检测禽流感病毒亚型的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒及检测方法与流程

文档序号:12250054阅读:来源:国知局

技术特征:

1.检测H5、H7和H9亚型流感病毒的多重荧光定量PCR引物和探针,其特征在于,所述引物和探针包括以下序列:

所述H9亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列;

所述H9亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;

所述H9亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列;

所述H7亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列;

所述H7亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列;

所述H7亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列;

所述H5亚型流感病毒的探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列;

所述H5亚型流感病毒的正向引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列;

所述H5亚型流感病毒的反向引物具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

2.同时检测H5、H7和H9亚型流感病毒的多重荧光定量PCR试剂盒,其特征在于:包括2×缓冲液、阳性质粒标准品和权利要求1所述的H5、H7和H9亚型流感病毒的引物对和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:还包括流感病毒M基因的正向引物、流感病毒M基因的反向引物和流感病毒M基因的探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:所述流感病毒M基因的探针如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列;所述M基因正向引物如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列;所述M基因的反向引物如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:包括2×缓冲液10ml,4nmol/μl正向引物各4μl,4nmol/μl反向引物4μl,1nmol/μl探针4μl,阳性质粒标准品1ml。

6.使用权利要求1所述引物和探针或者权利要求2~5任意一项所述的试剂盒检测H5、H7和H9亚型流感病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)提供待检测样品的RNA,将所述RNA经反转录得到cDNA;

(2)以所述步骤(1)中的cDNA或者阳性质粒标准品为模板,与引物和探针建立反应体系,进行多重荧光定量PCR扩增,得到荧光曲线和Ct值;

(3)根据所述步骤(2)中得到的荧光曲线和Ct值,得到样品中的流感病毒亚型类别。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述多重荧光定量PCR扩增的反应体系:2×缓冲液10μl,40pmol/μl正向引物0.4μl,40pmol/μl反向引物0.4μl,10pmol/μl探针各0.2μl,共4种探针,阳性质粒标准品或样品cDNA1μl,补DEPC水至20μl。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述多重荧光定量PCR扩增的反应程序:95℃变性5min,以95℃5s,54℃20s,40个循环,在54℃进行单点荧光检测。

9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述阳性质粒标准品的制备方法包括以下步骤:

A、分别提取H5、H7和H9亚型流感病毒样本的总RNA;

B、将所述步骤A中得到的H5、H7和H9亚型流感病毒的总RNA分别进行反转录,得到H5、H7和H9亚型流感病毒的cDNA;

C、采用SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增H5亚型流感病毒特异性目标片段,采用SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增H7亚型流感病毒特异性目标片段,采用SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增H9亚型流感病毒特异性目标片段,采用SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的核苷酸序列分别作为上游引物和下游引物扩增流感病毒M基因的特异性目标片段,得到H5,H7,H9亚型流感病毒和流感病毒M基因特异性目的片段;

D、将所述步骤C得到的H5、H7特异性目的片段融合成H5-H7融合片段,将得到的H9和M基因特异性目的片段融合成一条H9-M融合片段,再将H5-H7融合片段和H9-M融合片段融合成一条H5-H7-H9-M片段,将所述H5-H7-H9-M片段连接到pMD18T载体上转入大肠杆菌中,得到阳性质粒标准品。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述H5-H7融合片段的融合的体系为:2mmol/L超高保真DNA聚合酶缓冲液25μl,1U/μl的超高保真DNA聚合酶1μl,10mmol/L dNTP(每种)1μl,100ng/μl的H5亚型流感病毒的特异性目的片段1μl,100ng/μl H7亚型流感病毒的特异性目的片段1μl,10μmol/L上下游引物各2μl,灭菌水17μl,总体系为50μl;所述融合的程序具体为:95℃预变30s,95℃变性15s,54℃退火15s,72℃延伸1min,扩增30个循环,72℃总延伸5min。

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