定眼球HE染色切片，用免疫组织化学染色法对巨噬细胞表面标志物⑶68和主要由巨噬细胞分泌的iNOS染色，光学显微镜下观察大鼠葡萄膜及视网膜组织结构。
[0067]视网膜视觉电生理检测:在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测。
[0068]流式细胞仪测定Thl、Thl7和Treg细胞:免疫后第15天处死大鼠，取大鼠眼部和引流淋巴结单个核细胞，用流式细胞仪检测Treg细胞、Thl细胞和Th 17细胞。
[0069](4)临床评分显示，第12-16天，exosome治疗组大鼠眼部临床评分明显低于对照组，差异有统计学意义。(t = 3.849、5.121、5.715、6.859、5.830，Ρ〈0.05)。(图 8)
[0070]视网膜组织病理学改变与临床表现变化一致，exosome治疗后视网膜炎细胞浸润和组织结构破坏明显减轻(图9)，各时间点(15天及21天)组织病理学评分均显著低于模型对照组，差异有统计学意义(图10)。(t = 4.544,6.708，Ρ〈0.05)。
[0071]免疫组织化学染色显示，造模后第15，21天，大鼠眼视网膜⑶68和iNOS阳性表达量均显著低于相应模型对照组(图11，图12)。
[0072]流式细胞仪检测结果显示，在炎性状态下，眼部CD4+T细胞浸润增多，与对照组相比，exosome治疗组可以减少⑶4+T细胞在眼部细胞的比例，差异有统计学意义(t =2.442，P〈0.05)，IFN-y+CD4+T 细胞、IL-17+CD4+T 细胞和 Foxp3+CD4+T 细胞下调(t =
5.559、4.846、4.276，Ρ〈0.05)(图 13)。
[0073]在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测，检测指标暗适应以及明适应3.0的a波和b波，治疗组振幅均明显高于对照组(图14)。
[0074]实施例4:hucMSC-exosome对小鼠视网膜脱离模型的疗效观察
[0075](I)模型建立:6?8周龄SPF级健康雌性C57BL/6小鼠(体重15?18g)经检查确认屈光间质清、眼底无异常后纳入实验。饲养方法遵照视觉与眼科学研究协会关于眼科和视觉研究饲养和使用动物标准。
[0076](2)治疗方法及分组:随机将小鼠分为正常组、治疗组和损伤对照组。正常组小鼠不做任何处理。治疗组与损伤对照组小鼠以500mg/kg剂量腹腔注射5%水合氯醛麻醉，右眼用复方托吡卡胺散瞳后，采用视网膜下注射玻璃酸钠造成人为视网膜脱离。规定网脱位置位于颞侧或颞上方，网脱面积约30% -40%，舍去不符合以上标准及有损伤出血的动物模型。损伤后，治疗组与损伤对照组小鼠右眼分别玻璃体腔内注射5 μ I (0.5mg/ml)hucMSC-exosome 及 5 μ I PBS0
[0077](3)评价方法:在造模后第1、3、7、14、28天，取治疗组和损伤对照组小鼠各6只放于暗室中过夜，分别于第二天，对其分别进行ERG检测。暗适应ERG:在暗室中微弱暗红光下，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，右眼用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，1%羧甲基纤维素钠滴眼液保护角膜。将小鼠俯卧放置于实验台上，银丝环形正电极置于右眼前接触角膜，针状负电极置于两眼之间的枕后皮下，针状接地电极置于小鼠尾部皮下。光刺激器提供闪光，参数如下:白光，闪光时间2.92ms，闪光强度3.0cd*s/m2，闪光间隔10s，重复测量5次。测量a波、b波振幅。
[0078]在造模后的第1、3、7、14和28天，随机选取正常组小鼠I只，治疗组和损伤对照组小鼠各10只，断颈法处死并摘取右侧眼球，10%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋。应用组织切片机经视乳头矢状径连续切3 μπι厚切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化染色。光镜下观察组织结构并拍照。
[0079](4)治疗组与损伤对照组小鼠ERG暗适应a波、b波振幅见图15。暗适应0.0la波振幅在5个时间点两组间均有统计学差异U1= 3.334，12= 3.814，13= 3.961，14 =
6.645，t5= 8.793，P值均〈0.05);暗适应0.0lb波振幅两组差异除第28天外，各个时间点均有统计学差异 U1= 5.131，12= 8.091，1 3= 4.335，t4= 2.213，p 值均〈0.05);暗适应
3.0a波振幅两组差异除第3天外，各个时间点均有统计学差异U1= 2.898，t 2= 2.665，t3=3.958，t4= 3.876，ρ〈0.05);暗适应3.0b波振幅两组间均有统计学意义(t 1= 7.953，t2= 4.976，1 3= 6.069，1 4= 2.639，1 5= 9.859，p 值均〈0.05)。
[0080]网脱损伤后第I天，光学显微镜下观察视网膜病理切片，可见视网膜全层组织无明显变化，RPE层显著脱离，神经上皮层轻度水肿，组织紊乱程度损伤对照组与治疗组无明显差别(图16A、16B)。第3天可见网脱处外核层水肿明显，也可见炎症区域内少量炎症细胞浸润，损伤对照组较治疗组水肿程度更加明显(图16C、16D)。第7天可见外核层细胞水肿减轻，但内核层细胞数量及层数明显变少，神经节细胞层水肿减轻，外核层及内核层细胞排列对照组较治疗组更加紊乱(图16E、16F)。第14天可见治疗组RPE重新贴附于神经上皮层，炎症反应几乎消失，组织形态趋于稳定(图16G、16H)。第28天可见对照组外核层内核层细胞排列紊乱，治疗组各层细胞排列较为整齐，轻度水肿(图161、16J)。
[0081]免疫组织化学染色显示，造模网脱后第7，14天，治疗组大鼠眼视网膜GFAP阳性表达量均显著低于模型对照组。(图17)
[0082]上述利用本发明所述的人脐带间充质干细胞来源的exosome作为药物局部注射小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型的实验证明，exosome具有神经营养以及免疫抑制作用，能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应，从而改善视网膜功能，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
【主权项】
1.间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胎盘来源的间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞或人胎盘来源的间充质干细胞。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。5.根据权利要求1-4所述的用途。其特征在于:所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
【专利摘要】本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体的用途，具体为：间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。实验证明，exosome具有神经营养以及免疫抑制作用，能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应，从而改善视网膜功能，为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
【IPC分类】A61P27/02, A61K35/28
【公开号】CN105267240
【申请号】CN201410781765
【发明人】张晓敏, 李筱荣, 苏畅
【申请人】天津医科大学眼科医院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年12月16日