专利名称：：聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白及其制备方法
技术领域：
：本发明属于药用蛋白质化学修饰
技术领域：
，具体涉及一种用聚乙二醇化学修饰的抗肿瘤和抗病毒苦瓜籽核糖体失活蛋白及其制备方法。
背景技术：
：病毒性感染、恶性肿瘤以及由病毒感染所引发的肿瘤是严重危害人类健康的疾病。传统的抗病毒类药物主要以病毒逆转录酶或蛋白酶为靶标，开发的相关抑制剂。但该类药物存在不能完全清除病毒、易产生耐药性、毒副作用大及药价昂贵等一系列问题。因此，开发新型特效抗肿瘤、抗病毒药物一直是科学家们面临的重大课题。近十多年来，在丰富的植物资源中挖掘抗病毒药物已成为人们关注的重点，，苦瓜籽核糖体失活蛋白(RIP)就是有待开发的特效药物成分之一。目前，从苦瓜中分离得到的多种核糖体失活蛋白，包括a-苦瓜素(a-Momorcharin)、p-苦瓜素(卩-Momorcharin)、y-苦瓜素(y-Momorcharin)、S-苦瓜素(5-Momorcharin)和MAP30(Momordicaanti-HIVproteinof30kD)等。它们为分子量2830kD，等电点8.89.2之间的碱性糖蛋白，都属于I型核糖体失活蛋白。a-苦瓜素、P-苦瓜素和MAP30等都具有抗肿瘤抗肿瘤等生物学功能(ZhengYT,BenKL,JinSWetal..a-MomorcharininhibitsHP/-1replicationinacutelybutnotchronicallyinfectedT-lymphocytes.ActaPharma-cologicaSinica.199920:239—243;LeeHuangS,HuangPL,ChenHC,etal，Anti-HIVandantitumoractivitiesofrecombinantMAP30frombittermelon,Gene，1995，161(2)151-156;SunY,HuangPL,LiJJ,etal,Anti-HIVagentMAP30modulatestheexpressionprofileofviralandcellulargenesforproliferationandapoptosisinAIDS-relatedlymphomacellsinfectedwithKaposi'ssarcoma-associatedvirus，BiochemBiophysResCommun，2001,287:983-994;StirpeF,Ribosome-inactivatingproteins,Toxicon，2004,44:371-383)。本专利发明人经研究也发现苦瓜籽核糖体失活蛋白对人肝癌细胞、Vero、SP2/0、3T3、Kb、Navana等肿瘤细胞株均表现有不同程度的抑制作用，而对完整细胞人胚肺二倍体细胞却毒性极小；同时也发现苦瓜籽核糖体失活蛋白对疱疹病毒、麻疹病毒、乙肝病毒、乙脑病毒及腺病毒等均有明显的抑制作用(孟延发，杜毅峰，张雪梅,苦瓜籽核糖体失活蛋白的理化性质及生物活性，中国生物化学与分子生物学，1999，15(6):920-923)。上述这些研究结果充分显示了苦瓜籽核糖体失活蛋白具有潜在的临床药用价值。虽然依据科技人员的研究显示了苦瓜籽核糖体失活蛋白具有潜在的抗病毒或抗肿瘤的临床药用价值，但由于苦瓜籽核糖体失活蛋白属于异源蛋白，因而它与其它的异源蛋白一样，不可避免都会在人体体内多次使用后产生免疫原性、毒副作用、半衰期短、稳定性差等问题，这无疑将严重影响其在临床上的推广应用。
发明内容本发明目的是针对苦瓜籽核糖体失活蛋白作为异源蛋白存在的上述问题，提供一种用聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白。经聚乙二醇修饰后的该蛋白的免疫原性和毒副作用可显著降低，且生物活性可保持6080%，以为促进临床上的推广应用奠定基础。本发明的另一目的是提供一种制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法。本发明涉及的苦瓜籽核糖体失活蛋白(a-MC)的基本性质和结构特点是分子量约为30KD、由263个氨基酸组成的单链多肽、属于I型核糖体失活蛋白、等电点为8.9-9.0的碱性糖蛋白、其N-末端氨基酸的特征序列为NH2-Asp-Val-Ser-Phe-Arg-Leu-Ser-Gly-AIa-Asp-。本发明提供的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于在苦瓜籽核糖体失活蛋白的氨基上连接有至少一条聚乙二醇分子链。且连接其上的每条聚乙二醇分子链的重均分子量为2,000100,000。由于未经修饰的a-MC有多个抗原决定位点，当其作为药物用于人体时易发生免疫反应和毒副作用等，用非免疫原性的PEG对a-MC进行修饰，PEG上的活性基团就可与a-MC特异性位点结合，遮盖a-MC的部分抗原决定簇，从而降低其免疫原性和抗原性，并可延长在体内的半衰期，提高a-MC的作用效果。本发明提供的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该方法是先在质量份为1~4份苦瓜籽核糖体失活蛋白中加入缓冲液调节pH至7.09.0，然后加入质量份为5~50份的聚乙二醇或其衍生物，在温度025'C下振摇反应3~30分钟，将反应混合液进行分离，即得聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白(a-MC-PEG)。其中该方法所用的a-MC可以是从苦瓜籽中提取获得的，也可以是通过基因重组方法或其它方法获得的与其结构相似的多肽。该方法所用的聚乙二醇或其衍生物的重均分子量为2，000100，000。其中聚乙二醇衍生物为琥珀酸亚胺类聚乙二醇((mPEG)2-Lys-NHS)、醛类聚乙二醇(PEG-ALD)、氟磺酸类聚乙二醇(PEG-TRES)、环氧类聚乙二醇(PEG-EPOX)中的任一种。该方法所用的缓冲液为硼砂缓冲液或磷酸缓冲液或其他适宜的缓冲液。制备a-MC-PEG结合物的代表性反应按下式进行0CH3,CH2CH2—0—C—NHn〖H2]3CH20IzII^CH—C—0—N'CH3+OCH2CHtO—C-NH0+頭-s如-a-MC(mPEG)2-Lys-NHS丄pH79(mPEG)2-Lys誦a-MC式中n-442200。(mPEG)2-Lys-NHS中m代表单甲氧基(monomethoxy)的缩写，NHS酯(琥珀酸亚胺酯)代表PEG分子上的活泼基团，它与a-MC分子表明的Lys(赖氨酸)侧链的氨基发生共价反应。除了NHS酯外，PEG分子上的活泼基团也可以是醛(Aldehyde)、甘氨酰酯(Glycidylester)等。采用将反应混合液进行分离的方法既可以为色谱法，也可以为其他分离方法，如离子交换法、高压液相色谱法等。采用色谱法时所用的层析介质为SephacrylS-200、Superdex200、SephadexG-200、以Q为介质的RP-HPLC或以Cg为介质的RP-HPLC中的任一种，流动相为含氯化钠的缓冲液或其他适宜的洗脱剂。层析介质和流动相不限于这些品种，也可采用其他种类的。本发明提供的a-MC-PEG结合物不仅保持了a-MC的6080%生物活性，且与未修饰的a-MC相比其免疫原性和毒副作用也显著降低。本发明提供的制备a-MC-PEG结合物的方法也简单方便，易于控制反应和规模生产。图1为本发明经SephacrylS200层析分离获得的a-MC-PEG和未经修饰的a-MC的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图，图中泳道1为作为对照的a-MC，泳道2为a-MC和a-MC-PEG,泳道3为经分离后的a-MC-PEG,泳道4为未经修饰的a-MC;图2为本发明a-MC-PEG和a-MC在不同浓度时，对小鼠黑色素瘤B16的生长抑制作用示意图3为本发明a-MC-PEG和a-MC在不同浓度时，对人表皮癌细胞A431的生长抑制作用示意图4为本发明a-MC-PEG和a-MC在不同时间时，对小鼠黑色素瘤B16的生长抑制作用示意图5为本发明a-MC-PEG和a-MC在不同时间时，对人表皮癌细胞A431的生长抑制作用示意图6为对照组人表皮癌细胞A431在放大倍数200倍的相差显微照片；图7为a-MC-PEG作用后的人表皮癌细胞A431在放大倍数200倍的相差显微照片；图8为a-MC作用后的人表皮癌细胞A431在放大倍数200倍的相差显微照片；图9为对照组小鼠黑色素瘤细胞B16在放大倍数200倍的相差显微照片；图10为a-MC-PEG作用后的小鼠黑色素瘤细胞B16在放大倍数200倍的相差显微照片；图11为a-MC作用后的小鼠黑色素瘤细胞B16在放大倍数200倍的相差显微照片。以上图25是以三次独立实验的结果经spss软件处理后的mearthS.E.M.形式表达。具体实施例方式下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。实施例1取a-MC1.0ml(2.0mg/mL)，加入浓度O.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至8.0，然后加入20KD的(mPEG)2-Lys-NHS5mg,在温度3.0'C下振摇反应10分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，在层析图谱上出现三个洗脱峰，依先后顺序分别为a-MC-PEG、a-MC和NHS。将前两个洗脱峰分别收集，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG和可以回收的a-MC。将分别得到的a-MC-PEG、a-MC用SDS-PAGE(分离胶7.5%，浓缩胶4%)检测，结果见图l。色谱柱条件如下层析填料SephacrylS-200柱规格1.6x60cm流动相0.15mol/LNaCIpH7.20.01mol/L磷酸缓冲液流速1.5ml/min检测波长280nm收集2ml/管。实施例2取a-MC1.0ml(3.0mg/mL)，加入浓度O.lmol/L硼砂缓冲液调节pH至8.5，然后加入20KD的(mPEG)2-Lys-NHS5mg，在温度4.(TC下振摇反应15分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l，略。实施例3取a-MC1.0ml(1.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至9.0，然后加入40KD的(mPEG)2-Lys-NHS10mg,在温度10.0。C下振摇反应25分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l，略。实施例4取a-MC1.0ml(2,0mg/mL)，加入浓度O.lmol/L磷酸缓冲液调节pH至8.0，然后加入20KD的(mPEG)2-Lys-NHS20mg，在温度25'C下振摇反应30分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l，略。实施例5取a-MC1.0ml(5.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L磷酸缓冲液调节pH至8.5，然后加入20KD的ALD-PEG30mg，在温度O'C下振摇反应20分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l，略。实施例6取a-MC1.0ml(2.0mg/mL)，加入浓度O.lOmol/L磷酸缓冲液调节pH至8.0，然后加入20KD的TRES-PEG20mg，在温度(TC下振摇反应20分钟，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l，略。实施例7取a-MC2.5ml(2.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至8.5，然后加入20KD的(mPEG)2-Lys-NHS50mg,在温度O'C下振摇反应30分钟，加甘氨酸(Gly)终止反应(Gly终浓度达lmol/L),将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例l,略。实施例8取a-MC2.5ml(2.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至8.5，然后加入20KD的(mPEG)2-Lys-NHS50mg，在温度5'C下振摇反应20分钟，加Gly终止反应(GIy终浓度达lmol/L)，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件如下层析填料SephadexG-200柱规格1.6x60cm流动相0.15mol/LNaCIpH7.50.01mol/L磷酸缓冲液流速1.5ml/min检测波长280nm收集2ml/管。用SephadexG-200分子筛层析法可将修饰产物有效地得到分离。其结果在层析图谱上出现三个洗脱峰，依次先后顺序分别为a-MC-PEG、a-MC-和NHS。将上述前两个洗脱峰分别收集，用SDS-PAGE(分离胶7.5%，浓縮胶4%)检测，可获得类似图1的结果。实施例9取a-MC2.5ml(2.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至8.5，然后加入10KD的(mPEG)2-Lys-NHS50mg，在温度5"C下振摇反应20分钟，加Gly终止反应(Gly终浓度达lmol/L)，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例8，略。实施例10取a-MC2.5ml(1.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至9.0，然后加入40KD的(mPEG)2-Lys-NHS50mg，在温度IO'C下振摇反应18分钟，加Gly终止反应(Gly终浓度达lmol/L)，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件如下层析填料Superdex200柱规格1.6x60cm流动相0.15mol/LNaCIpH6.50.01mol/L磷酸缓冲液流速1.5ml/min检测波长280nm收集2ml/管。用Superdex200分子筛层析法可将修饰产物有效地得到分离。其结果在层析图谱上出现三个洗脱峰，依次先后顺序分别为a-MC-PEG、a-MC和NHS。将上述前两个洗脱峰分别收集，用SDS-PAGE(分离胶10%,浓缩胶4%)检测，可获得类似图1的结果。实施例11取a-MC2.5ml(1.0mg/mL)，加入浓度0.05mol/L硼砂缓冲液调节pH至9.0，然后加入5KD的(mPEG)2-Lys-NHS50mg,在温度IO'C下振摇反应18分钟，加Gly终止反应(Gly终浓度达lmol/L)，将反应混合液用色谱法上柱进行分离，即得聚乙二醇修饰的a-MC-PEG。色谱柱条件同实施例IO，略。实施例12将小鼠黑色素瘤(Mousemelanomacell-linesB16)在含10.0。/o小牛血清的DMEM培养基(pH7.07.2)中，于37'C，5%C02培养箱中培养，取对数生长期细胞稀释到2x104个/ml，接种到96孔板，于37'C下培养7小时，然后分别加入a-MC和a-MC-PEG，分别设四个浓度梯度(43nmo1、4.3jxmo1、0.43拜o1、0.043,01)培养96h，并且在浓度为4.3^imol时设定48，72,96h三个时间点。每浓度5个复孔，阴性对照孔中加入无细胞培养基，阳性对照孔中加入5-氟尿嘧啶。然后在37'C，5。/。C02条件下培养后加入浓度为5.0mg/ml的噻唑蓝溶液2(^1，继续培养4h，每孔再加入三联液(10%SDS、5%异丁醇、0.1%盐酸溶液)10(^1，用酶标仪测570nm处光吸收值，按肿瘤抑制率KOD57Qc。nt^—OD570皿pteyOD57()contrdXl00Q/。计算抑制率，结果见图2、4;并用显微镜观察细胞的形态变化，其结果见图911。图2、4的结果表明，a-MC和a-MC-PEG对小鼠黑色素瘤细胞株都表现一定的抑制作用，并且呈现剂量依赖性和时间依赖性关系。a-MC-PEG对该种肿瘤细胞的抑制效果约为a-MC的70。/。左右。从图911的相差显微镜观察的结果也可以看到，肿瘤细胞对照组中细胞生长良好，而实验组细胞发生明显萎缩，或离壁变圆，排列失去方向性，呈现典型的细胞凋亡形态。实施例13将人表皮癌细胞(humanepidermalcarcinomacell-lineA431)在含10%小牛血清的DMEM培养基(pH7.2)中，于37'C，5%C02培养箱中培养，其它操作过程同实施例12。图3、5的结果表明，a-MC和a-MC-PEG对人表皮癌细胞A431都表现一定的抑制作用，并且呈现剂量依赖性和时间依赖性关系。a-MC-PEG对该种肿瘤细胞的抑制效果约为a-MC的60%左右。从图6~8的相差显微镜观察的结果也可以看到，肿瘤细胞对照组中细胞生长良好，而实验组细胞发生明显萎縮，或离壁变圆，排列失去方向性，呈现典型的细胞凋亡形态。实施例14Bulb/C小鼠，雄性，体重20士2克，随机分为3组(10只/组)，即a-MC组，a-MC-PEG组，空白对照组。基础免疫用a-MC和a-MC-PEG分别与等量福氏完全佐剂充分研磨呈油包水状，采用四肢腹部皮下多点注射方式，注射抗原剂量2mg/kg。于首次免疫的2周、4周换以福氏不完全佐剂进行加强免疫，注射抗原量、方法不变；最后一次免疫间隔于1014天用毛细管刺入小鼠内毗采血，分离血清。釆用间接ELISA法检测抗体效价，其结果见下表。表a-MC和a-MC-PEG免疫Bulb/C小鼠后的抗体滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从上述实验结果可以看出，a-MC-PEG免疫动物其个体抗体滴度均有不同程度的降低(P<0.05)，说明a-MC经PEG修饰后的a-MC-PEG可明显降低其免疫原性和毒副作用。权利要求1、聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于在苦瓜籽核糖体失活蛋白的氨基上连接有至少一条聚乙二醇分子链。2、根据权利要求l所述的聚乙二醇修饰的蛋白苦瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于连接的聚乙二醇分子链的重均分子量为2，000100，000。3、制备权利要求1~2中任一项所述的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该方法是先在质量份为1~4份苦瓜籽核糖体失活蛋白中加入缓冲液调节pH至7.09.0，然后加入质量份为5-50份的聚乙二醇或其衍生物，在温度025。C下振摇反应330分钟，将反应混合液进行分离，即得聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白。4、根据权利要求3所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该方法所用的聚乙二醇或其衍生物的重均分子量为2，000100，000。5、根据权利要求3所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该方法所用的聚乙二醇衍生物为琥珀酸亚胺类聚乙二醇、醛类聚乙二醇、氟磺酸类聚乙二醇或环氧类聚乙二醇中的任一种。6、根据权利要求3或4或5所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该方法所用的缓冲液为硼砂缓冲液或磷酸缓冲液。7、根据权利要求3或4或5所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于将反应混合液进行分离的方法为色谱法。8、根据权利要求6所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其.特征在于将反应混合液进行分离的方法为色谱法。9、根据权利要求7所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该色谱法所用的层析介质为SephacrylS-200、Superdex200、SephadexG-200、以Cj为介质的RP-HPLC或以Q为介质的RP-HPLC中的任一种，流动相为含氯化钠的缓冲液。10、根据权利要求8所述的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该色谱法所用的层析介质为SephacrylS-200、Superdex200、SephadexG-200、以C4为介质的RP-HPLC或以C8为介质的RP-HPLC中的任一种，流动相为含氯化钠的缓冲液。全文摘要本发明公开的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，是一种免疫原性低、具有抗肿瘤和抗病毒活性的聚乙二醇和蛋白质的结合物，其特征在于在α-苦瓜素分子表面的氨基上连接有至少一分子聚乙二醇。本发明还公开了聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的制备方法。本发明提供的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白不仅保持了未修饰前苦瓜籽核糖体失活蛋白的60～80％抗肿瘤生物活性，且与未修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白相比其免疫原性和毒副作用已显著降低。本发明提供的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法也简单方便，易于控制和规模生产。文档编号C07K17/08GK101508735SQ200910058700公开日2009年8月19日申请日期2009年3月26日优先权日2009年3月26日发明者孟延发申请人:四川大学