间点miR-18a-5p的表达丰度值（Ct)，用 miR-18a-5p的表达丰度值减去18sRNA的表达丰度值得到标准化的表达丰度值（ACt)，之 后使用GraphPad Prism统计制图软件绘制荧光实时定量PCR检测不同分化时间破骨细胞 miR-18a-5p表达图（图2)，结果显示与图1 一致，再次说明miR-18a-5p在破骨细胞分化中 表达明显上调。
[0039] 2、miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂对破骨细胞分化的影响
[0040] 首先用miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂进行细胞转染实验，两者均由 Ambion 公司（Thermo Scientific)合成，序列如下：
[0041] miR-18a_5p 模拟物：5' -caaagugcuuacagugcagguag-3'，（SEQ ID NO. 1);
[0042] miR-18a_5p 抑制剂：5' -uaaggugcaucuagugcagauag-3'（SEQ ID Ν0· 2) 〇
[0043] 实验步骤如下：
[0044] 转染前24小时，将适量RAW264. 7细胞接种于T25培养瓶或6孔、24孔、96孔培养 板中，贴壁细胞在长满底面积70%时进行转染。转染时，将miR-18a (5ng/ml)溶于无血清培 养液，同时将Lipofectamine 2000分散于等体积无血清培养液，并轻轻震摇5分钟，两液相 混，放置20分钟。吸去细胞原培养液，换新鲜培养液（含或不含10%小牛血清），将转染液 缓缓加至培养液中，37°C孵箱转染6-8小时。最后弃去转染液，加入完全培养液继续培养。
[0045] 将转染后细胞以1X 103个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，分别以 终浓度50ng/mL的RANKL和M-CSF破骨诱导培养72h后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP) 染色，染色步骤为：弃置培养基后用PBS清洗3次，每次3min，然后用质量分数为4%的多聚 甲醛固定20min，再用PBS清洗3次，每次3min，接着用抗酒石酸酸性磷酸酶染液（0. lmg/ml of naphthol AS-MX phosphate，0.3mg/ml of Fast Red Violet LB 复染）避光染色 lh，弃置 染液，PBS漂洗3次后每孔加入100 μ L PBS观察，结果如图3所示，根据细胞核统计TRAP阳 性细胞数，其中A图为TRAP染色结果，B图为各组相对TRAP强度。由图3中A图可见，光镜 下TRAP阳性细胞被染成紫红色，同时，由B图可知，miR-18a_5p模拟物转染（pre-miR-18a 组）明显增加了相对TRAP强度，而miR-18a-5p抑制剂转染（anti-miR-18a组）则明显降 低了相对TRAP强度，这说明miR-18a-5p能够促进破骨细胞分化，而转染miR-18a-5p抑制 剂后能够抑制破骨细胞分化。
[0046] 3、破骨分化相关基因检测
[0047] 将miR-18a_5p模拟物（pre组）、miR-18a_5p抑制剂（anti组）和其各自的对照 NC (对照是无影响的碱基片段）转染入小鼠原代骨髓单核细胞后，分别以终浓度50ng/mL的 RANKL和M-CSF诱导破骨分化72h，收取细胞，提取细胞总RNA，按常规操作流程反转录合成 cDNA，设计并合成针对成骨细胞特异基因 Ctsk等的Real-time PCR引物，通过荧光实时定 量PCR检测破骨分化相关基因的表达丰度，每组做独立实验5复孔，并以GAPDH为内参。 [0048] 破骨细胞特异基因各自引物序列如下：
[0049] Ctsk 正向引物：5' -gcggcattaccaacat-3'（SEQ ID N0. 3);
[0050] Ctsk 反向引物：5,-ctggaagcaccaacga-3，（SEQ ID NO. 4);
[0051] TRAP 正向引物：5'-ttgcacattcagtgtttttgg-3'（SEQ ID NO. 5);
[0052] TRAP 反向引物：5,-tgcaagtgtcgtgccaag-3，（SEQ ID NO. 6);
[0053] c-fos 正向引物：5' -aggcagaaccctttga-3'（SEQ ID NO. 7);
[0054] c-fos 反向引物：5' -ggtgaccacgggagta-3'（SEQ ID NO. 8);
[0055] Nfkb2 正向引物：5'-agcctcagggccttacaga-3'（SEQ ID NO. 9);
[0056] Nfkb2 反向引物：5'-ccgtacaatgctcagatcca-3'（SEQ ID NO. 10);
[0057] NFATcl 正向引物：5,-gaggagttggctcagtg-3，（SEQ ID NO. 11);
[0058] NFATcl 反向引物：5'-tagcgttccgttcgtt-3'（SEQ ID NO. 12);
[0059] DC-STAMP 正向引物：5,-gacagagtacgtagccacacgtt-3，（SEQ ID NO. I3);
[0060] DC-STAMP 反向引物：5,-agcccacagaccaaatatcaa-3，（SEQ ID NO. 14) 〇
[0061] 内参具体引物为：
[0062] GAPDH 正向引物：5'-agatggagatttct-3'（SEQ ID Ν0· 15);
[0063] GAPDH 反向引物：5'-cttgcttagtttcttgtctggtg t_3'（SEQ ID NO. 16)。
[0064] 检测结果表明，miR-18a_5p抑制剂能显著抑制破骨细胞分化相关基因的表达，说 明miR-18a-5p抑制剂能抑制破骨细胞的分化和成熟（图4)。
[0065] 4、双荧光报告基因系统检测miR-18a_5p靶基因
[0066] 使用Targetscan对miR-18a_5p的潜在革E基因进行预测，筛选得到LXR-beta作为 下一步验证实验的候选基因。
[0067] 将RAW264. 7细胞以5 X 104个/孔的密度接种于48孔板，每个处理准备3个复孔， 细胞贴壁后进行瞬时转染，方法按试剂说明进行。以终浓度均为50ng/mL的RANKL和M-CSF 破骨诱导后，利用Promega公司PGL-3双荧光报告系统检测靶基因。将含有靶基因3'UTR的 报告基因质粒转染细胞，每孔分别转染1 μ 1 RNA，0. 05 μ g的报告基因质粒和0. 05 μ g内参 (pTKRL)质粒。转染24小时后吸弃每孔培养液，PBS洗涤1次，加入50 μ L Passive Lysis Buffer，室温裂解20min。分别收集每孔细胞样品。12, OOOrpm离心10分钟，TD 20/20照度计 检测报告基因相对活性。比较不同报告基因间的相对活性差别，结果见图5,含有LXR-beta 3' UTR的报告基因与miR-18a-5p共转染后其报告荧光测量值显著下降，表明LXR-beta是 miR-18a-5p的靶基因。
[0068] 5、Western blot蛋白水平检测miR-18a_5p革巴基因
[0069] 将转染了 miR-18a_5p模拟物及对照NC 48h的细胞消化收集，对细胞样品SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜15_30min之后，在100V电压下 转移3h至硝酸纤维素膜上，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸，用TBST (lOmM Tris · HC1 pH 7. 5,150mM NaCl)轻轻摇动洗涤5min，清洗两次，将硝酸纤维素膜浸在封闭液中，4°C过夜或 在37°C下缓慢摇动封闭lh，将硝酸纤维素膜室温下浸在TBST缓冲液中，洗膜5minX2次， 加入封闭液稀释的小鼠抗LXR-beta -抗，4°C过夜或室温下放置2h后TBST洗膜5minX3 次，加入封闭液稀释的抗小鼠二抗，室温下放置lh后TBST洗膜5minX 3次，ECL化学发光 试剂显色，显现目的条带后及时以X光片曝光、显影。Western blot检测结果见图6,结果 显不，转染miR_18a_5p模拟物后，LXR-beta蛋白表达水平显著下降。
[0070] 上述研究表明miR-18a_5p能够通过抑制破骨细胞分化相关的重要转录因子 LXR-beta基因，促进破骨细胞的分化，导致骨丢失和骨质疏松。miR-18a-5p的抑制剂能下 调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对破骨细胞的促进作用、抑制骨丢失，因而可将 miR-18a-5p抑制剂用于制备促进骨生成、抗骨质丢失、抗骨质疏松制剂。
[0071] 需要说明的是，本发明所述miR-18a_5p抑制剂可以为质粒或腺病毒、慢病毒、噬 菌体等转化体，只要其包含SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列片段即在本发明保护范围内。
[0072] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。2.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特 征在于，miR-18a_5p抑制剂通过下调miR-18a_5p的表达，解除miR-18a_5p对LXR-β基因 表达的抑制，进而实现防治骨质疏松的目的。3.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特 征在于，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。4.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特 征在于，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。5.根据权利要求4所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特 征在于，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。 6. miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用。7.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在 于，所述miR_18a_5p抑制剂通过下调miR-18a_5p的表达，解除miR-18a_5p对LXR-β基因 表达的抑制，进而抑制破骨细胞分化。8.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在 于，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。9.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在 于，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。10.根据权利要求9所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征 在于，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。
【专利摘要】本发明公开了一种miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，所述miR-18a-5p抑制剂的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，达到抑制破骨细胞分化的目的，进而实现骨质疏松的防治，因此，本发明为防治骨质疏松提供了新的研究方向。
【IPC分类】A61K48/00, A61P19/10, A61K31/7105
【公开号】CN105288658
【申请号】CN201510726573
【发明人】窦策, 许建中, 董世武
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月30日