一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，属于药 物制剂学领域。
【背景技术】
[0002] 脂质体（liposomes)是一种由排列有序的脂质双分子层组成的单层或多层微囊。 脂质体属于胶体系统，具有类似细胞的结构，与细胞膜亲和力强，可W增加被包封药物透过 细胞膜的能力。脂质体生物相容性好，可实现药物体内祀向递送，具有延长药物作用时间、 增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性，增强药理作用等诸多优点。
[0003] 目前关于脂质体的研究较多，并已取得许多进展。作为核酸类药物载体的脂质体， 多数为阳离子脂质体，该脂质体的正电荷表面虽然利于携带核酸类药物，但是却不利于载 体的体内循环，同时，阳离子浓度越高其毒副作用越大，限制了其体内使用的剂量，因此目 前所研究的阳离子脂质体递送核酸药物仍不能满足临床需求。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种包载核酸药物的具缺氧响应能 力和放疗增敏功能脂质体;该脂质体的亲水头部为可质子化的叔胺基团或憐酸基团，若为 憐酸基团需通过辅助脂质分子引入叔胺基团，使其在正常生理抑(7.35~7.45)条件下呈电 中性，利于体内长循环，而在肿瘤微酸的环境下，可发生质子化，利于脂质体进入肿瘤细胞； 该脂质体的疏水末端连接有缺氧响应的硝基咪挫基团，其在缺氧的环境下疏水的硝基转变 为亲水的氨基，破坏了脂质体的稳定性的同时加大了脂质体的电荷，利于脂质体从内涵中 逃逸出来，提高核酸类药物的疗效；同时引入的硝基咪挫基团在缺氧条件下具有放疗增敏 的作用，提高放射治疗抑制肿瘤生长的作用。
[000引经过多次试验，为提高载药脂质体制备效率，本发明采用了 W下的技术方案： 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体，它包括脂质体和核酸药 物;所述的脂质体中各原料及其质量百分比为:具放疗增敏功能的脂质分子20~80%;胆固醇 5~50%;聚乙二醇憐脂3~50%; DOPC脂质分子^300/0; 所述的脂质体与核酸药物中核酸的N/P为1: (1~20); 所述的具放疗增敏功能的脂质分子，具有如下结构通式：
其中： n为10-26之间的任意数;n进一步优化为10-18之间任意数； 基团X为：
所述的基团X中：X1为
，亚甲基或不存在； X2为亚甲基或1,2-亚乙基；
当Xl为 ，X3，X4和X5均为甲基； 当Xl为 时，X3和X4为氨，甲基，乙基或异下基;X5不存在； 基团R为:
所述的基团R中：Rl为氨或甲基，其甲基上还可连一面素氯； R2为亚甲基或1,2-亚乙基； 当R3为硝基时;R4为氨，甲基或无基团； 当R4为硝基时;R3为氨或甲基。
[0006] 所述的具放疗增敏功能的脂质分子，其结构式为：
[0007] 所述的聚乙二醇憐脂为 DSPE-PEGlOOOtDSPE-PEGSOOChDSPE-PEGSAOChDSPE-reGSOOO。
[000引所述核酸药物为RNA，DNA，反义核酸，质粒，干扰核酸，适体，antagomir，miRNA，核 酶及S iRNA中的一种或两种W上的混合物。
[0009] 所述核酸药物为具有肿瘤增殖抑制作用的SiPLKl，具有放疗增敏作用的化ait。
[0010] 所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备方法， 按如下方法制备： 按配比称量原料具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇憐脂和DOPC脂质分子， 并溶解于有机溶剂中，通过乙醇注入法或油膜法，制成脂质体； 将脂质体边揽拌边加入到抑=2~5的巧樣酸缓冲溶液，脂质体在巧樣酸中的浓度为0.5~ 10 mg/mL，再向巧樣酸缓冲溶液中加入称量好的核酸药物，在37~70°C的溫度下水浴加热， 水浴加热2~IOmin，制得包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
[0011] 所述的有机溶剂为分析纯乙醇。
[0012] 所述的包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的粒径为纳米级 或微米级。
[0013] 所述的一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体应用于治疗 由基因异常表达引起的相关疾病药物中；所述疾病包括遗传病，例如血友病、囊性纤维病和 家庭型高胆固醇血症;恶性肿瘤，例如脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、结肠癌、食管 癌、胃癌、大肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、血癌和骨癌。
[0014] 本发明的有益效果： 1、 本发明的脂质体的亲水头部为可质子化的叔胺基团，该脂质体在正常生理pH 口.35~ 7.45)条件下呈电中性，利于体内长循环，而在肿瘤微酸的环境下，可发生质子化，利于脂质 体进入肿瘤细胞； 2、 本发明的脂质体的疏水末端连接有缺氧响应的硝基咪挫基团，其在缺氧的环境下疏 水的硝基转变为亲水的氨基，破坏了脂质体的稳定性的同时加大了脂质体的电荷，利于脂 质体从内涵中逃逸出来，提高核酸类药物的疗效； 3、 本发明的脂质体由于硝基咪挫基团的引入，使其在缺氧条件下具有放疗增敏的作 用，提高放射治疗抑制肿瘤生长的作用。
[0015] 4、本发明包含的辅助脂PEG可W有效延长脂质体在体内的有效循环时间，从而延 长药物作用时间;胆固醇具有膜稳定性，增强了脂质体的体内循环稳定性。
[0016] 5、本发明质子化脂质体，稳定性高，适用剂型广泛，可W进一步加工，形成口服、黏 膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。
[0017] 6、本发明采用乙醇滴入法，方法简便，操作简单，而且效率高，易于普及。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的电镜形貌表征； 图2为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的粒径表征； 图3为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的表面电位表征； 图4为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的琼脂糖凝胶电泳结果； 图5为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的CCK8细胞毒性实验结 果； 图6为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的q-PCR结果； 图7为本发明实施例1所制备包载核酸类药物SiPLKl的脂质体的WB结果； 图8为本发明实施例9所制备包载核酸类药物化ait的脂质体的琼脂糖凝胶电泳结果； 图9本发明实施例9所制备包载核酸类药物化ait的脂质体的电镜形貌表征； 图10为本发明实施例9所制备包载酸类药物化ait的脂质体的细胞集落实验结果。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 实施例1 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的制备 所选用核酸药物SiPLKl为特殊降解PLKl; Si化Kl序列为:AGATCACTCTCCTCAACTATT;(核酸药物文献来源：InMbition Of 化Io-Iike kinase 1 reduces beta-amyloid-induced neuronal cell death in Alzheimer's disease. Bing Song, Korbin Davis, X. Shawn Liu, Hyoung-gon Lee, Mark Smith, and Xiaoqi Liu. AGING. 2011, 3: 846-851)〇
[0021] 所选用具放疗增敏功能的脂质分子为：
将具放疗增敏功能的脂质分子，胆固醇，聚乙二醇憐脂和DOPC脂质分子各组分，分别溶 解于乙醇溶剂中，使其各组分浓度为20 yg/yL，摇匀，溶解过夜备用;抽取各组分脂质体，具 放疗增敏功能的脂质分子（100 yL= 2000 yg)，胆固醇（20 yL= 400 yg)，聚乙二醇憐脂 DS阳-PEG2000(18 yL=360 yg)和DOPC脂质分子(9化=180 yg);充分混匀，并将混合液转移 到一次性1 mL医用注射器中，将注射器中的混合液，在37°C条件下，缓慢(0.5~2滴/秒)滴入 巧樣酸缓冲液中，边滴边用磁力揽拌器混匀，脂质体在巧樣酸中的浓度为3 mg/mL之后取 出一定量脂质体溶液，根据不同N/P加入核酸药物SiPLKl(例如N/P为5时，22.5 yg脂质体加 入1 yg SiPLKl，依此类推），在60°C的溫度下水浴加热，水浴加热5 min,制得包载核酸药物 SiPLKl的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体。
[0022] 实施例2 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体形貌的表征 用透射电镜检测具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体的形貌，将实施例1制得包载 核酸药物SiPLKl的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体沾到铜网上，用滤纸吸掉多余液 体，惊干铜网上的液体后，用透射电镜进行拍摄。结果显示，合成的脂质体是具有明显的双 分子层结构，粒径在100 nm左右，见图1。
[0023] 实施例3 粒度仪下质子化脂质体的粒径 将实施例1制得包载核酸药物SiPLKl的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体(3 mg/ mL)加入马尔文粒度检测仪专用比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，检测结果显示，所 合成的脂质体水力学直径130 nm左右，见图2。
[0024] 实施例4 粒度仪下质子化脂质体的电位 将实施例1制得包载核酸药物SiPLKl的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体加入马 尔文粒度检测仪专用带电极比色皿中，打开检测程序进行粒径检测，所检测的脂质体浓度 为3 mg/mL，并经过PBS透析，检测结果显示，所合成的脂质体电位呈电中性，见图3。
[002引 实施例5 具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因复合能力的研究 具有强的基因复合能力是核酸类药物制剂成功的关键因素，本实施例采用凝胶渗透电 泳实验考察本发明所述的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体核酸类药物制剂的基因 复合能力。
[0026] 称取0.8 g的琼脂糖溶于40 ml IXTAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完 全溶解，冷却，加入5 iiL的核酸染料漠化乙锭于冷却的琼脂糖凝胶中，凝胶加入凝胶槽，自 然凝固。将不同N/P的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体/siRNA复合物(例如N/P为5 时，22.5 yg脂质体加入Iyg SiPLKl，依此类推）（实施例1所述)与2化的Loading Buffer的 混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为110 V进行电泳实验，常溫下电泳10 min， 实验结果表明，本发明实施例1制得包载核酸药物Si化Kl的具缺氧响应能力和放疗增敏