功 能脂质体，核酸类药物制剂在N/P为即寸，已经可W完全负载SiPLKl;见图4. 实施例6 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性 良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用正常神经胶质细胞模 型，考察了不同脂质体浓度条件下的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的细胞毒性。 将胶质细胞Wl X IO4的密度接种于96孔板中，培养24 h。之后用含有不同脂质体浓度及含 有10% FBS的培养基换液，培养24 h。每孔加入10化的CCK8于培养基中，在37 °C条件下解 育4 h。采用酶联免疫检测仪在波长为450 nm条件下测定光度值，W未处理细胞为参照，计 算细胞存活率。实验结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物SiPLKl的具缺氧响应能力 和放疗增敏功能脂质体，在脂质体浓度^ 0.36 mg/mL情况下，细胞存活均大于95%，说明该 脂质体制剂具有很好的生物相容性，见图5。
[0027] 实施例7 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因转染效率 为了考察本发明核酸类药物制剂的基因转染效果，本实验W脑胶质瘤C6细胞为模型， 考察WN/P为5包封SiPLKl的制剂(实施例1所述)的基因转染效率。细胞培养到细胞密度达 到60%~80%时，将核酸类药物制剂加入培养基中，在37 °C条件下培养24 h，换上新鲜培养基 继续培养24 h。结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物SiPLKl的具缺氧响应能力和放 疗增敏功能脂质体(即实验组脂质体），可W有效下调PLKl mRNA的基因表达，见图6。
[002引 实施例8 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的下调蛋白能力检测 为了考察本发明核酸药物直接的蛋白下调作用，本实验W脑胶质瘤C6细胞为模型，考 察WN/P为5包封SiPLKl的制剂(实施例1所述)的蛋白下调效率。培养C6到密度为70~80%时， 将该核酸类药物制剂加入到培养基中，37 °C下培养24 h，之后更换新鲜培养基，继续培养 24 h，提取蛋白，进行WB实验。本发明所述的具有缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸 类药物制剂(即实验组脂质体），可W有效下调PLKl蛋白的表达;见图7。
[0029] 实施例9 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备 所选用核酸药物为：Dbait,其序列，见图8;(核酸药物文献来源= Small-Molecule Drugs Mimicking DNA Damage: A New Strategy for Sensitizing Tumors to Radiotherapy. Clinical (Mincer Research. 2009, 15: 1308-1316)。
[0030] 所选用具放疗增敏功能的脂质分子为： 将具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇憐脂和DOPC脂质分子各组分，分别溶 解于乙醇溶剂中，使其各组分浓度为20 yg/yL，摇匀，溶解过夜备用;抽取各组分脂质体，具 放疗增敏功能的脂质分子(100 yL=2000 yg)，胆固醇(20 yL=400 yg)，聚乙二醇憐脂DS阳-阳G2000(18化=360 yg)和DOPC脂质分子(9 yL=180 yg);充分混匀，并将混合液转移到一 次性1 mL医用注射器中，将注射器中的混合液，在37°C条件下，缓慢(0.5~2滴/秒)滴入巧樣 酸缓冲液中，边滴边用磁力揽拌器混匀，脂质体在巧樣酸中的浓度为3 mg/mL之后取出一 定量脂质体溶液，根据不同N/P加入核酸药物化ait(例如N/P为5时，22.5 yg脂质体加入Iyg 化ait,依此类推），在60°C的溫度下水浴加热，水浴加热5 min,制得包载核酸药物化ait的 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
[0031 ]的作用 放射治疗时放射线会破坏肿瘤细胞的DNA，DNA损伤将诱发细胞自我修复程序，募集DNA 损伤修复因子，修复损伤的DNA序列。而化ait也具有募集DNA损伤修复因子的作用，并且其 募集作用比肿瘤自身损伤DNA的募集作用要强，因此在肿瘤细胞DNA修复过程中化ait可W 竞争修复因子，导致肿瘤细胞DNA修复能力下降，从而起到抑制肿瘤细胞修复引起肿瘤细胞 调亡的作用化ait的基因序列。
[0032] 实施例10 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力的研究 具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例采用琼脂糖凝胶 电泳实验考察本发明所述的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基 因复合能力。
[0033] 称取0.8 g的琼脂糖溶于40 ml IXTAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完 全溶解，冷却，加入5 iiL的核酸染料漠化乙锭于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自 然凝固。将不同N/P的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体/Dbait复合物与2化的 Loading Buffer的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为110 V进行电泳实验，常 溫下电泳10 min。实验结果表明，本发明实施例9制得的包载核酸药物化ait的具缺氧响应 能力和放疗增敏功能脂质体在N/P为即寸已经可W完全包封化ait,见图9。
[0034] 实施例11 马尔文粒度仪检测制备脂质体的粒径 将实施例9制得的包载核酸药物化ait的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体(脂质 体浓度3 mg/mL)加入马尔文粒度检测仪专用比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，检测 结果显示，所合成的脂质体水力学直径130 nm左右。
[003引 实施例12 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体负载化ait放疗作用下对胶质瘤细胞的抑制作 用 为了考察本发明实施例9制得的包载核酸药物化ait的具缺氧响应能力和放疗增敏功 能脂质体(即实验组脂质体)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用，本实验W脑胶质瘤C6细胞为模 型，进行细胞集落实验。CO为空白对照组，其他组别均进行加药并在加药后进行2 Gy剂量的 放疗，结果显示脂质体包载化ait并进行放疗的胶质瘤细胞增殖抑制效果最明显，见图10。 [0036] W上是两种药物治疗胶质瘤的研究 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征W及方法，但本发明并 不局限于上述详细特征W及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征W及方法才能 实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等 效替换W及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之 内。
【主权项】
1. 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，其特征在于：它包括 脂质体和核酸药物;所述的脂质体中各原料及其质量百分比为:具放疗增敏功能的脂质分 子20~80%;胆固醇5~50%;聚乙二醇憐脂3~50%; DOPC脂质分子^30〇/〇; 所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1: (1~20); 所述的具放疗增敏功能的脂质分子，具有如下结构通式：式(?.); 其中： η为10-26之间的任意数;η进一步优化为10-18之间任意数；所述的基团X中:X1为，亚甲基或不存在； X2为亚甲基或1,2-亚乙基； 当XI为-时，X3，X4和X5均为甲基； 当XI为时，X3和X4为氨，甲基，乙基或异下基;X5不存在； 基团R为：-所述的基团R中：R1为氨或甲基，其甲基上还可连一面素氯； R2为亚甲基或1,2-亚乙基； 当R3为硝基时;R4为氨，甲基或无基团； 当R4为硝基时;R3为氨或甲基。2. 根据权利要求1所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质 体，其特征在于： 所述的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：3. 根据权利要求1所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质 体，其特征在于：所述的聚乙二醇憐脂为DSPE-PEG1000，DSPE-PEG2000，DSPE-PEG：3400， DS阳-PEG5000。4. 根据权利要求1所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质 体，其特征在于：所述核酸药物为RNA，DNA，反义核酸，质粒，干扰核酸，适体，antagomir， miRNA，核酶及S iRNA中的一种或两种W上的混合物。5. 根据权利要求1或4所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂 质体，其特征在于:所述核酸药物为具有肿瘤增殖抑制作用的siPLKl，具有放疗增敏作用的 Dt)ait D6. -种如权利要求1所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质 体的制备方法，其特征在于:按如下方法制备： 按配比称量原料具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇憐脂和D0PC脂质分子， 并溶解于有机溶剂中，通过乙醇注入法或油膜法，制成脂质体； 将脂质体边揽拌边加入到抑=2~5的巧樣酸缓冲溶液，脂质体在巧樣酸中的浓度为0.5~ 10 mg/mL，再向巧樣酸缓冲溶液中加入称量好的核酸药物，在37~70°C的溫度下水浴加热， 水浴加热2~lOmin，制得包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。7. 根据权利要求6所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体 的制备方法，其特征在于:所述的有机溶剂为分析纯乙醇。8. 根据权利要求6所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体 的制备方法，其特征在于:所述的包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体 的粒径为纳米级或微米级。9. 如权利要求1所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体应 用于治疗由基因异常表达引起的相关疾病药物中。
【专利摘要】本发明公开了一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，它包括脂质体和核酸药物；所述的脂质体中各原料及其质量百分比为：具放疗增敏功能的脂质分子20~80%；胆固醇5~50%；聚乙二醇磷脂3~50%；DOPC脂质分子1~30%；所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1：（1~20）；本发明制备的脂质体克服了阳离子脂质体毒性高、血液稳定性差和转染效率低的缺点，有效地提高了核酸类药物的药效，同时由于该脂质体在缺氧环境下具有较强的内涵体逃逸能力，因此在转染基因药物方面具有显著优势。本发明的脂质体适于包裹各种核酸类药物，并且适用剂型范围广。
【IPC分类】A61K47/22, A61K48/00, A61K47/24, A61K9/127, A61P7/04, A61P35/00, A61K31/7088
【公开号】CN105534908
【申请号】CN201610026007
【发明人】刘洪梅, 于如同, 李冠华, 张亚飞, 蔡一帆, 周秀萍, 解彦东, 李白杨
【申请人】徐州医学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月15日