一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法与流程

文档序号:11144946阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌,其特征在于,在大肠杆菌中同时过表达异戊二烯合成途径所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。

2.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌,其特征在于,所述异戊二烯合成途径,是指异戊二烯MVA合成途径或MEP合成途径。

3.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌,其特征在于,是在大肠杆菌中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。

4.根据权利要求3所述基因工程菌,其特征在于,所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYCDuet-1质粒的多克隆位点上;所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因连接于pTrc质粒的多克隆位点上;所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。

5.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌,其特征在于,所述大肠杆菌,共表达1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。

6.根据权利要求5所述基因工程菌,其特征在于,所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYDuet-1质粒的多克隆表达位点上;所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。

7.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法,其特征在于,步骤如下:

1)将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS以及异戊二烯合成酶基因isps4克隆到质粒pACYCDuet-1,构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS-isps4;

2)将甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1克隆到pTrcHis2B,得到重组质粒pTrc-low;

3)将丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到质粒pCOLADUet-1上,得到重组质粒pCOLA-PYC;

4)将步骤1),2)和3)所得的重组质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中,获得基因工程菌。

8.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法,其特征在于,步骤如下:

1)将丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到质粒pCOLADUet-1上,得到重组质粒pCOLA-PYC;

2)将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因dxr和异 戊二烯合成酶基因isps4克隆到质粒pACYCDuet-1,构建重组质粒pACY-dxs-dxr-isps4;

3)将步骤1)和步骤2)所制备的重组质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中,获得基因工程菌。

9.权利要求1-6所述任一基因工程菌在发酵生产异戊二烯和琥珀酸中的应用。

10.权利要求9所述应用,其特征在于,步骤如下:

1)将权利要求1所述基因工程菌接种到M9种子培养基中,在37℃、180rpm活化培养18-24h,获得种子菌液;

2)将步骤1)所得的种子菌液以10%的接种量接种到发酵培养基中,在转速300-800rpm,37℃的条件下培养至OD600为20-40,再添加总浓度为0.1-1.0mM的IPTG,关闭空气,通过氮气或二氧化碳,并利用氨水或碳酸钾控制pH在7.0,在厌氧25-37℃的条件下诱导表达。

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