有的DNA。
[0124] 本发明多肽的获得是通过研究DPP-4活性孔穴(active hole)周围的氨基酸序列。 因此，本发明抗体识别DPP-4、抑制其功能(GLP-1降解）、并预期显示出胰岛素分泌促进作 用。因此可预防和治疗糖尿病。
[0125] 只要可提供上述效应，本发明预防或治疗剂中上述抗体的量没有特别限制。其通 常为本发明预防或治疗剂整体的0.001-90重量％，优选0.005-50重量％，更优选0.01-10重 量％。
[0126] 除了作为活性成分的上述抗体以外，本发明预防或治疗剂还可包含药学上可接受 的载体。作为此载体，可使用药物领域通常使用的载体。其实例包括但不限于，赋性剂如蔗 糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、磷酸钙、碳酸钙等，防腐剂如苯甲酸钠、亚硫酸氢 钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等，稳定剂如柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸等，助悬剂如甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等，分散剂如表面活性剂等，稀释剂如水、盐水等，底蜡如甘油、 聚乙二醇等。
[0127] 本发明预防或治疗剂的给药剂型的实例包括但不限于液体、注射制剂等。本发明 预防或治疗剂的剂型可为控释制剂如立即释放制剂、持续释放制剂等。因为抗体通常在水 性溶剂中可溶，所以其在任意上述剂型中易于被吸收。还可通过本身已知的方法进一步增 加抗体的溶解性。
[0128] 可根据本身已知为制剂生产方法的手段使用上述抗体作为活性成分生产可用于 预防、治疗或缓解糖尿病的本发明预防或治疗剂。
[0129] 例如，优选用于系统给药的本发明预防或治疗剂的生产可通过将有效量的本发明 抗体溶于水性或非水性等渗无菌注射剂(例如，注射制剂）中。其生产可通过冷冻干燥本发 明抗体(例如，冻干制剂)并将其同样溶于水性或非水性等渗无菌稀释溶液中。优选用于局 部给药的本发明预防或治疗剂的生产可通过将本发明抗体溶于稀释溶液如水和盐水（例 如，液体）中。还可通过使用喷雾器将所述液体用于吸入治疗入支气管、肺等。这些试剂可包 含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、等渗剂等。本发明的这些预防或治疗剂可密封在单位剂量或 多剂量容器如安飯或小瓶中。
[0130] 虽然本发明预防或治疗剂的剂量可根据作为活性成分包含的抗体的活性、种类或 用量、给药对象、给药途径、给药对象年龄和体重等而适当确定，但以抗体量计的成人(体重 60kg)每日剂量(有效量）例如为0 · lmg-1 OOOmg，优选0 · lmg-500mg，更优选0 · lmg-300mg。本 发明预防或治疗剂可按照需要以每天一份或若干份的形式给药，且还可在若干天内给药。 [0131]本发明预防或治疗剂可与已知的糖尿病预防或治疗剂组合使用。此类已知的糖尿 病预防或治疗剂的实例包括DPP-4抑制剂如西格列汀、维格列汀、阿格列汀、利格列汀、特力 利汀、阿拉格列汀等，抗糖尿病药物如胰岛素、甲苯磺丁脲、格列吡脲、格列本脲、二甲双胍、 依帕司他、伏格列波糖、阿卡波糖、曲格列酮等，等等。仅有一种可用于组合，或其多种可用 于组合。在本说明书中，"组合使用"是指本发明预防或治疗剂和已知的糖尿病预防或治疗 剂组合使用，且其使用形式没有特别限制。例如，其包括给药包含本发明预防或治疗剂和已 知的糖尿病预防或治疗剂的药物组合物，或未经混合单独配制、同时或以交错方式给药两 者。
[0132] 实施例
[0133] 以下通过参考实施例更详细地解释本发明。无需多言，本发明不受其限制。
[0134] 疫苗设计和合成
[0135] 为产生中和抗体，设计了DPP-4的N末端序列中的一部分(E1;SEQ ID N0:5)以及在 DPP-4活性孔穴周围的两个序列(E2;SEQ ID N0:6、E3;SEQ ID N0:4)。将可存在增加免疫原 性所需的各种T细胞表位并有助于破坏针对作为疫苗的肽序列的耐受性的钥孔戚血蓝素 (KLH)(Wako Pure Chemical Industries)接合至3个候选肽的Ν末端。获得高质量合成肽(> 98%纯度），并通过反相HPLC(Peptide Institute有限公司）进行纯化。
[0136] 动物研究和免疫
[0137] 购买八周龄雄性C57/BL6J小鼠和六周龄雄性db/db小鼠 （Oriental Yeast公司）并 将其喂养在自由摄食水和食物的温度和光照循环控制装置中。在高脂膳食小鼠模型中，8周 龄〇57/81^61小鼠喂食高脂膳食(冊060 :18.2%蛋白、62.2%脂肪和19.6%碳水化合物， Oriental Yeast公司）。免疫前将肽溶液与等体积弗氏佐剂(CFA/IFA，Wako Pure Chemical Industries)混合。小鼠组(n = 6)在第0、14、28、84和119天皮下注射2yg或20yg的候选多肽。 小鼠对照组皮下注射与等体积弗氏佐剂混合的等质量的KLH。从尾静脉采集血清，每次增强 后通过ELISA测定针对免疫肽的抗体滴度。
[0138] ELISA
[0139]用5mg/ml的各候选肽涂覆ELISA板，4°C过夜，所述候选肽已接合至载体蛋白质即 牛血清白蛋白（BSA Peptide Institute有限公司）。使用包含3%脱脂牛奶的roS封闭所有 孔。采用封闭缓冲液经100至325000倍范围稀释血清。培养所述板和血清(4°C过夜）后并在 洗涤后，在室温下采用小鼠 IgG特异性辣根过氧化物酶(HRP)接合抗体(GE Hea 1 thcare)培 养板3小时。在IgG亚类测定试验中，使用抗小鼠 Ig亚类-特异性HRP接合抗体(IgGl、IgG2b和 IgG2c)。洗涤后，将过氧化物酶显色底物3，3 ' -5，5 ' -四甲基联苯胺(TMB; Sigma)加入ELISA 板孔中以发展反应。使用酶标仪(Bio-Rad有限公司）在450nm分析所有板。通过各样本稀释 范围内的最高0D450值测定半数最大抗体滴度。
[0140] DPP-4 试验
[0141] 在第28天、42天和56天膳食负荷的15min后评估血浆中的DPP-4活性。为评估DPP-4 活性，将5μ1血清与DPP-4-GloTM试剂溶液(DPP_4Glo蛋白酶测定;Promega，Madison，WI)和 测定缓冲液（l〇〇mM HEPES，pH 7.6，0. lmg/ml牛血清白蛋白）混合，总容积为60μ1。为评估抗 DPP-4抗体的中和活性，采用重组DPP-4 (R&D Systems有限公司）在4 °C培养1μ 1血清1小时， 然后加入如上所述的DPP-4-GloTM试剂溶液。使用SpectraFluor每1分钟记录所释发光30分 钟。数据表示为如下计算的％抑制：
[0142] %抑制= 100(l-(Vi/Vc))，其中Vi是免疫样本的反应速率且Vc是对照样本的反应 速率。在血浆DPP-4抗原测量中，根据小鼠 DPP-4ELISA试剂盒所附方法在ELISA板（R&D Systems有限公司）中培养血清，并在酶标仪(Bio-Rad有限公司）上读数。
[0143] 蛋白印迹(Western blot)试验
[0144] 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组DPP-4和BSA-DPP-4接合物进行 电泳分离并印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜上。用血清和商业抗DPP-4抗体(CD26(T-19): sc-7044，Santa Cruz Biotechnology有限公司）分别培养转印的膜。小鼠 IgG特异性HRP接 合抗体培养后，将转印的膜可视化并定量电化学发光信号。
[0145] 膳食耐量试验和血浆参数
[0146] 将小鼠禁食过夜，以2g CH0/kg剂量口服给予膳食（14%蛋白质、脂肪31.5%、CH0 54.5 % Ensure Η，Me i j i，东京，日本）溶液。在各指定时间点测量血浆胰岛素浓度（小鼠 ELI SA胰岛素试剂盒，Morinaga，日本）、血浆活性GLP-1 (EMD Mi 11 ipore有限公司，USA)和血 糖水平。血糖通过血糖仪测自膳食负荷后0、30、60、90和120分钟所采尾血。使用丨=0至七= 120分钟的血糖波动概貌以积分曲线下面积(AUC0-2h)。各处理的百分数抑制值生成自归一 化至膳食负荷禁食小鼠的AUC数据。
[0147] 胰腺胰岛素含量和组织分析
[0148] 立即分离整个胰腺以便将不附上脂肪和其它胰腺组织。在胰岛素含量测定中，测 定湿重以后，将经分离胰腺冻结在液氮中并在-80°C贮存直至使用。解冻胰腺并用包含蛋白 酶抑制剂混合物的PBS均化。离心（1000g，10分钟，4°C)匀浆并准备上清液用于胰岛素测定 (小鼠 ELISA胰岛素试剂盒，Morinaga)。在免疫组织化学分析中，将经分离胰腺固定在4%多 聚甲醛中24小时并埋入石蜡中，切成4μπι切片。使切片与一级抗体（豚鼠抗胰岛素抗体， Dako)和二级抗体(生物素化抗豚鼠 IgG抗体)反应。最后用苏木精对载片进行复染并将其置 于显微观察。在组织学检查试验中，切开空肠、肝和肾，在4%多聚甲醛中固定过夜并埋入石 錯中。用Masson三色染色法对肝和肾的4μηι切片进行染色。
[0149] Τ细胞增殖试验
[0150] 在实验期最后处死免疫小鼠，将脾细胞（106细胞/孔)培养在RPMI 1640培养基中 并用lOμg/ml的候选肽、KLH和植物凝集素(PHA)(Wako Pure Chemical Industries)进行刺 激。37°C培养48小时后，将lyCi[3H]胸苷(Perkin Elmer)加至各板并另外培养所述板8小 时。使用MicroBeta 1450TriLux闪烁计数器(Wallac 0y)测定[3H]胸苷摄取。
[0151] ELISP0T 试验
[0152] 分别用抗小鼠 IFN-α抗体和抗小鼠 IL-4捕捉抗体涂覆96孔ELI SPOT板，4 °C过夜。培 养后，用包含〇.〇5%TWeen 20的PBS(PBS-T)溶液洗涤板并用包含1%BSA和5%蔗糖的roS封 闭。然后，将来自免疫小鼠的脾细胞悬浮液接种在孔中（1〇 6细胞/孔），并用l〇μg/ml候选肽、 KLH和PHA在37°C再刺激48小时。培养后，用PBS-Τ洗涤板。然后用生物素化抗小鼠 IFN-a抗体 或生物素化抗小鼠 IL-4抗体在4°C培养各孔过夜并用PBS-Τ洗涤。将链霉亲和素-AP加入各 孔中并在室温下培养2小时。用roS-T洗涤后，用BCIP/NBT溶液在室温下培养板30分钟。最 后，用水冲洗板，在室温下风干，并使用解剖显微镜(Olympus)对色斑进行计数。
[0153] 统计学分析
[0154] 所有数据表示为均值土SEM。使用Prism GraphPad 5.01版(GraphPad软件有限公 司）进行统计学分析。当P〈〇. 05时认为统计学差异是显著的。
[0155] 实施例1用于DPP-4疫苗的适当抗原序列的选择和筛选
[0156] 基于三维结构，设计了3个肽:DPP-4的N末端序列中的一部分(E1;SEQ ID N0:5)， 以及两个其它序列(E2;SEQIDN0:6，E3;SEQIDN0 :4)。因为经诱导抗体可与DPP-4的活性 孔穴重叠，所以预期其用作DPP-4中和抗体。三个候选肽(El，E2，E3)接合至KLH，并以低剂量 (2yg肽/小鼠）和高剂量(20yg肽/小鼠）以2周间隔注射至雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，η = 6/ 组）3次（图1Α)。针对DPP-4的抗体滴度（以半数最大数显示)在首次免疫后14天未增加。然 而，在采用E1或E3疫苗免疫的小鼠（以下有时分别描述为E1疫苗组、E3疫苗组）中，抗体滴度 在第28天时以剂量依赖性方式显著升高，在第42天和56天进一步增加，并在第70天时逐渐 降低。在仅采用KLH或E2疫苗免疫的小鼠（以下有时分别描述为KLH疫苗组、E2疫苗组）中，抗 体未增加。这些结果表明在E1和E3疫苗组中抗DPP-4抗体的平均半衰期为约42天，其高于全 部现有DPP-4抑制化合物的半衰期。自免疫起始后第56天，高剂量疫苗小鼠（20yg