重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种重组融合毒素VEGF165-Hielittin及其制备方法和应用。
背景技术：
恶性肿瘤的预防与治疗一直是世界难题，血管生成对肿瘤的生长和转移有着至关重要的作用。肿瘤发生时能促进血管生成因子分泌，其中最主要的是血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF )。大量研究结果表明 VEGF 通过其加速新血管生长的作用而促进肿瘤细胞的增殖和扩散，与多种实体瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、 结肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌的发生、发展与转移密切相关。而以血管定向的靶向药物，尤其以VEGF受体为靶向的融合毒素兼具与VEGF受体结合，阻断VEGF/VEGFR信号通路与杀伤血管内皮细胞的双重作用，除了抑制肿瘤新生血管形成外，还能够破坏已生成的肿瘤血管，是更有前景的治疗手段，同时在视网膜疾病、艾滋病等方面亦有潜在的应用价值。VEGF 的mRNA经过剪切可形成四种不同的异构体，VEGF121, VEGF165, VEGF189和VEGF2tl6,它们的主要区别是与肝素及细胞外基质的结合力不同。已有研究报道在这四种VEGF的异构体中，以 VEGF121和VEGF165为靶向载体，可以产生更强的细胞毒性效果，这可能与VEGFm、VEGF165有更多的特异性受体有关。国外已有学者将VEGF165与白喉毒素结合形成大分子融合蛋白靶向抑制肿瘤血管的生成，Hotz等也将VEGF121与志贺祥菌毒素融合并进行了抗肿瘤活性检测，但是这些常用的毒素分子量大，而且必须首先要通过细胞内化作用才能进入细胞发挥作用，这些都影响了其抗肿瘤作用的发挥。蜂毒肽(melittin)是由沈个氨基酸组成的小分子毒素，具有分子量小、易于深入实体瘤内部的优点，其发挥作用的主要机理是使细胞膜的通透性增加，细胞内容物泄露， 细胞裂解，无需经过细胞内化而直接发挥作用，这使得melittin非常适合作为“弹头”用来制造融合毒素进行抗肿瘤的靶向治疗。但目前还没有相关方面的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术仅仅以阻断VEGF/VEGFR信号通路抑制肿瘤新生血管为目的的靶向治疗方法存在的问题，提供一种兼具血管靶向与破坏已生肿瘤血管，并能杀死肿瘤细胞的双重作用的新型重组融合毒素VEGF165-melittin，为抗肿瘤靶向治疗技术的研究和发展提供基础。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种重组融合毒素VEGF165-melittin，是通过连接肽在蜂毒素短肽melittin的氨基端连接VEGF165得到，或通过连接肽在VEGF165的氨基端连接蜂毒素短肽melittin得到；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。也就是说，融合毒素分子中，VEGF165与蜂毒素的连接次序或位置是可以互换的。
其中所述VEGF165和蜂毒素短肽melittin分别与天然人VEGF165和天然蜂毒素至少有90%的序列同源性。所述重组融合毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。或为将SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。本发明还保护上述重组融合毒素VEGF165-Hielittin的编码基因。该编码基因的核苷酸序列为编码SEQ ID N0:2所示蛋白序列的基因，具体核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示， 或者与SEQ ID N0:3所示序列具有90%以上同源性且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列。或者在高严谨条件下可以与SEQ ID NO:3所示序列杂交的核苷酸序列。一种重组融合毒素VEGF165-Hielittin的表达载体，由VEGF165Ielittin的编码基因插入到出发载体的多克隆位点构成，所述出发载体优选为pPICZa，pPIC9或pHIL-sl。含有上述表达载体的转基因细胞系或宿主菌。本发明所述重组融合毒素VEGF165-Hielittin可以通过DNA重组技术制备，所使用的表达系统是酵母表达系统，优选毕赤酵母，而毕赤酵母X-33最佳。可以使用本领域熟知的方法如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法和构建筛选cDNA 文库等方法获得编码人VEGF165的多聚核苷酸和编码蜂毒素melittin的多聚核苷酸。用作 PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等，如从人肝癌组织和工蜂毒腺cDNA文库获得，也可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，借以提高产物的表达效率。必要时，可采用本领域周知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。可以使用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在保持各自阅读框不变的前提下，在编码序列的两侧引入适当的限制性内切酶位点，通过酶切产生粘性末端，并在DNA连接酶作用下，实现编码人VEGF165和编码蜂毒素的多聚核苷酸的粘性末端彼此连接，得到编码本发明融合毒素的基因。如果需要，可在本发明的融合毒素基因两侧引入适当的限制性内切酶识别位点。 可用本领域公知的方法将含编码融合毒素序列的基因序列克隆到各种适当的表达载体中。 所用标准的分子克隆方法参见J.萨姆布鲁克等《分子克隆试验指南》第三版，科学出版社， 2002。许多表达载体和其对应的宿主如酵母表达载体pPICZa，pPIC9，pHIL-sl (Invitrogerl Corp. San Diego, California, USA.)均可从市场上购得。可以将编码本发明融合毒素或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表达载体中。本发明优选的巴斯德毕赤酵母表达系统可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由大约0. 9kb的 5’醇氧化酶操纵子(A0X1)序列和大约0. 3kb的转录终止基因的3’序列组成的表达盒，因此可以便于目的基因在酵母染色体中整合与表达。表达融合毒素的宿主可以是酵母、细菌、动物细胞、植物细胞等，但本发明优选的是酵母。融合毒素或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，但最好是在信号肽的帮助下从宿主细胞内分泌出来。本发明优选的信号肽是α因子(a MF)。α因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S. cerevsia)的α性成熟因子前导序列。 编码融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
得到携带融合毒素基因的重组表达载体后，可使用通常的方法，如锂盐法、PEG法、 原生质球法和电穿孔法等方法转化宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法。可通过人们熟知的技术加以鉴定，如收集并裂解细胞，提取DNA，然后用PCR方法鉴定被成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞。或者，可用抗人VEGF165或抗蜂毒素的抗体检测细胞培养上清或细胞破碎液中的蛋白。可以使用摇瓶或生物反应器，培养含有本发明DNA构建体的宿主细胞，以生产本发明的融合毒素。所使用的培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质， 包含氮源、碳源、PH调节成分等，培养基配方应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)生长，第二阶段主要用于产物的合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细菌或细胞培养物中分离、纯化融合蛋白，如盐析、有机溶剂沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。经过多种方案的优化组合，最终确定出效率最高的一种重组融合毒素 VEGF165-Hielittin的制备方法，步骤如下
(1)以SEQID NO:4 5为引物，扩增VEGF165基因；
(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，两端分别连接限制性酶切位点和损al，连接到载体pPICZa的多克隆位点，得到重组载体；
(3)分别用&ORI和损ol对VEGF165基因和重组载体进行双酶切，连接后，电穿孔法转化宿主毕赤酵母菌，构建VEGF165-Melittin基因工程菌；
(4)培养VEGF165-Melittin基因工程菌，培养基为BMGY培养基，下培养，诱导其产生可溶性重组融合蛋白VEGF165-Melittin ；
(5)将步骤(4)的培养物离心、收集上清，进行亲和柱层析纯化VEGF165-Melittin蛋白， 柱层析所述填料为Ni-NTA树脂，吸附条件为pH 5. 5-8. 5之间，洗脱条件为降低pH、逐步提高咪唑的浓度或加入EDTA或者EGTA，pH为4_6之间，咪唑浓度为0. 02-0. 5M ；
(6)采用分子量1000道尔顿的超滤膜超滤，采用半透膜透析(透析液10mMTris -HCl, 150mM NaCl)，冻干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。生物学实验表明，本发明的融合毒素可以与肝癌细胞表面的受体靶向结合并且能够抑制肝癌细胞的生长，可用于制备靶向抗肿瘤药物。本发明中的重组融合毒素VEGF165-Hielittin可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰后产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用的修饰剂可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本发明中的重组融合毒素VEGF165-Hielittin或其衍生物可以单独使用，优选的为与一种或多种药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合毒素相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们须无菌且无致热原。药物制剂可通过本领域己知的方法制备。这些方法包括将融合毒素与一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10%或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等。本发明中的重组融合毒素VEGF165-Hielittin及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入等方法给药。优选的方
5法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明将人VEGF165分子，或其有至少90%序列同源性的类似物与蜂毒素或其有至少 90%序列同源性的类似物相融合，所形成的融合毒素既保留了与VEGFR、EGFR相结合的活性，又保留了蜂毒素溶解细胞的活性。因此本发明的融合毒素既可以通过人VEGF165与表达 VEGFR、EGFR的肿瘤细胞结合，在肿瘤细胞周围富集高浓度的VEGF165-蜂毒素，借助蜂毒素的溶解细胞的活性，达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的，同时，当VEGF165-Hielittin与VEGFR、 EGFR结合后，还可以与内源性的VEGF竞争VEGFR、EGFR的结合位点，从而阻断VEGF/VEGFR 信号的酪氨酸激酶活化作用，阻断多种VEGFs、EGFs过强信号，最终达到抑制肿瘤的增殖、 迁移，尤其抑制新生血管的生成的作用。实验研究证实本发明的VEGF165-蜂毒素融合毒素具有高效结合、靶向杀伤肿瘤细胞的活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明将VEGF165与小分子毒素melittin融合，构建新型重组毒素VEGF165-Hielittin， 在真核表达体系巴氏毕赤酵母中获得可溶性表达，并对其肿瘤细胞的杀伤作用进行检测， 筛选出具有更强靶向性和肿瘤细胞杀伤活性的新型重组毒素，将有助于进一步研究和发展相关的抗肿瘤靶向治疗技术，具有较好的市场前景。我们的实验结果表明，本发明获得的融合毒素VEGF165-Hielittin同时具备与肿瘤细胞的VEGFR、EGFR结合，释放蜂毒素杀伤肿瘤细胞的作用，并且当VEGF165-Hielittin与 VEGFR、EGFR结合后，阻断VEGF/VEGFR信号的酪氨酸激酶活化作用，阻断多种VEGFs、EGFs过强信号，最终达到抑制肿瘤的增殖、迁移，尤其抑制新生血管的生成的作用。本发明将VEGF/ VEGFR系统作为治疗肿瘤的靶点，构建融合毒素VEGF165-Hielittin，实现特异性靶点、高效结合、靶向杀伤肿瘤细胞，为肿瘤的治疗开辟一个全新的设计思路与途径。


图1. RT-PCR扩增VEGF165基因图谱，其中，泳道1为VEGF165PCR产物，泳道2为DNA 分子量标准品。图2. pPICZ α /VEGF165-Melittin表达质粒的酶切鉴定图，泳道1为Xho I和Xba I双酶切的重组质粒pPICZ α /VEGF165-Melittin ；泳道2为DNA分子标志物；泳道3为未酶切的重组质粒。图3. VEGF165-Hielittin的表达鉴定图，其中，泳道1为空载体转化菌株诱导后；泳道3为蛋白质分子量标准品；泳道2、4、5为重组质粒pPICZ α /VEGF165-Hielittin转化菌株诱导后的条带。图 4. VEGF165-Hielittin 的纯化及 western-blotting 鉴定图。其中，图 A 为纯化后的VEGF165-Hielittin鉴定图谱，泳道1为纯化的VEGF165-Hielittin，泳道2为蛋白质分子量标准品；图B为western-blotting鉴定图，泳道1为空载体转化菌株诱导后蛋白检测， 泳道2、3为纯化VEGF165-Hielittin蛋白检测。图 5. RT-PCR 检测肿瘤细胞系 AsPC-1、MHCC97-H 禾Π HepG-2 中 VEGF、VEGFRl、 VEGFR2的表达情况。图6. MTT法测定VEGF-Melittin融合毒素对肿瘤细胞生长的抑制作用，其中为A肝癌细胞H印G-2、B为胰腺癌细胞AsPC-I，C为肝癌细胞MHCC97-H。
具体实施例方式以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。实施例1
(1)取VEGF高表达的肝癌细胞H印G2，使用Trizol试剂(Invitrogen Corp. San Diego, California, USA.)，以一步法提取总RNA。具体步骤如下具体地说，将培养状态良好的 HepG2细胞计数后，约IO6 IO7个细胞加入ImL Trizol，然后移入1. 5mL无RNA酶EP管中。再加入200 μ L氯仿，剧烈振荡摇勻，室温下放置30秒。4°C离心(12 000 r/min) 5分钟后，将上清液小心转移到另一个无RNA酶的EP管中。向其中加入等体积异丙醇，室温放置5分钟，并于4°C离心(12 000 r/min) 5分钟，弃去上清。加入70% (体积)乙醇ImL洗涤沉淀两次，4°C离心(12 000 r/min) 5分钟。室温下空气蒸发残存乙醇后，将沉淀溶于50 μ L DEPC水中，进行RNA的分析与定量，取1 μ L样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定0拟60 和0拟80，按下列公式计算其浓度和纯度RNA含量ΚΝΑ(μβ/πιυ=40Χ0^60Χ稀释倍数， 0D260/0D280=1. 8 2. 0表示纯度合格。以琼脂糖凝胶电泳法，观察RNA的完整性。(2) RT-PCR 法克隆人 VEGF165 基因取如上提取的总 RNA lyg，WAlyL Oligo dT，70°C 变性 lOmin，冰浴 Imin ；然后加入 10XRNA PCR 缓冲液 2yL，MgCl2 (25 mmol/L) 4μ L, RNA 酶抑制剂 QOU/μ L)0. 5μ L，dNTPs (各 10mmol/L) 2 μ L，AMV 逆转录酶 QOOU/ μ L) 1 μ L，Oligo dT (20pmol/μ L) 1 μ L，无RNA酶灭菌水加入至终体积20 μ L，建立逆转录 (RT)反应体系。于PCR仪上42 °C反应60分钟，然后99 °C 5分钟使逆转录酶灭活，合成cDNA。通过在NCBI上搜索到VEGF165的序列(序列号NM_001204384. 1)，设计上游引物 5，-AAT CTC GAG AAC TTT CTG CTG TCT TGG G_3，( SEQ ID N0:4)，下游引物 5，-AAT GAA TTC CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，( SEQ ID N0:5);委托上海英骏公司合成。再按如下 PCR 体系扩增 VEGF165 基因上述 cDNA 反应液 20 μ L ；MgCl2 (25 mmol/L) 6 μ L ； 10 X LA PCR 缓冲液 8 μ L ；上游引物 1 μ L (20pmol/μ L)；下游引物 1 μ L (20pmol/μ L) ；TaKaRa LA Taq (5U/ μ L) 1 μ L ；灭菌超纯水至终体积 100 μ L0 PCR 条件是 94°C，5min，94°C，30s， 57°C，lmin，72°C，30s，35个循环，72°C，IOmin ；1. 0%的琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小与预计产物大小是否相吻合，扩增结果见图1，可见约500bp条带。(3)克隆载体的构建与鉴定回收RT-PCR扩增的人VEGF165基因片段后，与T载体 16°C连接30分钟。连接反应体系包括人VEGF165基因RT-PCR产物0. 1 0. 3pmol ；T载体 0. 03pmol ；溶液I (含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载体试剂盒)5 μ L ；灭菌超纯水至终体积10 μ L0按照常规方法，制备大肠杆菌DH5 α感受态细胞，加入上述连接产物，进行常规方法转化。然后取200 μ L已转化的感受态细胞涂布于含X-Gal、IPTG和氨苄青霉素(100 μ g/ mL)的LB琼脂平板上，37°C培养箱中培养12 16小时。随机挑取转化后的白色单菌落(蓝白筛选)，接种于含氨苄青霉素(100yg/mL)的 LB培养基中，37°C强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取1 μ L溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37°C下用ZAo I和I双酶切鉴定消化2
7小时，琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定为正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA测序分析。(4)人工合成沈肽临1丨《^1基因，N端携带(GGGGQ2柔性短肽，两端分别携带酶切位点和损a I，以供与VEGF融合后连接表达载体pPICZ α构建重组载体pPICZ α / melittin，并且我们在连接肽与melittin之间引入酶切位点如al，以便可以将融合毒素分子中的VEGF165与蜂毒素的连接次序进行互换。feoRI和损al双酶切上述人工合成基因后与同样双酶切的PPICZ α载体进行常规连接，16°C连接过夜后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，Zeocin抗生素(25yg/mL)抗性筛选，随机挑取阳性克隆接种于5mL LB培养基中，37°C 震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定(37°C下用损ο I和I双酶切鉴定，消化2小时)。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于 DNA测序分析。(5)切胶回收经PCR扩增后的VEGF165基因，用feoR I和炀ο I双酶切VEGF165基因后和同样双酶切的pPICZ α /melittin重组载体按照常规方法连接，并转化到DH5 α感受态细胞，在平板上随机挑选几个克隆，抽提质粒，用损ο I和损al双酶切鉴定重组子pPICZ α / VEGF165-melittin，鉴定结果见图2，泳道3为未酶切的重组质粒，可见约750bp的条带，同时重组子通过北京六合华大公司测序确定序列准确度，测序结果与设计一致。(6)取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取20 25 μ g表达载体pPICZ α /VEGF165IeIittin，经Sac I 酶消化(线性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10 μ L超纯水溶解后置冰上备用。从毕赤酵母Χ-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5mL YPD培养基中，250rpm, 30°C震荡培养8小时，常规方法制备酵母感受态细胞。然后取80 μ L上述感受态细胞，与20 25 μ g线性化的重组表达质粒混合，移入 0. 2cm电转化杯内进行电转化。取50 100 μ L转化后的菌液涂布于含kocin(100 μ g/mL) 的YPD平板上，30°C培养箱培养2 3天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法(所使用的引物为上游引物5，-AAC TTT CTG CTG TCT TGG G -3，<SEQ ID N0:6>和下游引物 5，-CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，<SEQ ID NO: 7>，反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。(7)融合毒素VEGF165-Hielittin的表达、鉴定取上述鉴定结果阳性的克隆接种于 IOmL BMGY (pH 6. 0)培养基中，28°C震荡培养24小时，至OD600达到2. 0 6. 0时收集细胞。用等体积(IOmL) BMMY (pH 6.0)重悬细胞沉淀，28°C震荡培养，诱导表达，在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0. 5mL发酵液，离心收集上清，加入样品缓冲液制备电泳样品，SDS-PAGE^estern-blotting鉴定重组融合蛋白的分泌表达，鉴定结果见图3，图3显示诱导后的融合毒素蛋白表达条带约^kD。同时，在诱导过程中，每M 小时补充一次甲醇至终浓度0. 5%，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。(8)融合毒素的western-blotting鉴定表达产物经SDS-PAGE后，电转移至PVDF 膜上，然后用封闭液(TBS + 1%吐温20 + 10%脱脂奶粉)封闭池，接着分别与兔抗VEGF蛋白抗体、兔抗melittin抗体(用封闭液按1:2500的比例稀释)在4°C反应过夜，用洗脱液 (TBS + 1%吐温20)洗膜5次；然后加入封闭液稀释的羊抗兔(1: 6000)，室温反应1 h ，用洗脱液洗膜5次；最后将PVDF膜置于含有辣根过氧化物酶底物的显色液中显色。(9)挑取表达量高的重组子，按1%接种量将其接入装有5mL YPD培养基的培养瓶中，过夜，次日按1%转接至500mL BMGY培养基中，培养至0D_达到2. 0 6. 0，用等体积 BMMY (pH 6.0)重悬细胞沉淀，28°C震荡培养，诱导表达96小时时收集发酵液，离心收集上清。(10)融合毒素的纯化(Ni柱亲和层析结合超滤膜超滤、透析)
a、用去离子水洗柱料；加入0. 5倍柱床体积0. IM硫酸镍，充分振荡柱料；加入5倍体积去离子水洗柱，重复2遍后，平衡缓冲液平衡，破碎上清样品以0. 5mL/min上样，然后分管收集；1. 5倍样品体积平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速l-2mL/min，分管收集；用1/2倍体积洗脱缓冲液洗脱，流速l-2mL/min，分管收集流出峰。SDS-PAGE、western-blotting电泳检测纯化蛋白VEGF165-melittin，鉴定结果见图4。b、蛋白通过分子量10000道尔顿的超滤膜超滤，然后采用IOmM Tris · HCl，150mM NaCl透析后，冻干。(11) MTT法测定融合毒素VEGF165-Hie 1 ittin对肝癌细胞H印G-2、胰腺癌细胞 AsPC-I和肝癌细胞MHCC97-H生长的抑制作用
分别取指数生长期的肝癌细胞H印G-2、胰腺癌细胞AsPC-I和肝癌细胞MHCC97-H (1 X IO4)接种96孔板。每种细胞分为对照组和实验组，实验组加入VEGF165-melittin，浓度分另Ij为 0. 2μ g/mL、0. 4μ g/mL、0. 8μ g/mL、l. 6μ g/mL、3. 2μ g/mL、6. 4μ g/mL、12. 8μ g/mL， 每个浓度设5个复孔。对照组加入10%胎牛血清的H-DMEM培养液至等体积。放入37°C， 5% CO2孵箱培养。M小时后取出96孔板，向各孔内加入MTT溶液20 μ L (5 mg/mL),37°C 5% CO2孵育4小时后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入100 μ L DMS0，振荡10分钟。待沉淀完全溶解后在Bio-red 550酶标仪上测定吸光度值(0D值)。按下列公式分别计算两组在不同浓度VEGF165-Hielittin作用后的细胞生长抑制率(三次重复的平均值)。 以细胞生长抑制率对药物浓度做曲线，求出IC50。细胞生长抑制率(％)=(对照组细胞OD 值一实验组细胞OD值)/对照组细胞OD值X 100%。图5为VEGF、VEGFRU VEGFR2表达的半定量RT-PCR检测图谱。分别检测了三株肿瘤细胞系(人胰腺癌细胞系AsPC-I、人肝癌细胞系MHCC97-H和H印G-2)中VEGF、VEGFR1、 VEGFR2的表达，结果显示三株细胞系中均呈现VEGF的高表达，并且VEGFRl、VEGFR2的表达情况有所不同其中AsPC-I胰腺癌细胞和MHCC97-H肝癌细胞中VEGFRl的表达均呈阳性， 同时MHCC97-H中VEGFR2的表达也呈阳性，而H印G-2肝癌细胞中只有VEGFR2呈阳性。纯化VEGF165-Hielittin蛋白与肝癌细胞H印G-2、胰腺癌细胞AsPC-I和肝癌细胞 MHCC97-H共孵育后，MTT法测定VEGF165-Hielittin融合毒素对肿瘤细胞生长的抑制作用结果如图6所示。可见VEGF165-Hielittin对VEGFR2高表达的肝癌细胞H印G-2生长抑制作用最强；对VEGFRl高表达而VEGFR2表达相对较低的肝癌细胞MHCC97-H的生长抑制作用次之；而VEGFRl高表达，VEGFR 2阴性表达的胰腺癌细胞AsPC-I的生长情况与对照组相比最弱。结果显示，重组融合毒素VEGF165-Hielittin具有良好的肿瘤细胞杀伤作用，并且对肿瘤细胞的杀伤活性显示出靶向作用于VEGFR2的特征。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种重组融合毒素VEGF165-Hielittin，其特征在于是通过连接肽在蜂毒素短肽 melittin的氨基端连接VEGF165得到，或通过连接肽在VEGF165的氨基端连接蜂毒素短肽 melittin得到；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根据权利要求1所述重组融合毒素VEGF165-melittin，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
3.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF165-Hielittin的编码基因。
4.根据权利要求3所述重组融合毒素VEGF165-Hielittin的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF165-Hielittin的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于是由权利要求3所述重组融合毒素 VEGF165-Hielittin的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到，所述出发载体为pPICh， pPIC9 或pHIL-sl。
7.含有权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。
8.含有权利要求5所述表达载体的宿主菌。
9.一种重组融合毒素VEGF165-Hielittin的制备方法，其特征在于步骤如下(1)以SEQID NO:4 5为引物，扩增VEGF165基因；(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，两端分别连接限制性酶切位点和损al，连接到载体pPICZa的多克隆位点，得到重组载体；(3)分别用和损ol对VEGF165基因和重组载体进行双酶切，酶切产物连接后，电穿孔法转化宿主毕赤酵母菌，构建VEGF165-Melittin基因工程菌；(4)培养VEGF165-Melittin基因工程菌，培养基为BMGY培养基，28°C下培养，诱导其产生可溶性重组融合蛋白VEGF165-Melittin ；(5)将步骤(4)的培养物离心、收集上清，进行亲和柱层析纯化VEGF165-Melittin蛋白， 柱层析所述填料为Ni-NTA树脂，吸附条件为pH 5. 5^8. 5之间，洗脱条件为降低pH、逐步提高咪唑的浓度或加入EDTA或者EGTA，pH在4 6之间，咪唑浓度为0. 02 0. 5M ；(6)采用分子量1000道尔顿的超滤膜超滤，采用半透膜透析，透析液为IOmMTris -HCl 禾口 150mM NaCl、冻干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。
10.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF165-Hielittin在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组融合毒素VEGF165-melittin及其制备方法和应用，属于基因工程药物领域。本发明通过连接肽将VEGF165与小分子毒素melittin融合，构建新型重组毒素VEGF165-melittin，可通过巴氏毕赤酵母进行可溶性表达。经检测，本发明的VEGF165-melittin同时具备与肿瘤细胞的VEGFR、EGFR结合，释放蜂毒素杀伤肿瘤细胞的作用，并且当VEGF165-melittin与VEGFR、EGFR结合后，阻断VEGF/VEGFR信号的酪氨酸激酶活化作用，阻断多种VEGFs、EGFs过强信号，最终达到抑制肿瘤的增殖、迁移，尤其抑制新生血管的生成的作用，为肿瘤的治疗开辟一个全新的设计思路与途径。
文档编号C07K1/36GK102558359SQ20121001056
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者孙艳, 王丁丁, 胡丽莉, 黄宏靓 申请人:广东药学院