抗BTLA蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合btla蛋白的单克隆抗体umab61、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术：

免疫细胞表面的辅助受体的激活对机体免疫的调节起到非常重要的作用，其中cd28/b7配体受体家族成员研究的比较多，如：ctla4，pd1和b、t淋巴细胞衰减因子(bandtlymphocyteattenuator,btla)等。他们都起到了负向调节免疫应答的作用。

btla又名cd272，是最近才被发现的cd28家族的一员，属于ig超家族成员。主要表达在激活后的b、t淋巴细胞表面。同pd-1一样，btla的胞内区域也有一个免疫受体tyr抑制基序，通过和配体hvem结合后能抑制t细胞的活化。因而在肿瘤浸润的淋巴细胞中，btla的表达量可反映免疫抑制的状态。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对btla蛋白的单克隆抗体对ihc检测btla表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的btla蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测btla蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏日期为2016年4月27日，保藏编号为cgmccno.12284。

本发明还提供了一种特异性结合btla蛋白的单克隆抗体umab61，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据btlaorf核苷酸序列(btlaorf核苷酸序列如seqidno.1所示，870bp；btla氨基酸序列如seqidno.2所示)

设计引物pcr扩增btlaorf第1bp位到第867bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pcmv6-entry，构建btla氨基酸序列第1位到第289位的重组表达质粒pcmv6-rbtla；上游扩增引物序列，seqidno.3:cacgcgatcgcatgaagacattgcctgccatg下游扩增引物序列seqidno.4:accgacgcgtactcctcacacatatggatgca

(2)btla重组蛋白的表达与纯化：将btla重组表达质粒转化hek293t细胞，裂解离心获得上清，ddk亲和层析柱纯化，获得纯化的btla重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的btla重组蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗btla特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为umab61，亚型鉴定为igg2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得btla单克隆抗体umab61。分别通过westernblot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步采用origene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：origene高密度蛋白芯片上包含10,000个hek293t细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

本发明将所述单克隆抗体umab61与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明所述单克隆抗体umab61特异性结合btla蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体umab61在制备用于检测btla蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体umab61，可检测组织细胞中btla的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与btla的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cgmccno.12284)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体umab61。本发明还提供了单克隆抗体umab61在制备用于检测btla蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体umab61的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体umab61在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与btla蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了btla蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤浸润淋巴细胞内btla蛋白表达水平，可应用于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤免疫微环境的检测。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株umab61的分类命名为：鼠抗人b和t淋巴细胞衰减因子(btla)单克隆杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年4月27日；

保藏编号：cgmccno.12284。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为orf区；

图2示实施例2重组btla蛋白westernblot检测结果图，以anti-ddk检测重组btla蛋白在hek293t细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的hek293t细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pcmv6-rbtla质粒的hek293t细胞裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2重组btla蛋白sds-page结果图，用抗ddk亲和层析柱纯化重组btla蛋白，纯化后的蛋白通过sds-page胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体umab61识别完整的btla(fulllengthbtla,btla-fl)蛋白的westernblot检测结果图。泳道1为转染pcmv6-entry的细胞裂解液；泳道2为转染pcmv6-btla-fl的细胞裂解液；

图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌免疫组化结果图(一抗为btla单克隆抗体umab61)；

图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肺癌免疫组化结果图(一抗为btla单克隆抗体umab61)；

图7示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为btla单抗umab61，1:100；二抗为dylight649-conjugatedaffinipurefragmentgoat-anti-mouseigg，1:400)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、btla重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc219458(含btlaorf867bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pcmv6-entry，建立btla重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、btla重组蛋白的表达与纯化

1、转染hek293t细胞：hek293t细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mldmem(无血清及抗生素)至50ml管中，加入300μlpeimegatran1.0混匀；加入75μgbtla重组表达质粒dna至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μl至各培养皿中于37℃5％co2培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μl2m丁酸钠至终浓度5mm。

2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mlpbs进行漂洗，吸去pbs。加入1ml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂pi和pmsf。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4℃离心，收集上清。取少量上清采用wb鉴定重组btla的表达，结果图2。

3、ddk亲和层析柱纯化：以0.45μm，33mmpvdf膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入bio-rad层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样wb检测；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用tbst冲洗beads3次，滴尽后用0.1mglycineph3.5洗脱，第一次200μl，滴尽不收集，第二、三次各500μl，第三次250μl，收集至一个1.5ml离心管中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的重组btla蛋白用sds-page鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pcmv6-rbtla质粒的hek293t细胞裂解液中wb检测后在30-40kd处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量33kd基本相符。表明细胞中重组btla蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在page胶30-40kd处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量33kd基本相符。表明已获得了纯度较好的btla重组蛋白。

实施例3、btla单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的btla蛋白片段用于对balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的btla抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用btla纯化重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为umab61。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株umab61产生的单抗为igg2a，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、wb检测、分装、冻存在-20℃。其中wb检测结果见图4。

由图4结果可见，泳道2在分子量约50kd处有特异的条带，表明单克隆抗体umab61能特异地westernblot检测完整的全长btla蛋白。

实施例4、单克隆抗体umab61为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的人乳腺癌组织与人肺癌组织块进行石蜡包埋，使用finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入btla单抗(umab61)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlogno.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-6。

(2)、实验结果：

由图5-6结果可见，在人乳腺癌组织与人肺癌组织中可见到特异性膜染色。结果与btla在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体umab61可用于免疫组织化学检测btla蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体umab61的特异性检测

origene高密度蛋白芯片上包含10,000个hek293t细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片进行umab61抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mlpbst平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50ml离心管中加入40ml5％脱脂牛奶(用pbst进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗umab61，稀释比列为1:100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片nc膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片nc膜，直至整张nc膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用pbst漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗dylight649-conjugatedaffinipurefragmentgoat-anti-mouseigg，稀释比例为1:400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用pbst洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据bsa-cy3以及bsa-cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液id，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，ncbi录入号(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。

结果如图7所示，单抗umab61在origene蛋白芯片上能特异地识别btla蛋白，表明单抗umab61的特异性较好。

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗btla蛋白单克隆抗体及其用途

<210>1

<211>870

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

1atgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttcttaatc

61ccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatata

121aagagacaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtg

181aaatactgtgctaacaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgta

241aaacttgaagatagacaaacaagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattcta

301cattttgaaccaatgcttcctaatgacaatgggtcataccgctgttctgcaaattttcag

361tctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtgacagatgtaaaaggtgcctca

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481ttggggggattgcctctactcatcactacctggttctgcctgttctgctgcctgagaagg

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781aaccattctgtcattggactgaactcaagactggcaagaaatgtaaaagaagcaccaaca

841gaatatgcatccatatgtgtgaggagttaa

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<210>2

<211>289

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

origin

1mktlpamlgtgklfwvfflipyldiwnihgkescdvqlyikrqsehsilagdpfelecpv

61kycanrphvtwcklngttcvkledrqtswkeeknisffilhfepmlpndngsyrcsanfq

121snlieshsttlyvtdvkgaserpskdevasrpwllysllplgglpllittwfclfcclrr

181hqgkqnelsdtagreinlvdahlkseqteastrqnsqvllseagiydndpdlcfrmqegs

241evcsnpcleenkpgivyaslnhsviglnsrlarnvkeapteyasicvrs

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