重组Tat-Cygb融合蛋白在抗肝纤维化中的作用
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物医学技术领域，涉及重组融合蛋白在抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化中的应用。
【背景技术】
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[0002]炎症(inflammat1n):是具有血管系统的活体组织对损伤因子发生的防御反应，是感染及其许多疾病的最基本病理过程。炎症的发生发展过程一般分为三期:毛细血管扩张、通透性亢进；血小板吸附及白细胞游走；肉芽组织增生。炎症是临床常见的病理过程，可以发生于机体各组织和器官。急性炎症具有红、肿、热、痛等变化，同时常伴有发热、白细胞增多等全身反应。致炎因子作用于机体后，一方面引发细胞损伤坏死；另一方面，刺激机体抗病机能增加，使机体的内坏境及内境界和外坏境之间达到新的均衡。
[0003]创伤愈合(wound healing):是机体遭受外力作用后，皮肤等组织出现离断或缺损后的愈合恢复过程，包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成等。
[0004]皮肤创伤愈合的基本过程主要包括:急性炎症期、细胞增生期、瘢痕形成期、表皮及其它组织再生期。根据创伤的严重程度分为三种情况:创伤仅限于皮肤表皮层；稍重者皮肤和皮下组织断裂并出现伤口 ；严重的创伤可有肌肉、肌腱、神经的断裂。
[0005]创伤愈合可分为一般愈合、二期愈合、痂下愈合三种类型。
[0006]I) 一般愈合(healing by first intent1n):一般愈合的时间短，形成瘢痕较少。多见于如手术切口等组织缺损少、创缘整齐、无感染、经粘合或缝合后创面对合严密的伤口，伤口中只有少量血凝块，炎症反应轻微，表皮再生在24?48小时内便可覆盖伤口。肉芽组织在第3天就可从伤口边缘长出并很快将伤口填满，5?6天胶原纤维形成，约2?3周完全愈合。
[0007]2) 二期愈合(healing by second intent1n):见于组织缺损较大、创缘不整、无法整齐对合，或伴有感染的伤口。与一期愈合相比，主要有如下不同:①由于坏死组织多，或由于感染，继续引起局部组织变性、坏死，炎症反应明显。只有控制感染，清除坏死组织，再生才能开始。②伤口大，且伤口收缩明显，从伤口底部及边缘长出肉芽组织将伤口填平。③愈合的时间较长，形成的瘢痕较大。
[0008]3)痂下愈合(healing under scab):伤口表面的血液、渗出液及坏死物质干燥后形成黑褐色硬痂，在痂下进行愈合。待上皮再生完成后，痂皮即脱落。如果痂下渗出物较多，如果有细菌感染，痂皮阻碍渗出物排出，不利于愈合。此种愈合所需时间长于无痂者，因这种情况下表皮再生必须首先将痂皮溶解，然后才能生长。
[0009]所以，创伤愈合用药原则应该包括缩小创面、防止再损伤和促进组织再生。损伤的程度及组织的再生能力决定修复的方式、愈合的时间及瘢痕的大小。组织的再生能力主要在进化过程中获得，但仍受全身及局部条件的影响。全身因素(如年龄、营养)及局部因素(如感染与异物感染、局部血液循环、神经支配、电离辐射等)两方面都会影响再生修复的进展。
[0010]肝纤维化(Hepatic fibrosis, HF):是多种慢性肝脏疾病的共有病理阶段，肝纤维化持续发展可转变为肝硬化甚至肝癌，且肝病的中晚期都会发生致命的并发症。我国是一个肝病大国，高发病率和高死亡率是肝脏疾病的最大特点。肝纤维化是肝脏应对不同病因(炎症、酒精、寄生虫、化学毒物、免疫、营养代谢障碍、血液循环障碍、慢性病毒感染、胆管阻塞等)损伤刺激的自我修复反应；损伤的肝细胞分泌多种细胞因子，伴随肝窦内皮细胞、血小板分泌的细胞因子和某些化学介质共同激活肝星状细胞，使其转化为肝肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFB) ,MFB通过旁分泌和自分泌作用，产生大量以胶原为主要成分的细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)，ECM的过渡沉积，合成与降解失衡，导致肝纤维化的发生、发展。研宄证明，肝纤维化是可逆的，而一旦发展为肝硬化甚至肝癌，人们将束手无策。肝纤维化是肝硬化的早期阶段和必经阶段，在一定情况下可以逆转，但若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化。
[0011]积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施，对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。目前，肝纤维化治疗研宄主要集中在以下几个方面:1)保护肝细胞，抑制HSC激活，2)抑制ECM合成，促进其降解，3)抑制细胞因子活性，调节信号通路。
[0012]细胞球蛋白(Cytoglobin, Cygb)，是近几年来在脊椎动物中发现的六配位血红素球蛋白(hxHb)超家族中的新成员，在多种生物及组织中表达。研宄表明，细胞球蛋白Cygb可能与癌症的发生有关。食管癌、肺癌及结肠癌等恶性肿瘤中，Cygb的表达常常是被抑制的，通过基因治疗的方法表达Cygb，能够抑制肺癌细胞的正常生长。
[0013]细胞穿膜肽，即CPPs，又称为蛋白转导域或膜转导肽，是一种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载生物活性物质如肽、蛋白、反义核苷酸和脂质体等许多物质。细胞穿膜肽的出现，解决了因药物无法进入细胞而导致药效严重削弱的难题。Tat是近年研宄较深入的细胞穿膜肽，通过与生物大分子(如核酸或蛋白质)的融合，能够使融合蛋白转导真核细胞膜并进入细胞内。
[0014]本发明所述重组融合Tat-Cygb人源细胞球蛋白的抗炎、创伤愈合及抗肝纤维化作用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。
【发明内容】
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[0015]本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在抗炎症中的应用。
[0016]本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在创伤愈合中的应用。
[0017]本发明提供了重组融合Tat人源细胞球蛋白在抗肝纤维化中的应用。
[0018]Tat-Cygb抗炎症实验结果显示:通过模型组与各给药组的对比可以看出，各给药组均可不同程度地缓解小鼠的耳廓肿胀，高剂量TAT -Cygb组和地塞米松组与模型组相比，均具有显著性差异(p〈0.01)，其中高剂量TAT -Cygb的抗炎效果略逊色于地塞米松组，但二者之间无显著性差异(P>0.05)，而低剂量TAT - Cygb组小鼠的耳廓肿胀程度较地塞米松组和高剂量组高，与模型组相比无显著性差异(P〈0.05)。
[0019]Tat -Cygb创伤愈合实验结果显示:TAT -Cygb和Cygb均可促进伤口愈合，推测二者均因具有过氧化物酶活性而具有抗炎症作用，从而促进伤口愈合。此外，由于TAT - Cygb带有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮肤细胞，在细胞内作用，促进皮肤细胞生长，因此效果较Cygb更明显。
[0020]Tat - Cygb抗肝纤维化实验结果显示:
[0021]利用CCI4致小鼠肝纤维化模型，通过观察小鼠的生长状态和肝组织外观、测定血清及组织中各项肝功能指标含量以及病理切片分析验证，治疗组肝脏恢复了血色和光泽，肝脏内胶原纤维含量明显减少；在肝功能检测中，治疗组血清ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常组，与模型组相比有显著差异；纤维化血清标志物检测中，HA、LN、C-1I1、C-1V等含量变化证明TAT-Cygb可减少肝细胞外基质(ECM)的含量；肝组织指标含量变化显示，TAT-Cygb治疗组可减轻超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢复正常水平，同时可降低脂质过氧化产物MDA的含量和胶原纤维的亚氨基成分Hyp，综上可知，通过尾静脉注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促进CCl4导致的小鼠肝纤维化逆转。
[0022]本发明提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在抗炎症中的应用。
[0023]本发明提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在创伤愈合中的应用。
[0024]本发明还提供了以重组融合Tat-Cygb蛋白为活性成分组成的药物组合物在抗肝纤维化中的应用。
【附图说明】
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[0025]图1重组TAT-Cygb对小鼠耳廓肿胀急性炎症的影响
[0026]其中:I—模型组；2—地塞米松组；3—低剂量组；4—高剂量组
[0027]图2大鼠创伤模型构建
[0028]图3皮肤创伤愈合情况
[0029]图4大鼠皮肤创伤组织切片HE染色(第16天，X 100)
[0030]其中:(a)-正常皮肤；(b)-对照组；(C)-红药水组；(d)-低剂量组；(e)-高剂量Cygb 组；(f)-低剂量 TAT-Cygb 组；(g)-高剂量 TAT-Cygb 组
[0031]图5各组小鼠肝脏外观
[0032]其中:(a)_正常组;(b)_刚造模完小鼠;(C)-模型组;(d)-低剂量TAT-Cygb组;(e)_高剂量TAT-Cygb组
[0033]图6各组小鼠肝脏HE染色(40倍)
[0034]其中:(a)_正常组;(b)_刚造模完小鼠;(C)-模型组;(d)_低剂量TAT-Cygb组;(e)_高剂量TAT-Cygb组
[0035]图7各组小鼠肝脏天狼猩红染色(40倍)
[0036]其中:(a)-正常组;(b)-刚造模完小鼠;(C)-模型组;(d)-低剂量TAT - Cygb组;(e)-高剂量