分可用于制造药 物。该药物可分别或组合施予个体，据此可为包含特异性结合成员和额外组分的组合制剂 或分开制剂形式。分开制剂有助于分开和依序施予或同时施予，并容许组分的施予经由不 同途径（例如：口服和胃肠外施予）进行。
[0173] 依据本发明，所提供的组合物可施予哺乳类。可以"治疗有效剂量"施予，此剂量 足以对患者展现益处。该益处可为至少改善至少一种症状。因此，"IBD的治疗"代表改善 至少一种症状。施予的真实剂量和施予的频率与时程，将依治疗的性质和严重性、所治疗 的特定哺乳类动物、个别患者的临床病况、病症的起因、递送组合物的位置、特异性结合成 员的类型、施予的方法、施予的方案和医务人员已知的其它因素而定。治疗处方（例如：剂 量等的决定）是在一般从业者和其他医生的职责范围内，且可视症状的严重性和/或所欲 治疗的疾病的进程而定。抗体的合适剂量为本技术领域所熟知（Ledermann et al. (1991) Int.J.Cancer 47:659-664 ;and Bagshawe et al. (1991)Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922)。当适用于所施予的药物类型时，可使用本文或在 Physician's Desk Reference (2003)中所指出的具体剂量。本发明使用的特异性结合成 员的治疗有效剂量或合适剂量可藉由比较其体外活性和在动物模式的体内活性而确定。已 知小鼠和其他试验动物至人的有效剂量的推断方法。精确剂量将视数个因素而定，包括：抗 体是用于诊断、预防还是治疗，所欲治疗的范围大小和位置，确切的抗体性质（例如：完整 抗体、片段或双功能抗体），以及附着至抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。一般的 抗体剂量对于全身性应用会在100 μ g至Ig范围内，局部应用则在1 μ g至Img范围内。初 始可施予较高的载入剂量，接着施予一个或多个较低剂量。抗体可为完整抗体，例如=IgGl 或IgG4同工型。这是用于成年患者的单一治疗的剂量，其可依比例调整而用于孩童和婴幼 儿，亦可依其他抗体形式的分子量比例调整。治疗可依医师判断以每日一次、每周两次、每 周或每月的间隔重复。治疗于皮下施予的情况可为每二至四周一次，而于静脉施予则为每 四到八周一次。在本发明的一些实施例中，治疗可为周期性的，且两次施予之间的间隔是约 二周或更久，例如：约三周或更久、约四周或更久或约一个月一次。在本发明的其他实施例 中，可在手术前和/或手术后给予治疗，并可直接施予或施用至手术治疗的解剖位置。
[0174] 炎性肠病（IBD)
[0175] 炎性肠病是一群影响结肠和小肠的炎性病况。IBD的主要类型为克罗恩氏病 (Crohn' s disease，⑶）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC)，而其他类型的 IBD 包括胶原性结肠炎（collagenous colitis)、淋巴细胞性结肠炎（lymphocytic colitis)、 缺血性结肠炎（ischaemic colitis)、分流性结肠炎（diversion colitis)、贝赛特氏病 (Behcet'S disease)和未定型结肠炎（indeterminate colitis)。⑶可影响胃肠道的 任何部分，然而UC通常仅局限在结肠和直肠。
[0176] 本文中所称的IBD可为⑶、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、 分流性结肠炎、贝赛特氏病或未定型结肠炎。特别是本文中所使用的术语CD、UC、胶原性结 肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病和未定型结肠炎，可分 别指称活跃性CD、活跃性UC、活跃性胶原性结肠炎、活跃性淋巴细胞性结肠炎、活跃性缺血 性结肠炎、活跃性分流性结肠炎、活跃性贝赛特氏病和活跃性未定型结肠炎。在一实施例 中，该IBD可为CD或UC。在另一实施例中，该IBD可为CD、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠 炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病或未定型结肠炎。在进一步实施例中，该IBD 不为UC。该IBD可为一种通常不局限于结肠和直肠发炎的IBD，诸如⑶。该IBD可为一种 不仅止影响结肠内膜的IBD。在一个优选实施例中，该IBD是CD。最优选地，该IBD是活跃 性CD0
[0177] 根据包括下列实验范例的本公开文件，本领域熟练技术人员将能明白了解本发明 的更多方面和实施例。
[0178] 所有在此说明书中提及的文件均以引用方式将所述的全文并入本文中。
[0179] 本文中所使用的"和/或"被视为所指定的两个特征或组份中的每一个，其中具有 或不具有另一个。例如"A和/或B"被视为明确的揭示（i)A、（ii)B和（iii)A与B，就如 同其中每一个在此被单独地表述一样。
[0180] 除非另有说明，否则前文所载的特征的描述和定义并不局限于任何本发明的特定 方面或实施例，并同等的适用于所有所述的方面和实施例。
[0181] 本发明的某些方面和实施例现在将以实例方式说明并参照前文所述的附图。
[0182] 实验
[0183] 材料和方法
[0184] 小鼠 IBD模型
[0185] 与施予DSS相关的IBD小鼠模型为技术领域中所已知。适当小鼠模型的描述亦见 于例如：〇kayasu 等人的文章（1990) (Gastroenterology, 98, 694-702) 〇
[0186] 本文所述的实验是藉由在饮用水中加入3 %葡聚糖硫酸钠（DSS) (MP BioMedicals) 7天，接着给予正常饮用水3至5天，而在C57BL/6小鼠 （Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)中引发结肠炎。在本研宄的全程中均对对照组小鼠给予标 准水。利用第3至5天的潜血检测以及每日的体重变化作为监测小鼠疾病引发/进展的证 明。于停止在水中添加 DSS后3至5天的不同时间处死小鼠，以评估F8-IL-10的靶向、区 域定位和药理学效果。
[0187] 125I_F8/IL10放射性碘标定、纯化、鉴定和给药溶液制备
[0188] 125I-F8/IL10 是利用琥珀酰亚胺基-碘苯甲酸酯（SIB) (Zalutsky&Narula(1988) Cancer Research, 48, 1446-1450 ； Za I utsky&NaruI a (1987)App I. Radiat. Isot. 38, 1051-1055 ;Cheng, et al. (2002) J. Med. Chem. 45, 3048-3056)制备。简言之， 将一等分的碘-125 (20 μ L ~2. OmCi) (Perkin Elmer, Waltham, MA)与 2. 5 μ g N-瑭 珀酰亚胺基-3-(三-正丁基锡烷基）苯甲酸酯（C23H35NO4Sn ;MW = 508. 23，由Texas Biochemicals，Inc.College Station，TX 合成）和 IOyg NCS(Sigma-Aldrich，St. 1^〇11丨8，1\10)作为氧化剂在5〇4 1^的含有1.5%醋酸（￥:￥)的甲醇（均购自3丨81]^-41(11'；[(311) 中反应。在室温培养15分钟后，添加10 μ g亚硫酸钠（还原剂）（Sigma-Aldrich)并在 室温额外培养5分钟，以将反应溶液中剩余的氧化剂淬灭。于室温在pH 8.0培养20分 钟，以将经125I标记的SIB缀合至F8-IL10抗体（约0. 2mg，起始摩尔比是中间物比抗体 约为2.5:l)。将经过放射标记的产物（125I-F8/IL10)利用经预平衡的ro-10管柱（GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)(利用牛血清白蛋白使柱上可能的非 特异性蛋白结合位点饱和，接着以至少三倍柱体积的PBS冲洗柱）纯化，洗脱于PBS中。所 得的放射化学产率约为30%。
[0189] 分别以尺寸排阻层析法（size exclusion chromatogram(SEC))和EDA-亲和柱 鉴定125I-F8/IL10的放射化学纯度（radiochemical purity (RCP))和生物活性。在SEC分 析方面，将约I yci的125I-F8/IL10产物溶液注射至配备有粒径排阻柱（G3000SWxl，TOSOH Biosciences，Tokyo，Japan)的HPLC(Agilent 1100,配备有在线放射活性检测器）中，并 以25mM磷酸盐缓冲液、0. 15M NaCl、pH 6. 8的流动溶剂以每分钟ImL的流速洗脱。比较 125I-F8/IL10在放射测量层析中的滞留时间与参考F8/IL10在UV(280nm)层析中的滞留时 间以确认其身份。 125I-F8/IL10的RCP大于99%，放射性比活性（radioactive specific activity)约为 4. 5mCi/mg〇
[0190] 通过EDA亲和柱检测法测定125I-F8-IL10的生物活性。简言之，将一等分（约 lμCi)125I-F8/IL10上样至经预平衡的EDA亲和柱（含有 250 μLEDA树脂，藉由以2mL BSA (2mg/mL于PBS中）封闭非特异性结合位点、接着以8mL PBS洗涤柱而实施预平衡）。以 6mL的BSA (2mg/mL于PBS中）洗涤该亲和柱并以级分形式收集洗出液。在γ计数器中测 量所收集的洗出液的放射活性和该亲和柱上所残留的放射活性。计算残留在EDA-树脂柱 的放射活性对总上样放射活性的百分比。以 125I_F8/IL10而言，残留在亲和柱上的放射活 性百分比为64%。
[0191] 将125I_F8/IL10与未经标记的F8/IL10 (F8/IL10储存溶液）以及制剂缓冲液混合 至所需的最终浓度，制备用于PK和组织分布研宄的给药溶液。受试品（test article)溶 液是在给药当日制备，并在施予动物之前使其达到室温。
[0192] 125I_F8/IL10在IBD小鼠模型中的生物分布和区域定位至结肠
[0193] 在施药（开始DSS处理后的第5至7天）之前约2至4天，将未经或经DSS处理 的小鼠均以碘化钾（KI)水（20mM)处理，以阻断甲状腺对在体内产生的任何潜在未结合的 游离1-125。在开始DSS处理后的第9天，经由静脉（IV)注射施予单剂 125I-F8/IL10。每 组的剂量和放射活性说明如下：
[0194] i)第0组-每只小鼠的大致齐丨遣：5mg/kg
[0195] 第0组-每只小鼠的大致放射活性：7. 5 μ Ci (比活性75uCi/mg)。
[0196] ii)第1组-每只小鼠的大致剂量：5mg/kg
[0197] 第1组-每只小鼠的大致放射活性：10 μ Ci (比活性100uCi/mg)。
[0198] iii)第2组-每只小鼠的大致剂量：0· 15mg/kg，
[0199] 第2组-每只小鼠的大致放射活性：12 μ Ci (比活性4490uCi/mg)。
[0200] 分别在第5分钟、第1、3、6、24、48和96小时将小鼠亚组进行采血和收集不同组 织。血液样本是藉由心脏穿刺或眼后采血收集至血清分离收集管。藉由将血液样本在 10, OOOg离心5分钟收集血清样本。组织收集方面，则是处死动物，并在采集血液样本和 全身性灌流之后立刻收集感兴趣的组织。全身性血液灌流是藉由在约10分钟期间施予约 20mL的肝素 -PBS (每mL 25单位）而实施。收集并称重感兴趣的组织，包括：脑、肠系膜淋 巴结、皮肤、脂肪、大腿骨骼肌、肺、心、脾、肝、胃、小肠、大肠和肾。将GI中的内容物移除。直 接以γ计数器测量组织样本中的放射活性（以cpm表达的总计数）。
[0201 ] 患病和健康小鼠的结肠放射自显影
[0202] 在来自第0组和第2组小鼠的结肠进行结肠放射自显影（radio-autography)。收 集结肠、清除所述的内容物并将组织暴露于放射性磷成像屏（phosphor-imaging screen) (Molecular Dynamics) 24小时，并经由Storm 860成像。结果显示于图2。第1道：注射6 小时之后，收集自第0组（健康小鼠）的结肠；第2道：注射6小时之后，收集自第2组（经 DSS处理的小鼠）的结肠；第3道：注射24小时之后，收集自第O组（健康小鼠）的结肠； 第4道：注射24小时之后，收集自第2组（经DSS处理的小鼠）的结肠。在经DSS处理的 小鼠中沿着结肠可观察到块状的125I_F8/IL10定位，在正常小鼠中则未能观察到，此结果与 本模型中不规则的结肠发炎和相关的靶EDA表达模式相符。
[0203] 测定血清和组织中放射活性当量浓度与药物动力学计算
[0204] 125I_F8/IL10的血清当量浓度（ng eq. /g)以所测得的TCA(三氯乙酸）可沉淀性 (与蛋白质相关）放射活性为基础进行估算。为了进行TCA沉淀作用，将等分量（50μυ 的血清样本与50 μ L小鼠血清混合，接着添加100 μ L的20 % TCA溶液。将样本混合物在 10, OOOg旋转5分钟以沉淀蛋白质。测定上清液中的总体放射活性和TCA可溶性放射活性。 利用给定样本中的TCA可沉淀性放射活性（cpm)、给药溶液的比活性（每mg蛋白质的TCA 可沉淀性cpm)，以及采样（ts)与给药溶液（tD)测量的日期，以下列方程式计算给定样本中 受试品的当量浓度（ng eq. /mL) : [TCA 可沉淀性 cpm/EXP(-0. 693/60. (以cpm/mg表示）*样本体积（以mL表示）]。
[0205] 125I-F8/IL10在组织中的当量浓度（ng eq./g)定量是以在样本中测得的总体放 射活性和校正125I的物理性衰退半衰期后给药溶液的比活度为基础，利用下列方程式计算： [样本 cpm/EXP (-0· 693/60· 2* (ts-tD)) ] / [比活性（以 cpm/mg 表示）* 样本重量（以 mg 表 示）]。组织样本没有进行匀浆化作用或TCA沉淀作用。除了放射活性当量浓度（血清为ng eq./mL，组织为ne eq./g)之外，还计算血清和感兴趣组织每克的注射剂量百分比ID/ g)和/或注射剂量百分比ID)。
[0206] 在注射后6小时（图3A)、24小时（图3B)和96小时（图3C)，测定正常小鼠（第 0组）和经DSS处理小鼠（第1组）中 12