培养干细胞的培养基组合物的制作方法

本发明涉及用于培养干细胞的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其中培养基组合物包括基本培养基(其中多种准完全培养基(dmem、α-mem、imdm、f12和dmem/f12)和成分确定的角质形成细胞-sfm混合)、l-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素、n-乙酰基-l-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。

相关技术的描述

具有分化成两个或更多个细胞的能力同时保持自我复制能力的细胞被称为干细胞。干细胞可大体上分为全能(totipotent)干细胞、多潜能/亚全能(pluripotent)干细胞和多能(multipotent)干细胞，其可仅分化成组织和器官中的特定细胞。作为干细胞，成体干细胞是细胞的上位概念，其涉及诱导胎儿阶段、新生儿阶段和成人阶段的组织和器官发育，维持成体组织稳态和组织损伤的再生的功能。

近来，成体干细胞在新的再生医疗技术如功能障碍或与各种疾病或事故不相容的生物组织和器官的再生和功能恢复的开发研究中一直引起关注。此外，因为预测细胞-组织替代疗法的发展超过常规经典药物疗法或手术治疗方法，使用干细胞的治疗技术的发展研究将导致干细胞的更大利用。

因此，目前已经研究了干细胞的多种功能。其中，使用间充质干细胞的细胞疗法技术开始得到关注，并且正在开发用于改善以适于借助从人体分离的间充质干细胞进行治疗的技术(wo2006/019357、韩国专利注册号0795708和韩国专利注册号0818214)。

目前，与使用成体干细胞的细胞疗法产品相关的研究和开发过程经过如下引入到患者本身的一系列过程进行：在自患者收集干细胞、血来源的单核细胞或骨髓来源的单核细胞之后，经体外培养诱导细胞增殖和/或分化，以及诱导未分化(干细胞和/或前体细胞)和/或分化细胞的植入。然而，目前使用并且最优化用于间充质干细胞的干细胞维持能力(干性)、高分裂能力和紧密形态保留的间充质干细胞培养基，由于高成本，是干细胞疗法产品研究中的经济负担(韩国专利注册号0795708)。

在这方面，本发明人最大限度地开发了可降低间充质干细胞的生产成本并进一步增强培养效率的用于干细胞培养的培养基。结果，本发明人已开发了一种混合培养基，其中通常使用目前用于培养干细胞的具有高成本和高效率的ksfm-p培养基与相对便宜的准完全产品培养基或成品干细胞培养基以一定比例混合。此外，作为通过使用混合培养基培养间充质干细胞的结果，本发明人确认了干细胞的培养效率增加，并完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种用于培养在具有高增殖能力的同时能够维持分化能力的干细胞的经济的培养基组合物。

本发明的另一目的是提供使用所述培养基组合物培养间充质干细胞的方法。

为了实现上述目的，本公开内容提供了用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基(其中选自dmem、α-mem、imdm、f12和dmem/f12的培养基与成分确定的角质形成细胞-sfm混合)、l-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素、n-乙酰基-l-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。

本发明还提供了培养间充质干细胞的方法，其中在所述培养基组合物中培养间充质干细胞。

附图简述

图1说明了在与作为准完全培养基的dmem的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。

图2说明了在与作为准完全培养基的α-mem的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。

图3说明了在与作为准完全培养基的imdm的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。

图4说明了在与作为准完全培养基的f12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。

图5说明了在与作为准完全培养基的dmem/f12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。

图6说明了在与作为准完全培养基的dmem的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量(yield)。

图7说明了在与作为准完全培养基的α-mem的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。

图8说明了在与作为准完全培养基的imdm的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。

图9说明了在与作为准完全培养基的f12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。

图10说明了在与作为准完全培养基的dmem/f12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。

图11说明了在与作为准完全培养基的dmem的混合培养基中培养脂肪来源的间充质干细胞后细胞大小的变化。

图12是显示每种混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量的图，其中将细胞产量表示为相对于ksfm-p培养基中细胞产量的百分数。

图13说明了确认混合培养基中干细胞表面标志物表达的结果。

图14说明了确认混合培养基中干细胞表面标志物表达的结果。

实施方式的详述

除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法和下文描述的实验方法是已知的并且通常用于本技术领域。

在本公开内容中，确认当在将5％fbs添加到每种培养基的环境中培养脂肪来源的间充质干细胞时，其中已用于培养常规间充质干细胞的ksfm-p培养基(韩国专利注册号0679642)与可相对廉价地以准成品的形式购买的dmem(达尔伯克改良伊戈尔培养基(dulbeco'smodifiedeagle'smedium))、imdm(伊思考夫改良达尔伯克培养基(iscove'smodifieddulbecco'smedium))、α-mem(伊戈尔培养基的α修饰)、f12(营养混合物f-12)和dmem/f12(达尔伯克改良伊戈尔培养基:营养混合物f-12)培养基混合，干细胞特性几乎没有变化，并且在细胞有效增殖的同时可持续维持细胞的大小。

因此，在一个方面，本公开内容涉及用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基(其中选自dmem、α-mem、imdm、f12和dmem/f12的培养基与成分确定的角质形成细胞-sfm混合)、l-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素、n-乙酰基-l-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。

本发明中使用的术语“干细胞”指具有自我复制能力和分化成两个或更多个细胞的能力的细胞，且“成体干细胞”指其中随着生成过程的进行形成胚胎的每个器官的阶段中或成体阶段中显示的干细胞。

本发明中使用的术语“间充质干细胞”指从人或哺乳动物组织分离的未分化干细胞，并且可源自各种组织。具体而言它们可为脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞。用于从各组织分离干细胞的技术在相关领域中是已知的。

本发明中使用的术语“脂肪来源的干细胞”指从脂肪组织分离的未分化干细胞，并且其分离方法可为例如如下。也就是说，在培养悬浮于自吸脂获得的生理盐水中的含脂肪悬浮液后，将附着于培养容器如烧瓶的干细胞层用胰蛋白酶处理，然后收集，或者可通过以下方法分离脂肪来源的干细胞：通过用刮刀刮出而直接收集悬浮于少量生理盐水中的细胞。

在本发明中，所述培养基特征在于含有0.05至1mm抗坏血酸2-磷酸、2至20％胎牛血清、10至1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、0.1至100μg/ml胰岛素、0.2至20mmn-乙酰基-l-半胱氨酸、0.01至1mm氯化钙和5ng/ml至1μg/ml氢化可的松。

在本发明中，准完全培养基dmem(达尔伯克改良伊戈尔培养基)、imdm(伊思考夫改良达尔伯克培养基)、α-mem(伊戈尔培养基的α修饰)、f12(营养混合物f-12)和dmem/f12(达尔伯克改良伊戈尔培养基；营养混合物f-12)培养基与成分确定的角质形成细胞-sfm培养基的混合物比率优选为1:0.1至10，更优选1:0.25至3。

在本发明的一个实施方案中，当使用其中准完全培养基、dmem、imdm、α-mem、f12和dmem/f12培养基与ksfm-p培养基以1:0.5、1:1、1:2、1:3和1:4的比例混合的混合培养基时，可获得与通过使用ksfm-p单一培养基培养细胞的情况相似的细胞形式，并显示比使用ksfm-p单一培养基的情况显著优异的细胞产量。

另一方面，本发明涉及培养间充质干细胞的方法，其中所述方法包括在所述培养基组合物中培养间充质干细胞。

在本发明中，所述间充质干细胞的特征可在于它们源自人类脂肪。

在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本发明。对于相关领域的普通技术人员将显而易见的是，这些实施方案仅用于说明目的，并且本发明的范围不被解释为受这些实施例限制。

实施例1：人类脂肪组织来源的间充质干细胞的分离

通过吸脂分离从腹部脂肪获得的人类脂肪组织并用pbs洗涤。将组织精细切割，并用添加1型胶原酶(1mg/ml)的dmem培养基在37℃消化2小时。用pbs洗涤后，以1000rpm离心5分钟。抽吸上清液并用pbs洗涤底部上留下的沉淀，然后以1000rpm离心5分钟。通过以100μm筛网过滤除去碎片后，用pbs洗涤细胞，然后将其在dmem(10％fbs、2mmnac和0.2mm抗坏血酸)培养基中培养。

在一夜之后，用pbs洗涤未粘附的细胞，并且每2天替换含有5％fbs、2mmnac、0.2mm抗坏血酸、0.09mm钙、5ng/mlregf、5μg/ml胰岛素和74ng/ml氢化可的松的角质形成细胞-sfm培养基并进行传代培养以制备源自脂肪组织的四连续的(foursuccessive)多能间充质干细胞。

实施例2：在混合培养基中培养人类脂肪组织来源的间充质干细胞

在单独培养基或在混合培养基中培养细胞，所述混合培养基即ksfm-p(表1)与准完全培养基、dmem(达尔伯克改良伊戈尔培养基)、imdm(伊思考夫改良达尔伯克培养基,gibco,brl)、α-mem(伊戈尔培养基的α修饰,gibco,brl)、f12(营养混合物f-12,gibco,brl)和dmem/f12(达尔伯克改良伊戈尔培养基:营养混合物f-12gibco,brl)，并确认干细胞的粘附能力、密度、形式和产量等。

[表1]本发明中使用的ksfm-p培养基的组分

(1)当使用dmem作为准完全培养基时

①ksfm-p(10％fbs)

②dmem(10％fbs)

③dmem(10％fbs)+ksfm-p(10％fbs)；混合物比率1:1

④dmem(10％fbs)+ksfm-p(10％fbs)；混合物比率1:2

⑤dmem(10％fbs)+ksfm-p(10％fbs)；混合物比率1:3

⑥dmem(10％fbs)+ksfm-p(10％fbs)；混合物比率1:4

⑦dmem(10％fbs)+ksfm-p(10％fbs)；混合物比率2:1

将1×10⁴个细胞/孔的p4的脂肪来源的间充质干细胞接种在含有各培养基的6孔板上，并且培养总共5天，并分别测量干细胞的形态2天和5天。培养5天后，用dpbs洗涤培养的干细胞，向其中添加200μltriple溶液，然后在培养基中在37℃反应5分钟以使细胞解吸附。800μldmem(10％fbs)添加至各孔中以中和triple溶液，转移至无菌1.5mlep管中，并以800rpm离心3分钟。离心后，除去上清液，添加500mldpbs以重悬分离的细胞。将其中悬浮10μl细胞的dpbs与10μl台盼蓝混合，并测量细胞数目、存活率和细胞大小。

(2)当使用α-mem,imdm,f12和dmem/f12作为准完全培养基时

①ksfm-p(5％fbs)

②准完全培养基(5％fbs)

③准完全培养基(5％fbs)+ksfm-p(5％fbs)；混合物比率1:1

④准完全培养基(5％fbs)+ksfm-p(5％fbs)；混合物比率1:2

⑤准完全培养基(5％fbs)+ksfm-p(5％fbs)；混合物比率1:3

⑥准完全培养基(5％fbs)+ksfm-p(5％fbs)；混合物比率2:1

⑦准完全培养基(5％fbs)+ksfm-p(5％fbs)；混合物比率3:1

将3×10⁵个细胞/孔的p4的脂肪来源的间充质干细胞接种在含有各培养基的t75板上，培养直至观察到90％密度，并测量各干细胞的形态。培养5天后，用dpbs洗涤培养的干细胞，向其中添加200μltriple溶液，然后在培养基中在37℃反应5分钟以使细胞解吸附。将800μldmem(10％fbs)添加至各孔中以中和triple溶液，转移至无菌1.5mlep管，并以800rpm离心3分钟。离心后，除去上清液，添加500mldpbs以重悬分离的细胞。将悬浮于dpbs的10μl细胞与10μl台盼蓝混合，并测量细胞数目、存活率和细胞大小。

(1)干细胞的形态

在培养过程中拍摄培养过程中各培养基中细胞形态的变化并观察。结果，如图1所示，证实与ksfm-p或dmem培养基相比，其中两种培养基混合的组(组3和组4)中细胞的初始粘附能力(培养2天)优异。如图2至5所示，证实与ksfm-p或各准完全培养基相比，其中两种培养基混合的组(组3至7)中细胞增殖能力优异。

关于细胞的形态，与其它组培养基中培养的细胞相比，在细胞的大小方面，显示各准完全培养基中培养的细胞具有相对较大和细长的形式，而在其它组中，它们与ksfm-p培养基中培养的细胞相似。相比之下，证实与当在ksfm-p或各准完全培养基和单一培养基中培养时相比，当在混合培养基中培养时细胞的密度显著增加。因此，证实混合ksfm-p与准完全培养基的混合培养基对于细胞大小和生长更有效。

(2)干细胞的产量(数目)和细胞大小(大小)

将脂肪来源的间充质干细胞在各培养基中培养5天，然后使用triple溶液收集干细胞并通过使用台盼蓝技术测量数目。

对于培养的脂肪来源的干细胞的大小，在获得干细胞后，使用luna^tm自动细胞计数器(logosbiosystems,inc.usa)设定细胞的平均大小。

结果示于表2至4和图11。

结果，如表2至4所示，作为具有干细胞最佳条件的培养基的ksfm-p培养基中的细胞产量增加为准完全培养基的约两倍那么多。此外，证实在培养干细胞中，与准完全培养基相比，ksfm-p培养基是合适的。

此外，作为在其中ksfm-p培养基与准完全培养基以一定比例混合的培养基中培养干细胞的结果，证实细胞产量比在ksfm-p培养基中收集的细胞数目显著增加2-3倍。

此外，当比较ksfm-p培养基和各混合培养基的干细胞增殖能力时，证实当混合作为准完全培养基的imdm培养基时，其呈现比在其它培养基中培养的干细胞显著高的细胞产量。

因此，可理解的是，通过混合ksfm-p培养基与准完全培养基，细胞生长所需的培养条件比单独的ksfm-p培养基更有效。

结果，如表2和3所示，各培养基中培养的干细胞的大小显示约15至17μm的平均值，无显著差异。换言之，可以理解的是，当其以与用肉眼看到的细胞不同的特征获得时，各培养基对细胞大小没有显著影响。

[表2]混合培养基中的干细胞产量

[表3]混合培养基中干细胞大小

[表4]

1.α-mem混合培养基

2.imdm混合培养基

3.f12混合培养基

4.dmem/f12混合培养基

(3)干细胞的表面标志物的表达

将脂肪来源的间充质细胞在各培养基中培养5天，然后使用triple溶液收集干细胞。然后，用各表面标志物抗体(阴性标志物,cd31、cd34、cd45；阳性标志物,cd90、cd105、cd166)对其染色。用fitc缀合的二抗标记表面抗体，使用fac仪器测量表达表面抗体的细胞的分布。

结果，如图13和图14所示，表达由ksfm-p培养基中培养的干细胞表达的干细胞特异性表面标志物的干细胞的分布主要显示，对于阴性标志物cd31、cd34和cd45的0.5％或更少的表达分布，而发现干细胞阳性标志物cd90、cd105和cd166的表达分布则大多为99％或更高。

此外，即使在各混合条件(代表性1:2混合)下，与ksfm-p培养基中培养的干细胞相似的表达干细胞特异性表面标志物的干细胞的阴性标志物cd31、cd34和cd45为0.5％或更少。并且证实还发现阳性标志物cd90、cd105和cd166为99％或更高。换言之，各混合培养基中的培养条件不影响干细胞的特异性表面标志物的表达，并且不影响干细胞的分化或特征。

工业实用性

根据本发明，可能改善间充质干细胞的增殖能力和分化能力，并且能够通过以与现有培养方法相比的低价培养间充质干细胞同时保持干细胞功能而使用间充质干细胞更经济地生产细胞治疗产品。

如上所述，已详细描述了本公开的内容的具体部分。因此，对于相关领域普通技术人员显而易见的是，这种具体技术仅仅是优选的实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。