一种合成和纯化玛咖酰胺的方法与流程

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种合成和纯化玛咖酰胺的方法。

背景技术：

玛咖(Lepidium meyenii Walp.)为十字花科独行菜属，生长在海拔3500米以上的环境中，一年或两年生草本植物，具有几千年的食用历史和广泛的生物功效－缓解体力疲劳，提高性功能，改善骨质酥松和提高记忆能力等。

玛咖酰胺类化合物是含氮类生物碱中，碱性最小的酰胺类生物碱，在玛咖中，玛咖酰胺是由苄胺和脂肪酸分子生物转化而成的，具有很长的碳链和多元的不饱合度。在玛咖干根中，玛咖酰胺的含量在0.06％－0.52％，含量很低，所以提出了大量合成的要求。N-(4-羟基-苄基)-5氧-6E，8E-十八碳二烯酸酰胺与普通的玛咖酰胺相比，在结构上，其苯环母核中氢原子被羟基取代。这种类型的玛咖酰胺首次被高大方等人，在2013年，发现。对羟基苄胺类生物碱与普通的玛咖酰胺，在生物功效和药用用途上的区别，还未有文献报道，所以提出了其制备和纯化方法，为药效研究提供物质基础。根据《玛咖干制品质量标准》(DBS 53/001—2015)，玛咖中主要包含五种玛咖酰胺，依次是间甲氧基-苄基-亚麻酰胺(397.60)，苄基-亚麻酰胺(367.57)，间甲氧基-苄基-亚油酰胺(399.62)，苄基-亚油酰胺(369.59)和苄基-十六烷酰胺(345.57)。

合成玛咖酰胺的工艺主要是合成酰胺键，目前酰胺键的合成主要是碳二亚胺类缩合剂法，碳二亚胺类缩合剂主要包括三种二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)，EDCI的盐酸盐比较常用，是水溶性的，也易于成品纯化，主要起着活化羧基的作用。由于活化羧基形成的中间体不稳定，容易形成稳定的副产物，所以必须加入酰胺催化剂(HOBT，HOAT等)，来形成中间体。反应过程中也需要加入缚酸剂，特别是使用EDCI的盐酸盐，来提高产物的得率，尽管这种物质的化学分子结构已经被确定，但因其不具有典型生物碱特性，在玛咖中的含量较低且提取分离工艺复杂，目前还没有成熟的化学合成工艺和广泛的制备工艺。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玛咖酰胺的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种玛咖酰胺的制备方法，包括以下步骤：1)向二氯甲烷溶液中加入脂肪酸、EDC·HCl、HOBT·H₂O和三乙胺混匀，搅拌10～24小时；2)然后向上述反应液加入苄胺或取代苄胺，反应2～10小时；3)将上述合成的反应液蒸干，并纯化。

所述玛咖酰胺化学结构通式为：

(1)或(2)

优选的，制备原料的脂肪酸分别为：软脂酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，5氧-6E，8E-十八碳二烯酸。

优选的，步骤一和步骤二中反应溶液，苄胺或取代苄胺、脂肪酸、EDC·HCl、HOBT·H₂O和三乙胺的摩尔比为(1－10)：(1－10)：(1－10)：(1－10)：(1－10)。

进一步优选的，取代苄胺为对羟基苄胺或间甲氧基苯胺。

进一步优选的，对羟基苄胺、脂肪酸、EDC·HCl、HOBT·H₂O和三乙胺的摩尔比为1：1：1：1：2.5。

优选的，玛咖酰胺制备过程中的纯化的步骤是：

1)加入酸溶液和有机溶剂，超声辅助溶解后，取有机层；

2)将有机层用碱溶液充分震荡，反应完全；

3)再加入酸溶液进行洗涤，并取有机层溶液低温结晶或者硅胶过柱。

进一步优选的，低温结晶温度为-30℃－10℃。

本发明的有益效果是：提供了一种玛咖酰胺的制备方法，该方法合成的产物纯度较高，步骤简便，可用于工业化大规模。

附图说明

图1是本发明实施例1中按照合成方法，得到的反应液，经过稀释过滤后，上样得到的高效液相色谱图。

图2是本发明实施例1中按照纯化方法，得到的结晶，甲醇溶解一定量后，上样得到的高效液相色谱图。

具体实施方式

通过下面具体实施例及其附图对本发明作进一步的详细描述，便于理解本发明的技术方案，但本发明的实施方式不限于此。

对比例

在装有300mL DCM(二氯甲烷)的玻璃瓶中，加入HOAt(11.4mmol)，EDC·HCL(15.2mmol，1456.92mg)和DIPEA(22.8mmol)，再加入软脂酸(7.6mmol，1950mg)，苄胺(7.6mmol，830μL)，它们的摩尔比为3：6：4：2：2，与30℃的条件下搅拌反应12h；加入离子水100mL，室温下搅拌30min，过滤并真空干燥的产物；

性能检测

质谱：Thermo的LCQ DECAXP离子肼质谱，m/z 346.2；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(600MHz,CDCl₃),δ＝2.20(t,J＝7.65Hz,2H),δ＝1.65(t,J＝7.05Hz,2H),δ＝1.26(s,br,24H),δ＝0.88(t,J＝6.75Hz,3H),δ＝4.43(d,J＝7.65Hz,2H),δ＝7.29(m,5H),δ＝5.73(s,1H)。

由此，可以确认本对比例制备得到的玛咖酰胺为N－苄基－十六碳酰胺(N-benzyl-hexadecanamide，C₂₃H₃₉NO)，其化学式是

检测浓度为50.45％，纯化后纯度为61.93％。

实施例1

在装有300mL二氯甲烷的玻璃瓶中，加入软脂酸(1950mg)，EDC·HCL(1456.92mg)，HOBt·H₂O(1030mg)和三乙胺(2633.7μL)，它们各自的摩尔比为1：1：1：2.5，然后用磁力搅拌器，常温下搅拌20h。之后接着加入苄胺(830μL)，在相同的条件下反应4h，即可得到合成终液。将上述反应液用旋转蒸发仪蒸发至干后，立即加入10％HCL(100mL)和正己烷(250mL)，用超声波辅助溶解，萃取得到正己烷层；用10％NaOH(50mL)冲洗三次，再用10％HCL(50mL)洗涤一次，最后将正己烷溶液转移到4℃的低温环境中过夜；用过滤装置得到析出的结晶，干燥后即得成品。

性能测试：

红外：FT/IR-660红外仪，峰值为Vmax＝3306.47(N-H)，2917.51，2849.64，1638.42(C＝O)，1551.30(N-C)，1454.83(N-C＝O)，729.10和698.72(苯环)cm^-1；

质谱：Waters的ESI正离子质谱，m/z＝346.31；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(400MHz，CDCL₃),7.32–7.36(m,2H),7.26–7.30(m,3H),5.72(br s,1H),4.45(d,J＝6.0Hz,2H),2.21(t,J＝7.2Hz,2H),1.61–1.67(m,2H),1.25–1.34(m,24H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)d 173.21,138.66,128.92,128.05,127.71,43.80,37.06,32.16,29.92,29.89,29.84,29.73,29.59,29.56,26.01,22.93,14.36；

由此，可以确认本实施例制备得到的玛咖酰胺为N－苄基－十六碳酰胺(N-benzyl-hexadecanamide，C₂₃H₃₉NO)，其化学式是

检测浓度为61.64％，纯化后浓度为97.63％。

实施例2

在装有50mL二氯甲烷的玻璃瓶中，加入亚油酸(2363.32μL)，EDC·HCL(1457.41mg)，HOBt·H2O(1030mg)和三乙胺(2633.7μL)，它们各自的摩尔比为1：1：1：2.5，然后用磁力搅拌器，常温下搅拌15h。之后接着加入苄胺(830μL)，在相同的条件下反应5h，即可得到合成终液。将上述反应液用旋转蒸发仪蒸发至干后，立即加入5％硫酸(50mL)和正己烷(50mL)，用超声波辅助溶解，萃取得到丙酮层；用10％CaOH(50mL)冲洗三次，再用10％HCL(50mL)洗涤一次，最后将正己烷溶液转移到-10℃的低温环境中过夜；用过滤装置得到析出的结晶，干燥后即得成品。

性能测试：

红外：FT/IR-660红外仪，峰值为Vmax＝3302.23(N-H)，2921.31，2850.64，1642.42(C＝O)，1551.68(N-C)，1452.83(N-C＝O)，720.10和695.72(苯环)cm^-1；

质谱：Waters的ESI正离子质谱，m/z＝370.31；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(400MHz，CDCL₃),d 7.26–7.36(m,5H),5.73(br s,1H),5.30–5.40(m,4H),4.44(d,J＝5.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.21(t,J＝8.0Hz,2H),2.02–2.07(m,4H),1.63–1.67(m,2H),1.26–1.37(m,14H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)d 173.15,138.64,130.46,130.27,128.94,128.27,128.13,128.06,127.74,43.82,37.03,31.75,29.82,29.57,29.51,29.48,29.37,27.42,25.98,25.85,22.81,14.31；

由此，可以确认本实施例制备得到的玛咖酰胺为N－苄基－9顺，12顺－亚油酸酰胺(N-benzyl-9Z,12Z-octadecadienamide，C₂₅H₃₉NO)，其化学式是

检测浓度为63.24％，纯化后浓度为95.13％。

实施例3

在装有50mL二氯甲烷的玻璃瓶中，加入亚油酸(2363.32μL)，EDC·HCl(1457.41mg)，HOBt·H₂O(103mg)和三乙胺(2634μL)，它们各自的摩尔比为1：1：1：2.5，然后用磁力搅拌器，常温下搅拌10h。之后接着加入间甲氧基苄胺(984.31μL)，在相同的条件下反应4h，即可得到合成终液。将上述反应液用旋转蒸发仪蒸发至干后，立即加入醋酸(50mL)和乙醚(50mL)，用超声波辅助溶解，萃取得到乙醚层；用10％KOH(50mL)冲洗三次，再用醋酸(50mL)洗涤一次，将乙醚溶液过硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯硅(1：1)混合溶液作为溶剂，蒸干溶剂即得合成产物。

性能测试：

红外：FT/IR-660红外仪，峰值为Vmax＝3290.12(N-H)，2929.24，2850.14，1632.32(C＝O)，1554.48(N-C)，1464.23(N-C＝O)，776.21和695.82(苯环)cm^-1；

质谱：Waters的ESI正离子质谱，m/z＝400.32；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(400MHz，CDCL₃)d 7.23–7.27(m,1H),6.86(d,J＝7.2Hz,1H),6.81–6.83(m,2H),5.67(br s,1H),5.29-5.40(m,4H),4.42(d,J＝5.6Hz,2H),3.80(s,3H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.02–2.07(m,4H),1.61–1.68(m,2H),1.27–1.39(m,14H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)d173.10,160.13,140.23,130.46,130.27,129.98,128.28,128.13,120.25,113.62,113.18,55.46,43.78,37.05,31.75,29.83,29.57,29.52,29.49,29.37,27.42,25.98,25.85,22.81,14.31；

由此，可以确认本实施例制备得到的玛咖酰胺为N－间甲氧基苄基－9顺，12顺－亚油酸酰胺(N-(m-methoxybenzyl)-9Z,12Z-octadecadienamide，C₂₆H₄₁NO₂)，其化学式是

检测浓度为59.65％，纯化后浓度为96.21％。

实施例4

在装有50mL二氯甲烷的玻璃瓶中，加入亚麻酸(2325μL)，EDC·HCl(1457.41mg)，HOBt·H₂O(1030mg)和三乙胺(2634μL)，它们各自的摩尔比为1：1：1：2.5，然后用磁力搅拌器，常温下搅拌23h。之后接着加入苄胺(830μL)，在相同的条件下反应3h，即可得到合成终液。将上述反应液用旋转蒸发仪蒸发至干后，立即加入苹果酸(50mL)和甲醇(50mL)，用超声波辅助溶解，萃取得到甲醇层；用氨水(50mL)冲洗三次，再用苹果酸(50mL)洗涤一次，最后将甲醇溶液转移到-20℃的低温环境中过夜；用过滤装置得到析出的结晶，干燥后即得成品。

性能测试：

红外：FT/IR-660红外仪，峰值为Vmax＝3302.32(N-H)，2920.14，2849.24，1639.12(C＝O)，1550.78(N-C)，1453.23(N-C＝O)，720.31和696.42(苯环)cm^-1；

质谱：Waters的ESI正离子质谱，m/z＝368.31；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(400MHz，CDCL₃)d 7.26–7.35(m,5H),5.73(br s,1H),5.30–5.41(m,6H),4.44(d,J＝5.2Hz,2H),2.80(t,J＝6.4Hz,4H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.02–2.11(m,4H),1.62–1.67(m,2H),1.30–1.36(m,8H),0.97(t,J＝7.6Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)d 173.14,138.64,132.20,130.49,128.94,128.51,128.48,128.06,127.95,127.74,127.34,43.82,37.03,29.80,29.51,29.47,29.36,27.43,25.98,25.85,25.75,20.78,14.51；

由此，可以确认本实施例制备得到的玛咖酰胺为N－苄基－9顺，12顺，15顺－亚麻酸酰胺(N-benzyl-9Z,12Z,15Z-octadecatrienamide，C₂₅H₃₇NO)，

检测浓度63.51％，纯化后浓度为95.71％。

实施例5

在装有50mL二氯甲烷的玻璃瓶中，加入亚麻酸(232.5μL)，EDC·HCL(145.7mg)，HOBt·H₂O(103mg)和三乙胺(263.4μL)，它们各自的摩尔比为1：1：1：2.5，然后用磁力搅拌器，常温下搅拌20h。之后接着加入间甲氧基苄胺(98.4μL)，在相同的条件下反应，即可得到合成终液。将上述反应液用旋转蒸发仪蒸发至干后，立即加入枸橼酸(50mL)和乙腈(50mL)，用超声波辅助溶解，萃取得到乙腈层；用碳酸氢钠(50mL)冲洗三次，再用枸橼酸50mL)洗涤一次，将乙腈溶液过硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯硅(1：1)混合溶液作为溶剂，蒸干溶剂即得合成产物。

性能测试：

红外：FT/IR-660红外仪，峰值为Vmax＝3302.12(N-H)，2920.24，2849.74，1639.21(C＝O)，1551.23(N-C)，1453.41(N-C＝O)，776.11和696.22(苯环)cm^-1；

质谱：Waters的ESI正离子质谱，m/z＝398.36；

核磁：Bruker AVANCE III600核磁仪中¹H谱(400MHz，CDCL₃)d 7.23–7.27(m,1H),6.86(d,J＝7.2Hz,1H),6.81–6.83(m,2H),5.67(br s,1H),5.29–5.41(m,6H),4.42(d,J＝6.0Hz,2H),3.80(s,3H),2.80(t,J＝6.8Hz,4H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.02–2.10(m,4H),1.61–1.68(m,2H),1.30–1.36(m,8H),0.97(t,J＝7.6Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)d173.10,160.13,140.22,132.21,130.50,129.98,128.52,128.48,127.96,127.34,120.26,113.63,113.18,55.46,43.78,37.05,29.81,29.52,29.48,29.36,27.43,25.98,25.85,25.75,20.78,14.51；

由此，可以确认本实施例制备得到的玛咖酰胺为N－间甲氧基苄基－9顺，12顺，15顺－亚麻酸酰胺(N-(m-methoxybenzyl)-9Z,12Z,15Z-octadecatrienamide，C₂₆H₃₉NO₂)，其化学式是

检测浓度60.75％，纯化后浓度为95.92％。