用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用与流程

本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。
背景技术：
：禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33％。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。流感病毒属正黏病毒科,由8条单股负链RNA构成基因组。流感病毒根据核心蛋白(NP)及基质(M)的抗原性不同，可分为A、B、C三型,其中致病性最强、在世界上流行最广的是A型流感病毒。A型流感病毒根据表面糖蛋白凝血素(HA)的不同,可以分为15个亚型，H1-H15，根据表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)的不同可以分为9个亚型N1-N9，因此理论上共有135种亚型组合。H5N8禽流感病毒是禽流感病毒的一种亚型。流感危害极大，变异极强，宿主范围极广，是传播性极强的传染病和人兽共患病，是WHO、FDA、OIE等国际组织联合倡导全球共同防控的重大疫病。流感病毒有抗原漂移和抗原转变的要求，变异性极大，不断涌现新的病毒，近年来新型病毒出现的频率明显加大。1997年香港首次报道H5N1、H9N2感染人，2004年出现H5N1全球性流行，2013年3月在我国首先出现了H7N9型禽流感，2014年12月20日和2015年1月27新增83起人感染甲型H7N9禽流感病毒。H5N2禽流感在东亚多国──主要在越南、韩国、泰国──严重爆发，并造成越南多名病人丧生，中国河北省保定市首次发生H5N2禽流感疫情。2016年前后，广东肇庆和深圳接连出现H5N6流感病例，深圳2例病例中，一人已经死亡。自2014年8月以来，中国境内广东、湖南等12个省份家禽共发生新型H5N6高致病性禽流感25起，我国周边日本、韩国、俄罗斯也均有H5N6发生流行，新出现的H5N6逐步代替H5N1而成为家禽和人群中的优势流行毒株。2014年开始，H5N8开始在欧洲、亚洲和俄罗斯家禽中大规模流行，由于家禽与人的接触关系密切，H5N8必然会传染给人类。基于时效性和准确性上的优势，实时荧光RT-PCR技术已经在疫病检测的很多项目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成为疫病检测领域最常用的分子生物学方法。但是到目前为止，我国目前尚没有比较有效的H5N8禽流感病毒的检测试剂和方法的报道。技术实现要素：本申请的目的是提供一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’SeqIDNo.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’SeqIDNo.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’SeqIDNo.1所示序列中，Y为C或者T碱基。需要说明的是，SeqIDNo.1所示序列中Y为简并碱基，其可以为C或者T碱基。本申请中，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列，可以理解，在实时荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用SeqIDNo.3所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上。优选的，探针的5’端标记有HEX荧光基因，3’端标记有BHQ淬灭基团。本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在H5N8禽流感病毒检测中的应用。本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在制备H5N8禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。可以理解，本申请的试剂，实际上就针对H5N8禽流感病毒设计的特异性探针和引物，当然可以用于H5N8禽流感病毒的检测，或者用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒或设备。本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂。本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由12.5μL2×realtimePCRBuffer、1μL25×enzymemix、终浓度0.4μM/L的引物对和终浓度0.2μM/L的探针组成；引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列。需要说明的是，本申请的试剂实际上是针对H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测而设计的，为了方便使用，本申请将反应体系中使用的buffer、酶、引物和探针统一配制成混合试剂，每一组混合试剂就是一个反应体系，直接向其中加入RNA样品就可以进行检测，使用简单方便，不仅避免了配制反应体系的繁琐步骤，而且避免了配制反应体系过程造成的污染。本申请的再一面还公开了一种H5N8禽流感病毒的逆转录实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组RNA；(2)采用权利要求6所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的基因组RNA，配制成反应溶液；(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在45℃反转录30min、95℃热启动10min，然后进入40个循环：95℃15s、60℃45s，在循环过程中于60℃时采集荧光。优选的，基因组RNA的提取采用RNA提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。本申请的有益效果在于：本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，对禽流感亚种H5N8具有很强的特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性的检测出H5N8，为新型H5N8禽病毒的检测或监控提供了一种有效的方法和途径。此外，基于本申请的试剂的H5N8禽流感病毒检测方法，其耗时短，可以很快作出结果判定，这对于控制流感的流行，减少经济损失，最大限度的保护全社会人群的健康和生命具有很大的意义。附图说明图1是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的特异性检测结果；图2是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的灵敏度检测结果。具体实施方式下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、反应体系的建立和优化利用人工合成的H5N8禽流感病毒的病毒质粒作为阳性标准品，其它供试样本则利用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分装后置-20℃保存备用。其它供试样本包括：H5N8灭活毒株、H5N1、H5N2、H9N2、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪流感经典型H1N1毒株、猪流感经典型H3N2毒株和禽流感H7、H9标准检测抗原。本例针对H5N8禽流感病毒的基因组RNA设计了其特异性检测引物和探针，引物和探针具体序列如表1所示。表1引物和探针序列名称序列(5’→3’)SeqIDNo.H5N8-NA-FPCTGCACATAAATACCCAACYCTGTA1H5N8-NA-RPTGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA2H5N8-NA-ProbeCCACTGTATCCCGACCAATT3本例对引物浓度、探针浓度进行了优化，具体如下：将反应体系设定为25μL，筛选引物、探针的最佳浓度。引物浓度由0.25μmol/L～0.6μmol/L以0.05μmol/L递增，探针浓度由0.1μmol/L～0.45μmol/L以0.05μmol/L递增。每次试验采用等量模板和只设一个变量，以Ct值、荧光增量和平台期等因素为考察依据，重复实验3次，若结果稳定，确定为最佳浓度值。以优化好的反应体系研究RT-PCR最佳反应条件，在“95℃1～12min，35～45个循环的95℃15～30s和50～60℃35～60s”的范围内反复进行试验，每次试验采用同管等量模板，每个反应条件重复试验3次，以Ct值、荧光增量、平台期和耗时等因素为考察依据，分别确定最佳反应条件。经优化，H5N8流感病毒一步法实时荧光RT-PCR采用25μL体积反应体系，包括：12.5μL2×realtimePCRBuffer、1μL25×enzymemix、终浓度0.4μM/L的引物、终浓度0.2μM/L的探针、5μL模板，用水补足至25μL。在ABI7500型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：50℃反转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃45s，扩增45个循环，55℃时设置采集荧光。仪器检测通道的选择：进行RT-PCR设置反应荧光信号时，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致，报告荧光设定为HEX，淬灭荧光设定为BHQ，校准荧光设定为None。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。程序设置好后，点击运行，进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出△Rn与循环数图像。其中，△Rn即第n个循环时的荧光增加值。结果分析和判定：(1)结果分析条件设定根据扩增曲线的荧光素种类，直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。(2)质控标准阴性对照无Ct值，且无扩增曲线，基本为一水平线。阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照管的相应源性成分的扩增曲线基本重合，特别是在荧光临界值(英文Threshold)附近。否则，此次实验视为无效。(3)结果描述及判定阴性：Ct值应大于38.0或无扩增曲线，表示样品中H5N8流感病毒核酸阳性。阳性：代表HEX的扩增曲线Ct值小于或等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中H5N8流感病毒核酸阳性。有效原则：根据对大量样品的检测研究，发现扩增曲线的Ct值处于35.0～38.0之间的样品为可疑样品，建议重做。重做结果Ct值大于38.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。二、禽流感病毒检测试验1H5N8禽流感病毒检测本试验，提取H5N8禽流感病毒基因组RNA进行试验，H5N8禽流感病毒基因组RNA提取方法与其它供试样本相同，本例具体采用的是Trizol核酸抽提试剂的提取方法。分别以提取的H5N8基因组RNA、H5N8阳性标准品为模板进行实时荧光RT-PCR反应，并设置一个水空白对照。反应体系为：12.5μL2×realtimePCRBuffer、1μL25×enzymemix、终浓度0.4μM/L的引物、终浓度0.2μM/L的探针、5μL模板，用水补足至25μL。反应条件为：50℃30min；95℃10min；然后进入45个循环：95℃15s，55℃45s，并于55℃时采集荧光。结果显示，本例提取的H5N8基因组RNA与H5N8阳性标准品一样能够检测出荧光信号，且Ct值都小于35.0；而水空白对照则无荧光信号。试验2特异性试验本试验以提取自H5N8的基因组RNA为阳性模板，以提取自用H3N2、H5N1、H5N2、H9N2、甲型H1N1、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等的RNA样本为阴性模板，进行逆转录实时荧光PCR检测，反应体系和反应条件与试验1相同，同时设置一个水空白对照。检测结果如图1所示，仅H5N8的基因组RNA有扩增曲线，而其它供试样本和水空白对照都没有扩增曲线，说明本例的引物和探针能够对H5N8进行特异性检测。试验3灵敏度试验将提取自H5N8的基因组RNA测定浓度后，作7个10倍系列稀释，进行逆转录实时荧光PCR检测。分别以原始的没有稀释的H5N8阳性标准品(即10-0)、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释的H5N8阳性标准品为模板进行逆转录实时荧光PCR检测，同时设置一个水空白对照。反应体系和反应条件与试验1相同。检测结果如图2所示，结果显示，水空白对照没有荧光信号，而10-0、10-1、10-2、10-3、10-4五个样品均有荧光信号，10-5、10-6、10-7和水空白对照没有荧光信号；可见，本例的H5N8禽流感病毒检测引物和探针对H5N8禽流感病毒的检测灵敏度为10-4稀释度，约相当于15个病毒拷贝。试验4稳定性和重复性试验选择H5N8禽流感病毒阳性样品的三个梯度稀释液，采用建立的实时荧光PCR方法进行重复性试验。每次试验每个模板浓度设置8个平行检测，记录每次试验每个检测的Ct值，计算标准差(即SD值)和批内变异系数(即CV值)。连续10天对上述同样模板液，以相同的反应体系和反应条件，分别重复进行10次试验，记录并统计10天Ct值数据，计算批间CV值。结果显示，三个梯度模板液检测所得Ct值的平均值分别为16.11±0.185，21.85±0.186和28.32±0.172，相应的变异系数CV为1.14％、0.85％和0.61％，即批内CV值≤0.61％。以相同的反应体系和反应条件，连续10天对上述同样模板液，分别重复进行10次试验，根据所记录的Ct值计算可得三个梯度模板液检测的批间CV值分别为1.37％、2.67％和3.14％，均小于10％。可见，本例的H5N8禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的稳定性良好。以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。SEQUENCELISTING<110>深圳市检验检疫科学研究院深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心清华大学深圳研究生院<120>用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用<130>16I23448<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>y<222>(20)..(20)<223>yiscort<400>1ctgcacataaatacccaacyctgta25<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2tgaggaatgttcttgttatccaaatga27<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ccactgtatcccgaccaatt20当前第1页1 2 3