[0081]2)肝纤维化小鼠模型构建:正常饲养25g的KM小白鼠一周，开始造模。模型组、高剂量TAT -Cygb组和低剂量TAT -Cygb组的小白鼠以lmL/100g体重腹腔注射CCl4溶液，每隔两天腹腔注射一次，共注射16次，造模历时46天。前3次使用15%的CCl4溶液，中间10次使用25%的CCl4溶液，最后3次使用30%的CCl 4溶液。正常组小白鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。所有小白鼠均用足量的鼠粮和水饲养。
[0082]3)TAT-Cygb治疗:待46天造模完成，立即开始治疗。高剂量TAT - Cygb组以120 μ g/ (次?只)尾静脉注射TAT -Cygb融合蛋白，低剂量TAT -Cygb组以60 μ g/ (次?只)尾静脉注射TAT - Cygb融合蛋白，模型组和正常组小白鼠以200 μ L/ (次?只)尾静脉注射生理盐水。每隔一天尾静脉注射一次，共注射15次，历时四周。
[0083]造模46d中，小鼠精神萎靡不振，皮毛不干净，肚子胀大，活动减少，嗜睡，进食量和饮水减少，尿液黄，说明小鼠肝脏因CCl4受损，进而影响到小鼠的健康生长。而正常组皮毛顺滑，体重恒定，较活跃，进食量和饮水均正常。
[0084]在给药的一个月内，高剂量TAT - Cygb组小鼠逐渐活跃起来，皮毛变得顺滑，进食量和饮水趋于正常。低剂量TAT - Cygb组小鼠比模型组稍好，活动较活跃，但皮毛不顺滑。而模型组小鼠仍然有皮毛不干净、嗜睡、进食量和饮水较少的症状。小鼠肝脏外观:
[0085]在给药I个月后，解剖小鼠，肉眼观察肝脏外观，并拍照记录。
[0086]如(图5)，可以明显看出各组小鼠肝脏外观的区别及变化。正常组小鼠肝脏质地软，光泽度高，表面光滑，边缘锐利整齐，整个肝脏呈暗红色，见(图5a);模型组小鼠肝脏质地硬光泽度低，表面粗糙有颗粒状，边缘较钝，整个肝脏发黄，趋向于肝硬化，个别肝脏部分与膈膜和周围器官粘连，如(图5b);—个月后的模型组小鼠肝脏质地仍较硬，光泽度低，表面粗糙有颗粒状，边缘比刚造模完的肝脏有所好转，整个肝脏仍较黄，见(图5c);低剂量TAT - Cygb组小鼠肝脏质地比模型组软，但仍比正常组硬，光泽度低，表面有模糊颗粒，边缘较锐利，肝脏颜色稍黄，见(图5d);高剂量TAT-Cygb组小鼠肝脏质地软，光泽度明显增加，表面较光滑，边缘锐利整齐，肝脏呈暗红色，见图5e。
[0087]肝脏切片HE染色(图6)显示:
[0088]正常组小鼠肝组织的肝小叶结构正常，有完整的网状纤维支架，分布规律，肝细胞索以中央静脉为中心朝四周放射排列，肝索细胞排列紧凑，形态正常，见(图6a);模型组小鼠肝组织肝小叶结构紊乱，汇管区纤维化并扩大，胶原沉积于其周围，汇管之间有纤维间隔形成，肝细胞体积增大，伴随大片炎性细胞浸润，表明严重的损伤性病理改变，见(图6b);一个月后的模型组小鼠肝组织有稍微的恢复，但仍有严重的损伤性病理改变，如(图6c);低剂量TAT - Cygb组小鼠肝组织肝小叶结构正常，中央静脉周围仍有胶原沉积，偶见汇管区纤维化和汇管之间的纤维间隔，肝索细胞排列紧凑，形态正常，见(图6d);高剂量TAT -Cygb组小鼠肝组织的肝小叶结构正常，肝细胞索呈放射排列，无炎性细胞，个别偶见汇管区纤维化，与低剂量TAT-Cygb组和模型组对比明显好转，如(图6e)。HE染色结果可初步说明TAT - Cygb对CCI4导致的肝纤维化有剂量依赖的治疗作用。
[0089]肝脏切片苦味酸天狼猩红染色
[0090]采用苦味酸天狼猩红染色法以更好地识别胶原纤维。染色结果可见(图7)，正常组小鼠肝组织肝小叶完整，结构正常，只在中央静脉、门管区、肝门静脉和肝动脉边缘有少量胶原着色，无纤维化，如(图7a);模型组小鼠肝组织汇管区周围大量胶原沉积、纤维化，伴随炎性细胞浸润，汇管之间以及汇管和中央静脉之间形成纤维间隔，使肝小叶结构紊乱，并形成假小叶，如(图7b);低剂量TAT-Cygb组小鼠肝组织小叶结构完整，纤维化程度较轻，汇管区纤维化，纤维间隔减少，胶原着色比模型组浅，如(图7c);高剂量TAT-Cygb组小鼠肝组织小叶完整，结构正常，偶见小叶内小纤维瘢痕，汇管区胶原着色浅，纤维化程度低，如(图7d)。苦味酸天狼猩红染色表明TAT -Cygb可显著降低小鼠肝脏中的胶原含量，减轻肝纤维化程度。
[0091]肝脏切片Masson三色染色:
[0092]采用Masson三色染色(图8)以区分组织中的胶原纤维和肌纤维。如图8a，正常组小鼠肝组织肝小叶结构正常，有完整的网状纤维支架，肝细胞索以中央静脉为中心朝四周放射排列，仅肝动脉、肝门静脉和少量中央静脉边缘存在少量胶原，无纤维化存在；模型组小鼠肝组织肝小叶紊乱，汇管区有大量胶原沉积，汇管之间以及汇管和中央静脉之间形成胶原纤维间隔，假小叶形成，伴随炎性细胞浸润，如(图Sb);低剂量TAT -Cygb组小鼠肝组织纤维化程度降低，肝小叶结构完整，汇管区纤维化较轻，但门管区周围仍有较多胶原存在，如(图8c);高剂量TAT -Cygb组小鼠肝组织肝小叶结构完整，肝细胞索排列有序，汇管区及门管区胶原含量明显降低，纤维化程度轻，较接近正常组，如(图8d)。Masson三色染色结果同样表明TAT - Cygb可显著降低小鼠肝脏中的胶原含量，减轻肝纤维化程度。肝功能检测(ALT、AST):
[0093]谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)主要存在于肝细胞中，是检测肝损伤中较灵敏的指标，通过检测其含量可反映TAT - Cygb对肝细胞的治疗作用。
[0094]如(图9)，刚造模完的小鼠血清中ALT含量是正常组的3倍多，AST含量是正常组的2倍多，说明肝脏受到了很大的损伤，I个月后的模型组虽然恢复了很多，但其ALT含量仍显著高于正常组小鼠，说明造模较成功，而高剂量TAT -Cygb组小鼠血清ALT和AST含量均显著降低，与模型组相比有显著性差异，其中低剂量TAT-Cygb组小鼠血清ALT含量也显著低于模型组。
[0095]纤维化血清标志物检测(HA、LN、C -1I1、C -1V):
[0096]透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、C -1II胶原、C -1V均是肝细胞外基质(ECM)的主要成分，通过测其含量变化，可指示肝纤维化的程度。如(图10)，刚造模完的小鼠血清中HA、LN、C -1II和C -1V含量均明显高于正常组，I个月后的模型组含量降低，但仍与正常组相比具有显著性差异，其中高剂量TAT - Cygb组小鼠血清中的LN、C -1I1、C -1V含量显著低于模型组，低剂量TAT - Cygb组血清中C -1V显著低于模型组。
[0097]肝组织指标检测(S0D、MDA、Hyp):
[0098]在肝组织中，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的变化可指示机体内活性氧和其衍生物含量的高低。作为胶原纤维的亚氨基酸成分，Hyp可间接指示肝内的胶原纤维水平。如(图11)，刚造模完的小鼠和模型组因肝中的氧化应激导致SOD消耗增加，超氧化物歧化酶含量显著低于正常组(P〈0.05)，脂质过氧化反应的终产物MDA含量显著高于正常组(p〈0.01)，可促进激活肝星状细胞，并合成胶原；Hyp含量显著高于正常组(p〈0.01)，指示胶原纤维含量的增加。在高剂量TAT-Cygb作用下，SOD含量显著增加，MDA和Hyp含量显著降低，低剂量TAT-Cygb作用下，MDA含量与模型组相比也具有显著性差异(p〈0.05)。
[0099]利用CCI4致小鼠肝纤维化模型，通过观察小鼠的生长状态和肝组织外观、测定血清及组织中各项肝功能指标含量以及病理切片分析，研宄了 TAT-Cygb融合蛋白对肝纤维化的作用。从肝脏外观和病理切片上观察，治疗组肝脏恢复了血色和光泽，肝脏内胶原纤维含量明显减少，表明TAT-Cygb可促进CCI4诱导的小鼠肝纤维化逆转；在肝功能检测中，治疗组血清中ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常组，与模型组相比有显著差异；纤维化血清标志物检测中，HA、LN、C-1I1、C-1V等含量变化证明TAT-Cygb可减少肝细胞外基质(ECM)的含量；肝组织指标含量变化显示，TAT-Cygb治疗组可减轻超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢复正常水平，同时可降低脂质过氧化产物MDA的含量和胶原纤维的亚氨基成分Hyp。综上可知，通过尾静脉注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促进0:14导致的小鼠肝纤维化逆转。
【主权项】
1.重组融合Tat- Cygb人源细胞球蛋白在制备抗肝纤维化药物中的应用。
2.重组融合Tat-Cygb人源细胞球蛋白为活性成分组成的组合物在制备抗纤维化药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物医学技术领域，涉及重组融合Tat-Cygb蛋白的新用途，实验研究证明：所述Tat-Cygb可以治疗炎症、愈合创伤以及抗肝纤维化，促进肝纤维化的逆转，有望为临床提供重组融合Tat人源细胞球蛋白的新治疗手段。
【IPC分类】A61P1-16, A61P29-00, A61P17-02, A61K38-39
【公开号】CN104873958
【申请号】CN201510272105
【发明人】许瑞安, 李招发, 张如倩
【申请人】许瑞安
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2014年5月28日
【公告号】CN103990112A, CN103990112B