一种豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其方法与流程

本发明属于植物检疫技术领域，涉及一种豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其检测方法，特别涉及用于豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)属于小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，含有豇豆花叶病毒属(Comovirus)、蚕豆病毒属(Fabavirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，分别含有15种、5种和36种病毒。在豇豆花叶病毒属病毒中，有11种病毒的寄主范围比较窄，仅侵染豆科植物，而其他种类则侵染茄科、十字花科、葫芦科等植物。豇豆花叶病毒属病毒主要引起花叶、斑驳症状，通常不会引起环斑症状。蚕豆病毒属病毒具有非常广的寄主范围，包括双子叶植物，以及一些科的单子叶植物。蚕豆病毒属病毒引起的症状包括环斑、斑驳、花叶、畸型、萎蔫和顶端坏死。线虫传多面体病毒属病毒的寄主因病毒而异，有宽有窄，广泛分布于温带地区。环斑是线虫传多面体病毒属病毒侵染的典型症状，但通常伴随斑驳和斑点症状。豇豆花叶病毒属病毒只通过甲虫传播，特别是叶甲科的种类。蚕豆病毒属病毒则通过蚜虫传播。线虫传多面体病毒属中的12种病毒通过长针线虫传播，3种通过花粉传播，1种通过螨虫传播，而其它病毒种类的传播介体还未知。该亚科病毒中，近一半的病毒种类还可以通过种子传播。

豇豆花叶病毒亚科中的多种病毒成员具有十分重要的经济重要性，对农业生产安全和生态安全造成巨大的威胁。该亚科病毒中，有8种病毒被我国列为禁止进境的检疫性有害生物，包括：南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)、蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus,BBSV)、豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus,CPSMV)、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus,PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、番茄黑斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)。此外，还有一半还多的病毒种类在我国尚未报道发生。

目前，在豇豆花叶病毒亚科病毒日常检测中，快速的检测方法普遍使用血清学和分子生物学方法，特别是酶联免疫吸附试验(ELISA)方法和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。其中，ELISA检测需要特异的抗体，通常都是由专业的试剂公司提供。目前，国内外检测试剂公司提供的豇豆花叶病毒亚科病毒检测抗体种类还十分有限，只局限于其中几种病毒。RT-PCR方法是豇豆花叶病毒亚科病毒检测中使用非常广泛的另外一种快速检测方法。目前，国内外只是建立其中几种密切关注的病毒种类，有些病毒种类甚至还未知其基因组序列。因此，在豇豆花叶病毒亚科病毒中，多数的病毒种类没有相应的血清学，也没有快速的分子检测方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物。

本发明提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物为如下1)或2)：

1)由引物1、引物2和引物3组成；

2)由引物1、引物2、引物4和引物5组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；

所述引物4为序列4所示的单链DNA分子；

所述引物5为序列5所示的单链DNA分子。

本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂包括上述成套引物。

上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述PCR试剂中的终浓度均为10μmol/L。

本发明所提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂，具体可包括所述成套引物，以及M-MLV反转录酶、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含Mg²⁺)和Taq DNA聚合酶。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒包括上述成套引物或上述PCR试剂。

本发明所提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒，具体可含有所述成套引物或所述PCR试剂，以及作为阳性对照的豇豆花叶病毒亚科病毒的病叶冻干粉末(如含有豇豆花叶病毒的叶片冻干粉末)；和/或作为阴性对照的水。

本发明的第四个目的是提供上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用。

本发明还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒的产品中的应用。

本发明还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用。

本发明还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的产品中的应用。

本发明的五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的方法包括如下步骤：

(1)从所述待测样品中提取总RNA，采用上述引物1进行反转录反应，得到待测cDNA；

(2)以所述待测cDNA作为模板，采用上述引物1和上述引物2进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR产物；

(3)以第一轮PCR产物作为模板，采用上述引物1和上述引物3进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR产物；

或以第一轮PCR产物作为模板，采用上述引物4和上述引物5进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR产物；

(4)根据所述第二轮PCR产物的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒：

若所述第二轮PCR产物中含有大小为400～440bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有豇豆花叶病毒亚科病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有豇豆花叶病毒亚科病毒。

上述方法中，所述反转录反应的温度为42℃。

上述方法中，所述第一轮PCR反应共进行35个循环，前5个循环的退火温度为42℃，后30个循环的退火温度为50℃。

上述方法中，所述第二轮PCR反应共进行40个循环，前5个循环的退火温度为42℃，后35个循环的的退火温度为52℃。

在本发明中，以上所有的所述待测样品均可为植物样品，如感染了豇豆花叶病毒亚科病毒的植物叶片。

在本发明中，以上所有的所述豇豆花叶病毒亚科病毒均可为如下中的任一种或多种：爱琴海菊芋环斑病毒、安弟斯马铃薯斑驳病毒、安那托利亚葡萄环斑病毒、澳洲紫花苜蓿潜隐病毒、保加利亚葡萄潜隐病毒、菜豆粗缩花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、蚕豆染色病毒、蚕豆萎蔫病毒1号、蚕豆萎蔫病毒2号、蚕豆真花叶病毒、鹑豌豆花叶病毒、大豆属花叶病毒、滇芎A病毒、番茄黑环病毒、番茄环斑病毒、广藿香轻型花叶病毒、黑醋栗退化病毒、红三叶草斑驳病毒、豇豆花叶病毒、豇豆重花叶病毒、绛三叶草潜隐病毒、菊芋黄化环斑病毒、苣黄斑驳病毒、可可坏死病毒、块根落葵C病毒、蓝莓叶斑病毒、李潜隐环斑病毒、龙胆草花叶病毒、萝卜花叶病毒、马铃薯U病毒、马铃薯黑环病毒、美洲木薯潜隐病毒、木槿潜隐环斑病毒、木薯绿斑驳病毒、南瓜花叶病毒、南芥菜花叶病毒、葡萄铬黄花叶病毒、葡萄卷曲病毒、葡萄扇叶病毒、桑树环斑病毒、苏铁坏死矮化病毒、桃丛簇花叶病毒、甜菜环斑病毒、突尼斯葡萄环斑病毒、豌豆绿斑驳病毒、豌豆轻花叶病毒、芜菁环斑病毒、悬钩子环斑病毒、烟草环斑病毒、野芝麻轻型花叶病毒、意大利菊芋潜隐病毒、樱桃李潜隐病毒、樱桃叶卷病毒、油橄榄潜隐环斑病毒。

通过实验证明，本发明所提供的用于广谱检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物及其检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、广谱性好、检测周期短等特点，适用于农业生产及进出境口岸上豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测与监测。

附图说明

图1为豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的广谱性及特异性检测(试剂盒中的引物为：SecoV-Fat、SecoV-Rat和SecoV-R4at)。其中，M:DNA分子量标准100bp DNA Ladder；1.安弟斯马铃薯斑驳病毒(DSMZ PV-0057)；2.南芥菜花叶病毒(Agdia LPC 23203(C1954))；3.蚕豆真花叶病毒(DSMZ PV-0098)；4.蚕豆萎蔫病毒(ACD V012-P1)；5.蚕豆萎蔫病毒1号(DSMZ PV-0067)；6.蚕豆萎蔫病毒2号(ACD V212-P1)；7.蚕豆萎蔫病毒2号(DSMZ PV-0862)；8.蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1543))；9.蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1643))；10.蓝莓叶斑病毒(Agdia LPC 88001(C1796))；11.菜豆荚斑驳病毒(ACD V082-P1)；12.菜豆荚斑驳病毒(Agdia LPC 46400(C1858))；13.豇豆花叶病毒(Agdia LPC 24200(C1319))；14.豇豆重花叶病毒(ATCC PV-273)；15.葡萄扇叶病毒(Adgen 1147-11)；16.马铃薯黑环斑病毒(Adgen 1330-11)；17.草莓潜隐环斑病毒(Adgen 1160-11)；18.南瓜花叶病毒(Agdia LPC 26400(C2013))；19.番茄黑环病毒(Adgen 1068-11)；20.番茄环斑病毒(Agdia LPC 22000(C1545))；21.番茄环斑病毒(Agdia编号为LPC 22000(C1939))；22.烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C1714))；23.烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C2009))；24.萝卜花叶病毒(DSMZ PV-0355)；25.桃丛簇花叶病毒(Agdia LPC 87700(C1973))；26.悬钩子环斑病毒(DSMZ PV-0429)；27.蚕豆染色病毒(LOEWE 07013PC)；28.红三叶草斑驳病毒(LOEWE 07040PC)；29.樱桃锉叶病毒(Adgen 1303-11)；30.玉米褪绿矮缩病毒(Adgen 1327-11)；31.温州蜜柑矮缩病毒(中国农业科学院柑桔研究所)；32.空白对照。

图2为豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒(试剂盒中的引物为：SecoV-Fat、SecoV-Rat、SecoV-F-T3和SecoV-R4-M13-47)的广谱性及特异性检测。其中，M:DNA分子量标准100bp DNA Ladder；1.安弟斯马铃薯斑驳病毒(DSMZ PV-0057)；2.南芥菜花叶病毒(Agdia LPC 23203(C1954))；3.蚕豆真花叶病毒(DSMZ PV-0098)；4.蚕豆萎蔫病毒(ACD V012-P1)；5.蚕豆萎蔫病毒1号(DSMZ PV-0067)；6.蚕豆萎蔫病毒2号(ACD V212-P1)；7.蚕豆萎蔫病毒2号(DSMZ PV-0862)；8.蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1543))；9.蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1643))；10.蓝莓叶斑病毒(Agdia LPC 88001(C1796))；11.菜豆荚斑驳病毒(ACD V082-P1)；12.菜豆荚斑驳病毒(Agdia LPC 46400(C1858))；13.豇豆花叶病毒(Agdia LPC 24200(C1319))；14.豇豆重花叶病毒(ATCC PV-273)；15.葡萄扇叶病毒(Adgen1147-11)；16.马铃薯黑环斑病毒(Adgen 1330-11)；17.草莓潜隐环斑病毒(Adgen1160-11)；18.南瓜花叶病毒(Agdia LPC 26400(C2013))；19.番茄黑环病毒(Adgen1068-11)；20.番茄环斑病毒(Agdia LPC 22000(C1545))；21.番茄环斑病毒(Agdia编号为LPC 22000(C1939))；22.烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C1714))；23.烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C2009))；24.萝卜花叶病毒(DSMZ PV-0355)；25.桃丛簇花叶病毒(Agdia LPC 87700(C1973))；26.悬钩子环斑病毒(DSMZ PV-0429)；27.蚕豆染色病毒(LOEWE 07013PC)；28.红三叶草斑驳病毒(LOEWE 07040PC)；29.樱桃锉叶病毒(Adgen 1303-11)；30.玉米褪绿矮缩病毒(Adgen 1327-11)；31.温州蜜柑矮缩病毒(中国农业科学院柑桔研究所)；32.空白对照。

图3为豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的特异性验证。其中，M：DNA分子量标准100bp DNA Ladder；1.烟草花叶病毒；2.百合无症病毒；3.百合健康叶片；4.普通烟健康叶片；5.蚕豆健康叶片；6.番茄健康叶片；7.菜豆健康叶片；8.豇豆健康叶片；9.黄瓜健康叶片；10.南瓜健康叶片；11.甜豆健康叶片；12.空白对照。

图4为豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的灵敏度检测。其中，M：DNA分子量标准100bp DNA Ladder；1～10分别为南瓜花叶病毒10^-1～10^-10倍稀释的cDNA。

图5为检测豇豆花叶病毒亚科病毒的引物的筛选。图5A为引物对SecoV-F6/SecoV-R5的检测结果；图5B为引物对SecoV-F6-at/SecoV-R5-at的检测结果；图5C为引物对SecoV-Fat/SecoV-Rat的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

安弟斯马铃薯斑驳病毒：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0057。

菜豆荚斑驳病毒：AC Diagnostics,Inc.公司产品，编号为V082-PV。

菜豆荚斑驳病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 46400(C1858)。

蚕豆染色病毒：Loewe Biochemica GmbH公司产品，编号为07013PC

蚕豆萎蔫病毒：AC Diagnostics,Inc.公司产品，编号为V012-P1。

蚕豆萎蔫病毒1,2号：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 46202(C1543)。

蚕豆萎蔫病毒1,2号：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 46202(C1643)。

蚕豆萎蔫病毒1号：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0067。

蚕豆萎蔫病毒2号：AC Diagnostics,Inc.公司产品，编号为V212-P1。

蚕豆萎蔫病毒2号：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0862。

蚕豆真花叶病毒：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0098。

番茄黑环病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1068-11。

番茄环斑病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 22000(C1545)。

番茄环斑病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 22000(C1939)。

红三叶草斑驳病毒：Loewe Biochemica GmbH公司产品，编号为07040PC。

豇豆花叶病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 24200(C1319)。

豇豆重花叶病毒：美国典型菌种保藏中心(ATCC)，保藏编号为PV-273。

蓝莓叶斑病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 88001(C1796)。

萝卜花叶病毒：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0355。

马铃薯黑环斑病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1330-11。

南瓜花叶病毒：Agdia,Inc.公司产品；编号为LPC 26400(C2013)。

南芥菜花叶病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 23203(C1954)。

葡萄扇叶病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1147-11。

桃丛簇花叶病毒：Agdia，Inc.公司产品，编号为LPC 87700(C1973)。

悬钩子环斑病毒：德国生物资源保藏中心(DSMZ)，保藏编号为PV-0429。

烟草环斑病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 64001(C1714)。

烟草环斑病毒：Agdia,Inc.公司产品，编号为LPC 64001(C2009)。

樱桃锉叶病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1303-11。

玉米褪绿矮缩病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1327-11。

温州蜜柑矮缩病毒：中国农业科学院柑桔研究所。

草莓潜环斑病毒：安德珍生物技术(北京)有限公司产品，编号为1160-11。

5×反转录缓冲液：Promega Corporation公司产品，其目录号为M1705。

M-MLV反转录酶：Promega Corporation公司产品，其目录号为M1705。

RNA酶抑制剂：Promega Corporation公司产品，其目录号为N2111。

PCR缓冲液：北京全式金生物技术有限公司产品，其目录号为AP111-03。

Taq DNA聚合酶：北京全式金生物技术有限公司产品，其目录号为AP111-03。

实施例1、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其检测方法

一、检测豇豆花叶病毒亚科病毒的第一轮引物的筛选

1、RNA的提取

分别提取含有南芥菜花叶病毒(Agdia LPC 23203(C1954))、蚕豆萎蔫病毒2号(ACD V212-P1)、菜豆荚斑驳病毒(Agdia LPC 46400(C1858))、豇豆花叶病毒(Agdia LPC 24200(C1319))、豇豆重花叶病毒(ATCC PV-273)、悬钩子环斑病毒(DSMZ PV-0429)、萝卜花叶病毒(DSMZ PV-0355)和南瓜花叶病毒(Agdia LPC 26400(C2013))病叶样品的总RNA。

2、反转录反应

在0.6mL离心管中，加入待测样品总RNA4μL，引物SecoV-Rat(10μmol/L)2μL，DEPC处理的ddH2O 8μL，于95℃水浴10min后，迅速置于冰上5min。瞬离，继续加入5×M-MLV反转录缓冲液4μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，M-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，于42℃水浴1h后，70℃水浴15min，合成的cDNA，在－20℃冰箱中保存备用。

3、PCR反应

10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，上游引物SecoV-Fat(10μmol/L)2μL，下游引物SecoV-Rat(10μmol/L)2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，cDNA模板3μL，ddH₂O 14.75μL，共25μL。反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸45s，5个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃总延伸7min。

分别用引物SecoV-F6/SecoV-R5和SecoV-F6-at/SecoV-R5-at代替第一轮PCR反应中的引物SecoV-Fat/SecoV-Rat进行扩增。引物序列如下：

SecoV-F6：TGYGAYTAYDVNNVNTTYGAYGG；

SecoV-R5：KHYTTRTCNNYNCCRTCNGT；

SecoV-F6-at：AATAAATCATAATGYGAYTAYDVNNVNTTYGAYGG；

SecoV-R5-at：AATAAATCATAAKHYTTRTCNNYNCCRTCNGT。

5、凝胶电泳

反应结束后，取5μL的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示：从图中可以看出，和引物SecoV-F6/SecoV-R5和SecoV-F6-at/SecoV-R5-at相比，引物SecoV-Fat/SecoV-Rat能扩增出多数样品的目的片段，因此最终选取引物SecoV-Fat/SecoV-Rat作为第一轮PCR扩增的引物。

二、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒

1、检测豇豆花叶病毒亚科病毒的引物

根据豇豆花叶病毒亚科病毒RNA1上的保守区域设计如下五条扩增引物的序列为：

SecoV-Fat：AATAAATCATAATGTGAYTAYDVNNVNTTYGATGG(序列1)；

SecoV-Rat：AATAAATCATAAYTTRTCHNTNCCRTCNGT(序列2)；

SecoV-R4at：AATAAATCATAAADNAVRTTRTCRTCNCCRTA(序列3)；

SecoV-F-T3：ATTAACCCTCACTAAAGGGAATGTGAYTAYDVNNVNTTYGATGG(序列4)；

SecoV-R4-M13-47：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACADNAVRTTRTCRTCNCCRTA(序列5)；

其中，Y＝C或T，D＝G或A或T，V＝A或G或C，N＝A或G或T或C，R＝A或G，H＝A或T或C。

反转录引物为SecoV-Rat，第一轮PCR引物SecoV-Fat/SecoV-Rat，第二轮PCR引物SecoV-Fat/SecoV-R4at或SecoV-F-T3/SecoV-R4-M13-47。

2、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒

豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的配置(50次检测量)：

1)反转录缓冲液：5×，1管(300μL)；

2)dNTPs：浓度为10mmol/L，1管(100μL)；

3)M-MLV反转录酶：200U/μL，1管(30μL)；

4)RNA酶抑制剂：40U/μL，1管(30μL)；

5)PCR缓冲液(含25mmol/L的Mg²⁺)：10ˉ，1管(300μL)；

6)Taq DNA聚合酶：5U/μL，1管(30μL)；

7)无RNA酶ddH₂O：1管(1mL)；

8)引物SecoV-Fat：浓度为10μmol/L，1管(450μL)；

9)引物SecoV-Rat：浓度为10μmol/L，1管(350μL)；

10)引物SecoV-R4at：浓度为10μmol/L，1管(250μL)；

11)引物SecoV-F-T3：浓度为10μmol/L，1管(250μL)；

12)引物SecoV-R4-M13-47：浓度为10μmol/L，1管(250μL)；

13)阳性对照样品：含有南芥菜花叶病毒病叶的冻干粉末，1管(0.05g)。

三、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的检测方法

步骤二中的豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的检测方法为基于简并引物的半巢式RT-PCR方法。具体检测方法如下：

1、反转录反应

在0.6mL离心管中，加入待测样品总RNA 4μL，引物SecoV-Rat(10μmol/L)2μL，DEPC处理的ddH₂O 8μL，于95℃水浴10min后，迅速置于冰上5min。瞬离，继续加入5×M-MLV反转录缓冲液4μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，M-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，于42℃水浴1h后，70℃水浴15min，合成的cDNA，在－20℃冰箱中保存备用。

2、第一轮PCR反应

以步骤1中获得的cDNA为模板，采用引物SecoV-Fat/SecoV-Rat进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。第一轮PCR扩增体系：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，上游引物SecoV-Fat(10μmol/L)2μL，下游引物SecoV-Rat(10μmol/L)2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，cDNA模板3μL，ddH₂O 14.75μL，共25μL。反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸45s，5个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃总延伸7min。反应结束后，作为第二轮PCR的反应模板。

3、第二轮PCR反应

以第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物SecoV-Fat/SecoV-R4at进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。第二轮PCR扩增体系：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，上游引物SecoV-Fat(10μmol/L)2μL，下游引物SecoV-R4at(10μmol/L)2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，第一轮PCR产物1μL，ddH₂O 16.75μL，共25μL。反应程序：95℃变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，68℃延伸60s，5个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸60s，35个循环；72℃总延伸7min，反应结束。

第二轮PCR扩增反应也可以用引物SecoV-F-T3和SecoV-R4-M13-47代替引物SecoV-Fat和SecoV-R4at进行扩增。

4、凝胶电泳检测

取5μL的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若第二轮PCR产物中含有大小为400～440bp的DNA片段，则待测样品中含有或候选含有豇豆花叶病毒亚科病毒，反之，待测样品中不含有或候选不含有豇豆花叶病毒亚科病毒。

实施例2、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的广谱性和特异性检测

一、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的广谱性和特异性检测

1、分别提取含有豇豆花叶病毒亚科的安弟斯马铃薯斑驳病毒(DSMZ PV-0057)、南芥菜花叶病毒(Agdia LPC 23203(C1954))、蚕豆真花叶病毒(DSMZ PV-0098)、蚕豆萎蔫病毒(ACD V012-P1)、蚕豆萎蔫病毒1号(DSMZ PV-0067)、蚕豆萎蔫病毒2号(ACD V212-P1)、蚕豆萎蔫病毒2号(DSMZ PV-0862)、蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1543))、蚕豆萎蔫病毒1&2号(Agdia LPC 46202(C1643))、蓝莓叶斑病毒(Agdia LPC 88001(C1796))、菜豆荚斑驳病毒(ACD V082-P1)、菜豆荚斑驳病毒(Agdia LPC 46400(C1858))、豇豆花叶病毒(Agdia LPC 24200(C1319))、豇豆重花叶病毒(ATCC PV-273)、葡萄扇叶病毒(Adgen 1147-11)、马铃薯黑环斑病毒(Adgen 1330-11)、南瓜花叶病毒(Agdia LPC 26400(C2013))、番茄黑环病毒(Adgen1068-11)、番茄环斑病毒(Agdia LPC 22000(C1545))、番茄环斑病毒(Agdia编号为LPC 22000(C1939))、烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C1714))、烟草环斑病毒(Agdia LPC 64001(C2009))、萝卜花叶病毒(DSMZ PV-0355)、桃丛簇花叶病毒(Agdia LPC 87700(C1973))、悬钩子环斑病毒(DSMZ PV-0429)、蚕豆染色病毒(LOEWE07013PC)、红三叶草斑驳病毒(LOEWE 07040PC)；以及同属伴生豇豆病毒科的草莓潜隐环斑病毒(Adgen 1160-11)、樱桃锉叶病毒(Adgen 1303-11)、玉米褪绿矮缩病毒(Adgen 1327-11)、温州蜜柑矮缩病毒(中国农业科学院柑桔研究所)，共31个病毒病叶样品总RNA。

2、利用实施例1中的试剂盒及检测方法分别对步骤1中的各个病毒病叶的RNA样品进行检测，验证试剂盒的广谱性。每个样品重复检测三次。实验同时设置空白对照，即以水替代PCR反应模板。

第一轮PCR后、用引物SecoV-Fat/SecoV-R4at进行第二轮PCR的检测结果，如图1所示。结果显示，27个豇豆花叶病毒亚科病毒样品均检出约400bp的条带，而同属伴生豇豆病毒科的其它病毒样品未扩增到约400bp的条带，显示出良好的广谱性和特异性。因此，引物SecoV-Fat、SecoV-Rat和SecoV-R4at组成的成套引物，适用于豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测。

第一轮PCR后、用引物SecoV-F-T3/SecoV-R4-M13-47进行第二轮PCR的检测结果，如图2所示。结果显示，27个豇豆花叶病毒亚科病毒样品均检出约400bp的条带，而同属伴生豇豆病毒科的其它病毒样品未扩增到约400bp的条带，显示出良好的广谱性和特异性。因此，引物SecoV-Fat、SecoV-Rat、SecoV-F-T3和SecoV-R4-M13-47组成的成套引物，适用于豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测。

二、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的特异性检测

1、分别提取含有烟草花叶病毒、百合无症病毒，以及百合、普通烟、蚕豆、番茄、菜豆、豇豆、黄瓜、南瓜和甜豆的健康叶片的总RNA。

2、利用实施例1中的试剂盒及检测方法对步骤1中的病毒病叶及健康叶片的RNA样品进行检测，进一步验证试剂盒的特异性。每个样品重复检测三次。实验同时设置空白对照，即以水替代PCR反应模板。

检测结果如图3所示。结果显示，所有样品均未扩增出条带，说明本发明的豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒不会和其它病毒种类和寄主植物产生交叉反应，显示出良好的特异性。

实施例3、豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒的灵敏度检测

1、提取含有南瓜花叶病毒(Agdia LPC 26400(C2013))病叶样品的总RNA。

2、按照实施例1的步骤三中的1的方法合成cDNA模板，并把合成的cDNA模板进行10倍系列稀释成10^-1～10^-10共10个梯度浓度的cDNA模板，再按照实施例1中的试剂盒及检测方法分别对10个梯度浓度的cDNA模板进行检测，验证试剂盒的灵敏度。每个样品重复检测三次。

检测结果如图4所示。结果显示，本发明的检测试剂盒可以检测到10^-8浓度的cDNA模板，说明本发明的引物具有较高的灵敏度，足以满足日常检测的需要。