专利名称：：色烯s1p1受体拮抗剂的制作方法色烯S1P1受体拮抗剂本发明涉及多环的化合物、它们的制备方法、它们作为药物的用途以及包含它们的药物组合物。更具体而言，在第一方面，本发明提供了式I化合物或其生理学上可水解的衍生物、其盐、水合物和/或溶剂化物(I)其中R,和R2各自独立地选自以下基团氢；卤素；硝基；任选取代的C,_8烷基(例如被芳基、C^环烷基或d-s烷氧基取代)；任选取代的卣代d-8烷基；任选取代的C,—8烷氧基(例如被d-8烷氧基、C^环烷基、芳基取代)；任选取代的卤代d-s烷氧基；R3为包含至少一个环N原子的饱和杂环，且其通过R3的环C原子与环A连接，该环碳原子或任何其他环C原子任选被取代(例如被卣素、d-6烷基、Cw烷氧基、C！—6烷基d-6烷氧基取代)；且R3在所述环A的3位或4位上，优选在4位上；R4为氢；羟基；卣素；卣代C,-s烷基；任选取代的C^烷基；C卜6烷氧基；或囟代C"烷氧基；且R4在2位(邻位)或3位(间位)上。卤素可以是氟、氯或溴，优选氟或氯。作为基团或在基团中存在的烷基或烷氧基可以是直链或支链。亚烷基可以是直链或支链。作为基团或在基团中存在的烷基可以是被取代的，例如被羟基、卣素、烷氧基取代。作为基团或在基团中存在的烷氧基可以是被取代的，例如被羟基取代。当烷基或烷氧基被羟基取代时，则羟基优选在烷基或烷氧基的末端位置。链烯基可以例如被烷基、羟基取代。如本文所定义的卣代烷基和囟代烷氧基分别指被l至5个卣素取代的作为基团或在基团中存在的烷基和烷氧基，例如CFr、CHF2-、CH2F-或CF3-CH20-、CHF2-CH20-、CH2FCH2-0。卣代烷基和面代烷氧基可以例如被羟基取代。任意芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。作为基团或自基团中存在的<:3.8环烷基，例如R，、R2，是指三至八元，优选五至七元的不包含杂原子非芳环。优选地R3为下式(Ia)广X、N(Ia)其中X选自N、O、C和S原子。优选地R3为如下式(Ib)的三至八元饱和杂环R(Ib)其中X选自NR、O、CH2和S原子，其中R和R，彼此独立地为H或d-4烷基，且其中所述的R3与式(I)中的所述A环通过带氢原子的式(Ib)环内任何碳原子相连，该氢然后^L所述连接替换。在式(Ib)中，所述变量可独立地、共同地或其任意组合地具有以下优选的含义R为H、甲基或乙基；R，为H或甲基；X选自NR、0和CH2，其中R为H或Cw烷基或更优选地为H、甲基或乙基；式(Ib)的残基可以是手性的，例如R-或S-对映体，或者可以是其外消旋混合物。另一方面本发明涉及式(I)化合物的代谢物，例如其中R3为式(Ic)或(Id)残基的式(I)化合物<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image>其中x选自o和s原子，R为H或d—4烷基，且波浪键表示R-或S-对映体或其混合物。例如，R3为包含1或2个优选地选自N、O和S的杂原子的三至八元、优选为五至八元饱和杂环。本领域技术人员应当理解当环的大小为五至八个原子时，杂环中一般地可以存在2个杂原子。因此在三和/或四元杂环中一般地存在不多于1个杂原子。在另一方面，R3通过R3的环C原子与环A相连，使其在R3的环N原子(或者R3的多个环N原子中的一个)的邻位或间位。优选的R3选自3-吗啉基、2-吗啉基、2-哌噪基、2-派咬基、3-哌咬基、3-硫代吗啉基、2-碌L代吗啉基、2-吡咯烷基和3-吡咯烷基。任选地R3为4皮取代的。当R3为被取代的时，其可以在一个或多个环碳原子和/或当存在时的环氮原子上被取代。环碳原子上的取代基的实例包括例如C,-4烷基、C,-6烷氧基、卤素、卤代d—4烷基。环杂原子上的取代基实例包括例如C,—4烷基。环A不包括杂原子。独立地、共同地或者以任意组合或亚组合优选以下意义1.R,和R2彼此独立地选自氢；任选取代的d-s烷基；任选取代的卣代d—s烷基；任选取代的d—8烷氧基；任选取代的囟代C,-8烷氧基；2.R,和R2彼此独立地选自氬；C，-8烷基；Cu烷氧基；3.R,和R2两者不都为氢；4.R,和R2两者均为Cu烷氧基；5.R3为3-吗啉基、2-艰溱基、2-哌咬基或2-吡咯烷基；6.R3为3-S-吗啉基、2-S-艰漆基、2-R-哌梵基或2-R-吡咯烷基；7.1义3在4位；8.R和R2彼此独立地选自氢；C^烷基；Cu烷氧基；R3选自3-吗啉基、2-哌嗪基、2-哌咬基和2-吡咯烷基；9.!^和R2彼此独立地选自Cu烷基；Q-8烷^J^;R3选自3-S-吗啉基、2-S-哌嗪基、2-R-艰"定基和2-R-吡咯烷基；且R4为氢；10.R,和R2彼此独立地选自任选取代的d—8烷基；任选取代的囟代C^烷基；任选取代的C,—8烷氧基；和任选取代的卣代d—8烷氧基；11.R，和R2彼此独立地选自d—8烷基；卣代C,-8烷基；C^烷氧基；和卣代Ci—8坑氧^^;12.R,和R2彼此独立地选自d-s烷基；和Cu烷氧基；13.R3为手性残基并且是R-或S-对映体或其混合物(消旋体)；14.R3为S-对映体；15.R3为R-对映体；16.Rj为氢。式I化合物可以以游离形式或盐形式存在，所述的盐形式例如有与例如有机酸或无机酸如盐酸或乙酸形成的加成盐，或者与碱形成的当R5是COOH或包含COOH时可得到的盐，例如碱盐，诸如钠或钾盐或者取代或未取代的铵盐。应当理解，式I化合物可以以旋光异构体、外消旋物或非对映异构体的形式存在。应当理解，本发明包括所有对映异构体和构象异构体及其混合物。类似的考虑如上文所提及的那样应用于显示出不对称碳原子的原料。式l化合物和本身在生理学上是可接受的副产物的化合物，例如水解产生式I化合物和在所需剂量水平上无毒的醇的酯。本发明还包括制备式I化合物的方法，这些方法包括使式II化合物(其中Ri、R2如上所定义)与式III化合物(其中R3和R4如上所定义)反应，如途径A(方案l)所示。方案l:途径A所有反应均在溶剂中进行，所述的溶剂诸如有曱醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯、二氯曱烷、1，2-二氯乙烷、N-甲基吡咯烷酮、二曱苯、乙酸乙酯、乙醚、己烷、环己烷、二曱基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、叔丁基曱基醚。所有化合物均可以使用本领域技术人员已知的方法来分离(例如结晶、珪胶色i普法、HPLC)。式IV的2-羟基苯甲醛在适宜的碱(例如仲胺，诸如哌咬)的存在下在适宜的溶剂中与丙二酸二乙酯缩合，得到式V的2-氧代-2H-色烯-3-曱酸酯。如果R2是羟基，则可以在该阶段在碱性条件下使用烷基卣作为亲电子试剂在适宜的碱如三乙胺、哌啶、氢化钠、碳酸钾或碳酸铯的存在下在适宜溶剂的存在下，或者使用光延(Mitsunobu)条件用相应的醇在三苯基膦和I)EAI)试剂的存在下，使羟基烷基化而使R2为烷氧基。然后将式V的2-氧代-2H-色烯-3-曱酸酯在氢氧化锂或氢氧化钠的存在下在适宜的溶剂中进行皂化，得到式II的2-氧代-2H-色烯-3-甲酸。对于形成酰胺键，使用试剂诸如亚硫酰氯或1-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或l，l，-羰二咪唑或丙烷膦酸酐在适宜的碱诸如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或碳酸氢钠的存在下在适宜的溶剂中使式n化合物活化，使其与式1II化合物(苯胺衍生物)进行反应，得到所需的式I化合物。如果R4或R5含有氮官能团保护基团如氨基甲酸叔丁酯官能团，则通过使其在适宜的溶剂中与酸诸如盐酸或三氟乙酸进行反应而实现脱保护。9采用途径A和与本发明有关的其它方法制备2-氧代-2H-色烯-3-甲酸和式I化合物的方法是本领域技术人员已知的并且已经在文献(Horing，E.C.等人(1955)o尸gflrt/c，,to&，集合巻III，165，Livingstone,R.(1977);R()dd，sC^e附/s外ca/"6owc0附/7o朋ffe，第IV巻，第96页，Staunton,J.(1979);7/etefY<^c//cC7^附&,/j(编者P.G.Sammes),第4巻)中进行了综述。在原料的制备没有被特别描述的情况下，化合物是已知的或者可以类似于本领域已知的方法或按照下文公开的方法来制备。制备非市售的式IV的2-羟基苯甲醛化合物(其中R,是烯丙基或丙基)的便利方法显示在流程2(途径B)中。可以用亲电子试剂诸如烯丙基溴将其中R,是H的式IV的2-羟基苯甲醛在适宜的碱诸如碳酸钾或碳酸铯的存在下在适宜的溶剂中进行O-烷基化，得到式VI化合物。式VI化合物在热条件(油浴或微波加热)下的克莱森(Claisen)重排可以在净溶剂条件下或在适宜的溶剂中进行，得到其中R,是烯丙基的式IV化合物。在醛的存在下将双键进行选择性还原，得到其中R,是丙基的式IV化合物，该过程可以在标准氢化条件下使用阮内镍作为催化剂在适宜的溶剂中实现。或者，如流程2(途径C)中所示，如果R2是烷氧基，则使式VII化合物与强碱诸如丁基锂和烷基卣或酰卣进行反应，得到式VIII化合物，将其通过酸诸如盐酸、氢溴酸或三溴化硼的作用在适宜的溶剂中进行O-脱烷基化，得到式IX化合物(酚)。将式X化合物在维尔斯梅尔(Vilsmeier)条件下使用例如POCl3和N，N-二曱基曱酰胺作为羰基源在适宜的溶剂中转化为式IV化合物(其中R，是烷基或-CO烷基且R2是OH)。方案2:途径B:VIIVHIXR2-烷氧基(R"烷基,-CO烷基,R2:烷氧基)(R"烷基,-CO烷基,R2=OH)制备非市售的式IV的2-羟基苯曱醛中间体(其中R2是羟基)的便利方法显示在流程3(途径D)中。按照文献方法(SyntheticCommunications,20(12)，1869-1876)仿制式XI化合物的合成。将式X化合物在维尔斯梅尔(Vilsmder)条件下使用例如POCb和N，N-二甲基甲酰胺作为羰基源在适宜的溶剂中转化为式IV化合物(其中R2是羟基)。方案3:途径I):HR1R1R1XW(R2-羟基)式III的苯胺中间体可以购买或各硝基化合物是购买的，并在适宜的溶剂中通过钯炭和氢或钯炭与硼氢化钠或氯化亚锡的作用被还原成式III的苯胺。如果R4或Rs带氨基官能团，其在适宜的溶剂中、适宜的碱诸如三乙胺、二乙基异丙胺存在下，使用作为亲电试剂的BOC酐被保护成叔丁氧基氨基甲酸酯。式III的苯胺可由相应的硝基或溴代苯基XI在适宜的溶剂中通过钯炭和氢或钯炭与硼氢化钠或氯化亚锡的作用下被还原而得到，或在标准的Pd催化条件下使用诸如氨、六曱基二硅氮烷或亚氨基二苯甲酮的氮源进行溴或氨基交换而被还原而得到。式XI硝基苯基或溴代苯基如方案4(途径E)以下实施例说明了本发明。溶液的浓缩在旋转式蒸发器上在减压下进行。常规的快速色谱法在硅胶上进行。还使用Biotage快速色谱仪或Flashmaster仪进行了快速色语法。所用的缩写为TBME=叔丁基甲基醚BOC=ik丁氧基羰基I)MF=二曱基甲酰胺LiOH=氬氧化锂HC1=盐酸THF=四氢吹喃CH2C12=二氯甲烷RT=室温NaOH=氢氧化钠Min=分钟实施例l:7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺12a)2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛的制备向2-羟基-4-甲氧基-苯甲醛(5g，32.8mmol)和烯丙基溴(3.89ml，46mmo1)在丙酮(50ml)中的溶液中加入碳酸钾(6.8g，49.3mmo1)。然后将反应混合物在回流下撹拌3小时。将反应混合物浓缩，在200mlTBME和150ml1NNa()H之间分配，分层。将有机层用150ml盐水和150ml水洗涂，干燥，浓缩。使用快速色谱法(洗脱剂CH2C12/己烷8/2)纯化后，分离出2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛。b)3-烯丙基-2-幾基-4-曱氧基-苯曱醛的制备于230。C将2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛(5g，26mmol)在NMP(10ml)中的溶液进行微波加热30分钟。然后将反应混合物倒入水/水(200ml)混合物中，加入TBME(200ml)，分离有机层，用150ml盐水和150ml水洗涤，干燥，浓缩。使用快速色谱法(洗脱剂CH2C12/己烷8/2)纯化后，分离出3-烯丙基-2-羟基-4-甲氧基-苯甲醛。c)2-羟基-4-甲氧基-3-丙基-苯曱醛的制备向3-烯丙基-2-羟基-4-甲氧基-苯甲醛(5g，26mmol)在THF(25ml)中的溶液中加入10。/。重量Pt/C。然后于室温将反应混合物搅拌直至消耗l当量氢气。然后将反应混合物通过硅藻土过滤，浓缩。2-羟基-4-甲氧基-3-丙基-苯甲醛未经进一步纯化而使用。d)7-曱氧基-2-氧4、-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸乙酯的制备13向2-羟基-4-甲氧基-3-丙基-苯曱醛(l5g，77,2mmol)在乙醇(450ml)中的溶液中加入丙二酸二乙酯(11.7ml，77.2mmol)和咪咬(7.6ml，77.2mmmo1)。于室温将反应混合物搅拌过夜。然后使用冰/水浴将反应混合物冷却至0。C，将形成的沉淀物过滤，用乙醇洗涤。将母液浓缩，使用快速色谱法(洗脱剂乙酸乙酯/己烷3/7)进行纯化，得到7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸乙酯。e)7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸的制备于0。C向7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸乙酯(15.4g，53.0mmo1)在THF(300ml)中的溶液中加入lNNaOH溶液(120ml)，然后于室温将反应混合物搅拌过夜。使用水/水浴将反应混合物冷却至(fC，使用1NHC1溶液使pH降为l。于0。C将反应混合物搅拌30分钟，将形成的沉淀物过滤，用水洗涤。将沉淀物干燥后，分离出7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸。f)2-{4-[(7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-羰基)-氨基卜苯基}-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的制备向7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸(150mg，0.572mmol)在CH2CI2(6ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(147ul，0.858mmol)和丙烷膦酸酐在乙酸乙酯中的溶液(456ul，0.858mmo1)。然后于室温将反应混合物搅拌30分钟。将2-(4-氨基-苯基)-吡咯烷-l-甲酸叔丁酯(150mg，0.572mmol)加入到反应混合物中。于室温将其搅拌4小时。反应混合物用二氯甲烷(40ml)稀释，用40ml的NaHCO3饱和溶液、40ml盐水洗涤，然后萃^"机层，干燥并浓缩。在沉淀后分离2-{4-[(7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-羰基)-氨基卜苯基}-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，用己烷洗涤得到浅黄色固体。g)7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺的制备向2-(4-l(7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-羰基)-氨基j-苯基)-吡咯烷-l-甲酸叔丁酯(194mg,0.38mmo1)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入在二噁烷(lmL)中的4NHC1。将反应混合物在室温下搅拌2h(加入HC1后生成沉淀)。然后将反应混合物减压浓缩，固体用乙醚研磨。过滤后分离出7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺。14其中R,、R2、R3和Rj如以下表l中所定义,表l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>全部以下实施例按照上文描述的方法合成。通过以上实施例1中描述的方法并使用途径A中描述的方法，并使用适宜起始原料得到式Xa化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>17丙基OMe4-[l-(2-羟基-乙基)-吡咯烷-2-基-*H451.418异丙基OMe4-l-甲基-p比咯烷-2-基一*H421.319丙基OMerac-4画旅咬画2-基-H421.320乙基OMerac-4-哌咬-2-基-H407.321OEtOMe4-咪咬-2-基画*H423.122OEtOMe4-旅咬-2-基-*H42323OiPrOMe4-哌咬-2國基-*H43724OiPrOMe4-旅咬-2-基-*H43725丙基OMerac-4-(l-甲基-旅咬-2-基)-H435.426乙基OMerac—4-(l-甲基-哌咬-2画基)-H421,327丙基OMe4-(S)-吗啉-3-基-H423.228乙基OMe4-(S)-吗啉-3-基-H409.129OEtOMe4-(S)-吗啉-3-基-H425.130OEtOMe4-(11)-吗啉-3-基-H42531—OiPrOMe4-(S)-吗啉-3-基-H439.232OCH;j环丙基OMe4-(S)-吗啉-3-基-H45133OEtOMe4-(S)-4-甲基-吗啉-3-基-H439.834甲基OMerac-4-p马淋-2-基-H395.135乙基OMerac-4-吗啉画2-基画H409.536乙基OMe4-吗淋-2-基-*H409.137OEtOMerac國4-吗啉-2-基-H425,138OEtOMe4-吗啉-2-基-*H425.139OEtOMe4-吗淋-2-基-*H425.140OiPrOMerac画4-吗淋-2-基-H439.641OiPrOMe4-吗淋-2-基-*H439.142OiPrOMe4-吗啉-2-基-*H439,143丙基OMerac-4-n底噪-2-基-H42244乙基OMeH40845乙基OMe4-哌唤-2-基-*H40816<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>75甲基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-H379.1876曱基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-2-F397.1877曱基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me393.2178丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-H449.1i79丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-3画Et477.1180丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-:2-基誦2-Me463.1;81OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-H451.6;82OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me465.283丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-3Me463.384丙基EtO4-(R)-吡咯烷-2-基-H421.285丙基EtO4-(R)-吡咯烷-:2岡基國2-Me435.386丙基EtO4曙(R)-吡咯烷-2-基-3-Me435.387EtOEtO4-(R)-吡咯垸-2-基-H423.2i88EtOEtO4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me437.389—EtOEtO4-(议)-吡咯烷-2-基-2-F441.5卯OiPrOMe4-(S)-吗啉-3-基画3-Me453.391OiPrOMe4(-2掘-旅咬-2-基)画*H451.392OiPrOMe4(-2-Me-哌咬-2-基)画六H451.393EtOOMe4(-2-Me-咪咬-2-基)^H437.394EtOOMe4(-2-Me-哌啶-2-基)-夫H437.3:95EtOOMe3-(S)-吗啉-3-基-H425.3i96OiPrOMe3-(S)-吗啉-3-基画H439.397甲基OMe4-(S)-吗啉-3-基誦H395.198CH2OMeOMe4-(S)-吗啉-3-基-H425.299EtOEtO4-(S)-吗啉-3-基-H439.2100OiPrOiPr4-(S)-吗啉-3-基-H467.2101EtOCH2OMe4-(8)-吗啉-3-基-H439.3102CH2OMeEtO4-(11)-吡咯烷-2-基-H409103EtOCH2OMe4-(R)-吡略烷-2-基-H423.4104OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-2-F469.5105OiPrEtO4-(R)-吡咯烷-2-基-H437.3106OiPrEtO4-(S)-吗啉-3-基-H453.3上ITf"贯例表示的"i兌明*表示未知绝对构型的手性化合物。rac表示S和R对映体的消旋混合物。18游离形式或可药用盐形式的式I化合物显示出有价值的药理学性质，例如作为S1P1受体激动剂，例如如在体外和体内试验中所表明的那样，因此其表明可用于治疗。A.体外式I化合物对个体人S1P受体具有结合亲和力，如在以下试验中测定的那样A.l体外测定GTP〖y-"Sl与由表达人EDG受体的CHO细胞制备的膜结合的GPCR激活试验SIP!(EDG-1)GTPY-35S1结合试验由稳定表达人EDG-lN-末端c-myc标记的CHO细胞克隆制备了匀化的膜。在收集前，将细胞在两个850cm2滚瓶中悬浮培养3或4天。将细胞离心下来，用冷PBS洗涤1次，重新混悬在^20ml緩沖液A(20mMHEPES，pH7.4,lOmMEDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂合剂11片/25m11)中。使用Polytron匀化器以30000rpm、以3个间隔(每个15秒)将细胞悬液在冰上匀化。首先将匀化物在台式低速离心机上以2000rpm离心10分钟。通过细胞滤过器后，然后于4。C以50，000xg将上层液再次离心25分钟。将沉淀物重新混悬在緩冲液B(15。/。甘油，20mMHEPES,pH7.4，O.lmMEDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂合剂[1片/10ml])中。使用BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯(Pierce)公司)、使用BSA作为标准测定了制备物的蛋白质浓度。将膜进行等分，于-80。C保持冷冻。用DMSO制备了范围为10mM至0.01nM的受试化合物溶液。将S1P用4。/。BSA溶液稀释作为阳性对照。将所需量的膜制备物用冰冷的测定緩冲液(20mMHEPES，pH7.4，lOOmMNaCl，10mMMgCl2，0.1%不含脂肪酸的BSA，5pMGDP)稀释，充分涡旋。将2iul或更少的化合物分配到圆底96孔聚苯乙烯测定板的各孔中，然后加入100nl稀释的膜(3-10ng/孔)，在水上保持直至加入热GTPyS。将[35s卜GTPyS用冷测定緩冲液稀释l:1000(v/v)，将lOOiul加入到各孔中。反应于室温进行90分钟，然后使用帕卡德^^司(Packard)的Filtermate采集器将膜收集到珀金埃尔默(Perkin-Elmer)UnifilterGF/B-96滤板上。用洗涤緩冲液(20mMHEPES，pH7,4，100mMNaCl,10mMMgCl2)洗涤数次并用95。/。乙醇冲洗后，将过滤器在37。C干燥19箱中干;J^30分钟。加入MicroScint-20,将板密封用于在TopCount上进行闪烁计数。通过用GraphPadPrism剂量响应曲线拟合工具将GTPly-"Sl结合曲线(原始数据)拟合而得到EC50值。使用了6或12种不同浓度以产生浓度响应曲线(每种浓度使用3个数据点)。使用来自稳定表达c-末端c-myc标记的或未标记的受体的CHO细胞的膜以与S1P1GTP[Y-35S]结合试验相当的方式进行了S1P3、-5、-6和-8GTPh^SSj结合试验。对于各膜制备物，首先用S1P对照进行了剂量递增实验以确定将加入每个试验孔的膜的最佳量。按照以上测定对式I化合物进行了试验，这些化合物显示出对S1P受体如S1P1受体具有选择性，其ECsq〈1hM。此外，与S1P3、S1P4和S1P5相比，式I化合物可显示出对S1P1受体的选择性，例如，式I化合物对S1P1的选择性可以是对S1P3、S1P4和S1P5的选择性的至少20倍。同样一般地，式I化合物可以对S1P1和S1P5受体较其他亚型即S1P3和S1P4具有所谓的双重选择性。所述选择性一般约为20-30(以受体亲和性表示)。这样的S1P1/S1P5受体双重激动剂亦具有有价值的药理学效果。ExS1P-1EC50[阔10扁130.001680.0075230.0755270細2410.0029430細1440扁2530据6620細5720.0018820.0024890.0128900.0062960.002820A.2FLIPR4丐流分析用FLIPR钓流分析测定了本发明的化合物对S1P1、S1P3、S1P5和S1P6的激动剂活性。简言之，将表达SlP受体的CHO细胞在含有5。/oFBS和500ug/mlG418的F-12K培养基(ATCC)中维持。在试验前，将细胞以在含有l。/,FBS的F-12K培养基中10,000个细胞/孔/25iul的密度铺在384孔黑色透明底的板中。第二天，将细胞用洗涤緩冲液洗涤3次(25^1/每次)。将约25pl染料加入到各孔中，在37。C和5。/。C02下孵育1小时。然后将细胞用洗涤緩冲液洗涤4次(25iul/每次)。在将25plSEW2871(由Rosen等人公开，用作参考)溶液加入到细胞的各孔中后测定4丐流。对表达各不同S1P受体的细胞进行了相同试验。经3分钟间隔记录FLIPR钙流分析中的递增，将其定量为相对于S1P-1激活的最大峰高百分数响应。本发明的化合物在该试验中在10—12至3.10-SnM的浓度下具有活性。例如，实施例13对SlP-l具有的ECso=92nM，对所有其它同工型(SlP-2、SlP-3、SlP-4、SlP-5)具有的ECso〉lum。B.体内测定血液淋巴细胞消减的筛选试验循环、淋巴细胞的测定:将受试化合物溶解在DMSO/PEG200中，用去离子水进一步稀释。经口应用给大鼠(路易斯品系，雌性，6-12周龄)施用在4ml栽体/kg(最大2。/。DMSO/最大2。/。PEG200/水)中的lmg/kg受试化合物。DMSO/PEG200/水和FTY720(0.3mg/kg)包括在内分别作为阴性和阳性对照、。在施用后2、6、24和48小时在短时异氟烷麻醉下由舌下静脉采集血液。对全血样品进行血液学分析。使用自动分析器测定了外周淋巴细胞计数。通过荧光染料结合的特异性抗体将外周血淋巴细胞的亚群染色，使用荧光激活细胞分类器(Facscalibur)对其进行了分析。使用了两只大鼠以评价篩选的各化合物的淋巴细胞消减活性。结果为EDso，其定义为显示出50%血液淋巴细胞消减所需的有效剂量。按照以上测定对式I化合物进行了试验，其具有的EDsQ在10mg/kg以下。例如，实施例9的化合物在6小时所具有的EI)so=1.4mg/kg。因此，式I化合物可用于治疗和/或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或障碍，例如在移植中，诸如细胞、组织或器官同种异体或异种移植物的急性或慢性排斥或者移植物功能延迟恢复(delayedgraftfunction)、移植物抗宿主病，自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型或II型糖尿病及与其有关的障碍、脉管炎、恶性贫血、舍格伦综合征、眼色素层炎、银屑病、格雷夫斯眼病、局限性脱发及其它，变应性疾病，例如变应性哞喘、特应性皮炎、变应性鼻炎/结膜炎、变应性接触性皮炎，任选具有潜在异常反应的炎性疾病，例如炎性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎、内源性孝喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎、刺激性接触性皮炎和还有湿渗性皮炎、脂溢性皮炎、免疫学上介导的障碍的皮肤表现、炎性眼病、角结膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注损伤，例如心肌梗塞、中风、肠缺血、肾衰竭或出血性休克、创伤性休克，癌症，例如乳癌、T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，感染性疾病，例如中毒性休克(例如超抗原引起的)、败血症性休克、成人呼吸窘迫综合征或病毒感染如AIDS、病毒性肝炎、慢性细菌感染，或者老年性痴呆。细胞、组织或实体器官移植物的实例例如包括胰岛、干细胞、骨髓、角膜组织、神经组织、心脏、肺、心-肺联合、肾脏、肝脏、肠、胰、气管或食管。对于以上用途，所需的剂量当然将根据施用模式、所治疗的具体病症和所需的作用而改变。通常，以约0.03至5.0mg/kg体重的日剂量全身施用被指示可获得令人满意的结果。在较大的哺乳动物如人中的指示日剂量为约0.5mg至约500mg，可方l更地例如以一天至多四次的分开剂量或延迟形式施用。适用于口服施用的单位剂量形式包含约0.1至50mg活性成分。式I化合物可以通过任意常规途径来施用，特别是经肠施用，例如口月良施用，例如以片剂或胶嚢剂的形式施用，或者胃肠道外施用，例如以注射溶液或混悬液的形式施用，局部施用，例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂的形式施用，或者以经鼻或栓剂的形式施用。包含游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可以以常规方式通过与可药用载体或稀释剂混合来制备。式I化合物可以以游离形式或可药用盐形式、例如如上表明的那些来施用。这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。根据上文，本发明还提供了1.1在需要该治疗的个体中预防或治疗由淋巴细胞介导的障碍或疾病、例如如上表明的那些的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的式I化合物或其可药用盐；1.2在需要该治疗的个体中预防或治疗急性或慢性移植排斥或者T-细胞介导的炎性或自身免疫性疾病、例如如上表明的那些的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的式I化合物或其可药用盐；2.用作药物、例如以上1.1或1.2表明的任意方法中用作药物的游离形式或可药用盐形式的式I化合物。3.例如用于以上1.1或1.2中任意方法的药物组合物，包含游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及用于此的可药用稀释剂或载体。4.用于制备用于以上1.1或1.2中任意方法的药物组合物的式I化合物或其可药用盐。式I化合物可以作为单独的活性成分或者例如作为其它药物的辅剂而与其它药物联合施用，所述的其它药物例如有免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂，例如用于治疗或预防同种异体或异种移植物急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性障碍，或者化学治疗剂如恶性细胞抗增殖剂。例如，式I化合物可以与如下药物组合使用钙神经素抑制剂，例如环孢素A或FK506;mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、CCl779、ABT578、AP23573、biolimus-7或biolimus-9;具有免疫抑制性质的子嚢霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特；咪唑立宾；麦考酚酸或盐；麦考酚酸吗乙酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；PKC抑制剂，例如如在WO02/38561或WO03/82859中^Hf的那些，例如实施例56或70的化合物；JAK3激酶抑制剂，例如N-千基-3，4-二羟基-亚爷基-氰基乙酰胺a-氰基-(3,4-二羟基)-N-千基肉桂酰胺(TyrphostinAG4卯)、灵菌红素25-C23(PNU156804)4-(4'-羟基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉(WHI-P131)、^國(3，-溴-4'-羟基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉l(WHI-P154)4-(3，,5'-二溴-4'-羟基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉WHI-P97、KRX-211、3-{(31^，411)-4-甲基-3-曱基-(711-吡咯并[2，3-(1]嘧啶-4-基)-氨基-哌啶-1-基}_3_氧代_丙腈，为游离形式或可药用盐形式，例如单枸橼酸盐(还称为CP-6卯，550)，或如在WO04/052359或WO05/066156中z^开的化合物；S1P受体激动剂或调节剂，例如任选磷酸化的FTY720或其类似物，例如任选磷酸化的2-氨基-2-[4-(3-节基氧基苯硫基)-2-氯苯基乙基-l，3-丙二醇或1-{4-[1-(4-环己基-3-三氟曱基-节基氧基亚氨基)-乙基卜2-乙基-千基}-氮杂环丁烷-3-甲酸或其可药用盐；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、CD80、CD86或其配体的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体的至少一部分胞外域的重组结合分子，例例如CTLA4Ig(例如指定的ATCC68629)或其突变体的重组结合分子，例如LEA29Y;粘着分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-l或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化学治疗剂，例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔比星或5-氟尿嘧啶；或抗感染剂。当式I化合物与其它免疫抑制/免疫调节治疗、抗炎、化学治疗或抗感染治疗联合施用时，共同施用的免疫抑制化合物、免疫调节化合物、抗炎化合物、化学治疗化合物或抗感染化合物的剂量当然将根据所采用的共用药物的类型(例如它是类固醇还是钙神经素抑制剂)、所采用的具体药物、所治疗的病症等等而改变。根据上文，本发明还在另一方面提供了5.如上所定义的方法，该方法包括共同施用、例如并行或依次施用治疗有效的无毒量的式I化合物和至少第二种药物、例如免疫抑制药、免疫调节药、抗炎药或化学治疗药、例如如上表明的那些。6.药物组合、例如药盒，包含a)第一种物质，该物质为游离形式或可药用盐形式的如本文所公开的式I化合物，和b)至少一种共用物质，例如免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、化学治疗剂或抗感染剂。该药盒可以包24含其施用说明书。如本文所用的术语"共同施用"或"组合施用"等意欲包括将所选的治疗剂施用于单一患者，并且意欲包括其中物质不一定通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语"药物组合"表示由将一种以上活性成分混合或合并所得到的产品，包括活性成分的固定和非固定组合。术语"固定组合"表示将活性成分、例如式I化合物和共用物质以单一实体或剂量的形式同时均施用于患者。术语"非固定组合"表示将活性成分、例如式I化合物和共用物质作为单独的实体同时、并行或依次而没有特定时间限制地均施用于患者，其中该施用可在患者体内提供这2种化合物的治疗有效水平。后者还可应用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或更多种活性成分。权利要求1.式I化合物或其生理学上可水解的衍生物、其盐、水合物和/或溶剂化物其中R1和R2各自独立地选自氢；卤素；硝基；任选取代的C1-8烷基；任选取代的卤代C1-8烷基；任选取代的C1-8烷氧基；和任选取代的卤代C1-8烷氧基；R3为包含至少一个环N原子的饱和杂环，且其通过环C原子与环A连接，该环碳原子或任何其他环C原子任选被取代；R3在3位或4位上，优选在4位上；R4为氢；羟基；卤素；卤代C1-8烷基；任选取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；或卤代C1-6烷氧基；优选R4为氢；R4在2位(邻位)或3位(间位)上。2，根据权利要求1的化合物，其中R3为如下式(Ib)的三至八元饱和杂环<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>其中X选自NR、O、CH2和S原子，其中R和R，彼此独立地为H或d-4烷基，且其中所述的R3与式(I)中的所述A环通过带氢原子的式(Ib)环内任何碳原子相连，该氢然后被所述连接替换。3.权利要求1的化合物，其中R3为包含1或2个优选地选自N、O和S的杂原子的三至八元、优选为四至七元的饱和杂环。4.权利要求l的化合物，其中R3经由形成所述的R3的碳原子与环A连接。5.权利要求4的化合物，其中连接的碳原子在R3的杂原子的2位或3位。6.权利要求l的化合物，其中R,和R2各自独立地选自任选取代的d—8烷基；任选取代的卣代d、8烷基；任选取代的C,-s烷氧基；任选取代的卣代d-8烷氧基。7.权利要求1的化合物，其中R，和R2彼此独立地选自d，8烷基和Q—8烷氧基；优选R,和R2两者均为C^烷氧基。8.权利要求1的化合物，其中R3为3-S-吗啉基、2-S-哌溱基、2-R-哌咬基或2-R-吡咯烷基；且R3在环A的4位连接。9.用作药物的根据前述权利要求的任意一项的化合物。10.用作药物的根据前述权利要求的任意一项的化合物，其中所述的用途为治疗和/或预防通过淋巴细胞相互作用介导的疾病或障碍；例如在移植中，诸如细胞、组织或器官同种异体或异种移植物的急性或慢性排斥或者移植物功能延迟恢复、移植物抗宿主病，自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型或II型糖尿病及与其有关的障碍、脉管炎、恶性贫血、舍格伦综合征、眼色素层炎、银屑病、格雷夫斯眼病、局限性脱发及其它，变应性疾病，例如变应性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎/结膜炎、变应性接触性皮炎，任选具有潜在异常反应的炎性疾病，例如炎性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎、内源性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎、刺激性接触性皮炎和还有湿渗性皮炎、脂溢性皮炎、免疫学上介导的障碍的皮肤表现、炎性眼病、角结膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注损伤，例如心肌梗塞、中风、肠缺血、肾衰竭或出血性休克、创伤性休克，癌症，例如乳癌、T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，感染性疾病，例如中毒性休克(例如超抗原引起的)、败血症性休克、成人呼吸窘迫综合征或病毒感染如AIDS、病毒性肝炎、慢性细菌感染，或者老年性痴呆。全文摘要式(I)化合物、它们的制备方法、它们的用途、特别是在移植中的用途以及含有它们的药物组合物，其中R<sub>1</sub>、R<sub>2</sub>、R<sub>3</sub>和R<sub>4</sub>如说明书中所定义。文档编号C07D311/16GK101583608SQ200880002594公开日2009年11月18日申请日期2008年1月31日优先权日2007年2月2日发明者A·B·史密斯,F·泽克里,N·G·库克,R·班特里申请人:诺瓦提斯公司