dna和rna分子在多种生物体的基因表达中具有重要作用。例如，最近发现小rna作为转录后基因表达(特别是基因沉默)的重要调节因子影响活细胞的生理和病理过程。从那时起，已发现多种短rna是在植物、动物和dna病毒中类型丰富的基因调节物，并且已在从裂殖酵母到人的多种生物体中鉴定了不同来源和功能的短rna。其中，mirna是在植物和动物中丰度最高的小调控性rna类型。到目前为止，已通过克隆和测序鉴定了超过20000种不同的mirna(参见例如mirbase：在http://www.mirbase.org/的microrna注册数据库，桑格研究所，英国)。在通常情况下，mirna的特征在于具有21-25个核苷酸(nt)的长度并且通过在mirna与其靶mrna之间形成互补碱基对的机制参与蛋白表达的调控。该过程导致蛋白翻译的抑制，并且，取决于mirna与其靶位点之间序列互补的程度，其还可导致mrna转录物的降解(综述参见例如barteldp,cell2009,136(2):215-233)。已发现恶性肿瘤和肿瘤细胞系与正常组织相比显示出失调的mirna表达谱，根据这样的发现，认为mirna表达的改变参与了一些人类疾病，特别是癌症(综述参见例如farazi等，2013,adv.exp.med.biol774:1-20)。也就是说，在人类癌症中已经观察到mirna水平的全面降低，表明小调控性rna在肿瘤抑制中可能具有固有功能。由于在肿瘤中存在mirna的全面下调，因而mirna的表达谱可能反映出这种疾病的来源和分化状态。以类似的方式，其他疾病的特征为内源性表达的mirna水平的上调和/或下调，例如小调控性rnamirna-21，已发现其在几乎全部类型的癌症中表达失调，但是也发现其在包括发育、心血管和肺脏疾病以及炎症在内的多种其他生物过程中发挥着重要作用(综述参见例如kumarswamy等，2011,rnabiology8:5,706-713，和kataoka和wang,cell2014,3:883-898)。此外，已发现肾衰竭的特征为具有不同的小调控性rnamirna-320和mir-210的表达模式(lorenzenj.m.等，clin.j.am.soc.nephrol,6:1540-1546)。合成的分子能够以高度序列特异性与选定的靶基因序列结合，这在医学和生物
技术领域：
非常重要，因为其为基因治疗剂和诊断装置的发展带来了希望。也就是说，例如已知序列的寡核苷酸常用于各种各样的化学和生物应用中，并且其在诊断和治疗应用中越来越重要。在生理样品中分析作为治疗剂使用的寡核苷酸(包括以例如mirna表达谱的形式对小调控性rna的分析)已经发展成为医学诊断中的一种重要工具。microrna是易于检测的寡核苷酸，目前已将其作为多种疾病的生物标记物。因此，用于定量分析特定类别的小调控性寡核苷酸的高灵敏度检测系统是先进医学诊断的重要工具。然而，目前的高通量检测方法在很大程度上依赖于使用定量实时聚合酶链反应(rt-pcr)的方法。rt-pcr使得能够以绝对拷贝数形式和相对数量形式进行检测和定量。然而，这些方法需要进行包括靶序列的预扩增在内的大量的样品制备，并且其耗时又昂贵。目前主要将离子交换色谱结合uv吸收或荧光检测，用于分析合成寡核苷酸的纯度或者用于检测寡核苷酸的修饰。在此处，在正电固定相上根据磷酸二酯骨架上负电荷的数量来分离寡核苷酸，而负电荷的数量取决于寡核苷酸骨架的长度。与uv检测或荧光读数偶联的离子交换色谱还在治疗性寡核苷酸的药代动力学分析中被描述(wo2010/043512a1，综述参见例如batkai和thum,2014,journalofchromatographyb,964:146-152)。不断发展的小调控性寡核苷酸领域目前在分子水平以及大规模诊断水平上面临许多分析方面的改变。因此，在高通量筛选的情况下，提供灵敏度高、可靠和迅速的用于绝对定量和归一化的检测方法是医学研究、诊断和治疗领域中最重要的主要问题。因此，会一直需要一种改进方法，用于从一个样品中平行地定量检测数个目标寡核苷酸，包括分析长度相等但具有不同种类的小调控性rna的表达模式，或其他治疗性寡核苷酸。在本发明的情境下，已发现能够对具有不同序列但是长度相等的数个寡核苷酸进行定量检测，从而平行地进行分析，可以使用互补的检测分子与阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)的方法相结合，其中检测分子用荧光标记和化学修饰以具有不同的总表面电荷。也就是说，等长的寡核苷酸具有相似的骨架负电荷，因此与带正电荷的固相结合后会显示出相似的洗脱性质，但是，与带有不同表面电荷的互补检测分子的退火显著改变了目标寡核苷酸的总表面电荷，从而能够改善分辨率并能够分离以其他方式不可能分离的各目标寡核苷酸，因为各目标寡核苷酸在与各自的检测分子杂交后发生了结合亲和性的改变。因此，本发明的方法特别适于在一个样品中平行地检测一种以上的寡核苷酸，特别是当这些寡核苷酸具有相同或相似的长度时，采用色谱方法对其进行分离通常具有挑战或存在障碍。因此，本发明的方法特别适于在一项方法中检测多个等长的小调控性rna或dna分子，包括例如在从一个目标生物样品中平行地对多个mirna或小治疗性rna进行高通量定量的情境下。因此，在第一个方面，本发明涉及一种用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的方法，所述方法包括步骤：a)提供含有或疑似含有所述至少两个等长的不同寡核苷酸的生物样品；b)通过将生物样品与至少两个检测分子接触形成杂交混合物，所述至少两个检测分子同所述至少两个等长的不同寡核苷酸互补，其中所述检测分子各自经至少一个荧光部分标记，并且其中所述检测分子具有不同的表面电荷；c)利用阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)将与所述至少两个等长的不同寡核苷酸杂交的检测分子与非杂交的检测分子部分分离；d)通过定量荧光读数检测杂交的检测分子-寡核苷酸部分。如在本发明情境下所使用的，术语“寡核苷酸”通常指由脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna)组成的寡聚物或多聚物，优选指由核糖核苷酸(rna)组成的寡聚物或多聚物。因此，在本发明的情境下，目标寡核苷酸优选是rna寡核苷酸形式的rna分子，其包括但不限于小调控性rna如mirna和sirna。同样优选的是，本发明的寡核苷酸是dna寡核苷酸形式的dna分子，包括但不限于各种各样的合成设计和/或合成生产的dna寡核苷酸，如举例来说诱饵寡核苷酸。原则上，本发明的寡核苷酸包括各种各样的由核碱基(即含氮碱基)、五碳糖(其可以是核糖、2’-脱氧核糖或其任意衍生物)和磷酸基团组成的结构。核碱基和糖构成了称为核苷的单元。磷酸基团可以与2、3或5位的碳形成键，特别是与糖的3位和5位碳。核糖核苷酸含有核糖作为糖部分，而脱氧核糖核苷酸含有脱氧核糖作为糖部分。核苷酸可以含有嘌呤或嘧啶碱基。因此，由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或由其任意组合构成的本发明的寡核苷酸还可以包含一个或多个经修饰的核苷酸。任选地，寡核苷酸还可以仅包含经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的核糖和脱氧核糖形式例如可以包括但不限于5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基-胞苷、5-甲基-胞苷、2-氨基-腺苷、4-硫尿苷、5-碘尿苷、n6-甲基-腺苷、5-氟尿苷、肌苷、7-丙炔基-8-氮杂-7-氮杂嘌呤(deazapurine)和7-卤代-8-氮杂-7-氮杂嘌呤(deazapurine)核苷。在本发明情境下提及的寡核苷酸还可以包含骨架修饰，如2′-o-甲基(2′-ome)rna或2′-氟(2′-f)rna。任选地，本发明的寡核苷酸可以还包含或替代地包含在磷酸骨架上的一个或多个修饰，如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯，这些已知可以增加对核酸酶的稳定性。如在本申请中使用的术语“等长的不同寡核苷酸”指具有相同或相似长度的单链或双链寡核苷酸，即由相同或相似数量的核苷酸组成的寡核苷酸。将术语“等长”优选地定义为具有相同长度的目标寡核苷酸。在这种情况下，目标寡核苷酸由相同数量的核苷酸组成。然而，同样优选的是目标寡核苷酸具有相似长度，即彼此之间略有不同的长度。因此，本发明的“等长”还包括各寡核苷酸的长度彼此之间相差几个核苷酸，优选地最多五个、四个、三个或两个核苷酸。更优选地，至少两个不同的目标寡核苷酸的长度仅相差一个核苷酸。也就是说，在一个优选的实施方式中，通过本发明的方法检测的至少两个寡核苷酸可以具有相差5个核苷酸、或者4个核苷酸、或者3个核苷酸、或者2个核苷酸的相似的长度。更优选地，目标寡核苷酸可以具有仅相差一个寡核苷酸的相似长度。在从一个样品中平行地检测两个以上不同的目标寡核苷酸的那些情况下，例如在从一个样品中平行地检测三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者甚至更多个等长的寡核苷酸的情况下，待检测的寡核苷酸可以是相同或相似长度，或者两者兼有，如上文所定义的情况的任意组合或任意选择。优选地，本发明的等长的不同寡核苷酸是具有不同序列的寡核苷酸，但是其由相同数量的核苷酸组成。同样优选的是仅相差少量核苷酸长度的，优选地相差不超过5个核苷酸长度的相似长度的寡核苷酸。如本申请中所使用，定义“等长的不同寡核苷酸”进一步地不排除数个目标寡核苷酸可以包括、包含或含有一个或多个相同或不同的化学修饰。化学修饰在数量和/或种类上可以是相同的或不同的。在通常情况下，在本发明的情境下，待检测的寡核苷酸可以具有从10至50个核苷酸，或者从12至40个核苷酸，或者从12至30个核苷酸、或者优选地从10至25个核苷酸的总长度。同样优选的是，目标寡核苷酸可以具有的长度的范围从15至30个核苷酸，更优选地范围从18至25个核苷酸，最优选地范围从20至22个核苷酸。然而，对本领域技术人员显而易见的是，还可以对上限和下限进行组合以达到不同的范围。而且，含有目标寡核苷酸的本发明样品可以含有具有此类不同长度的寡核苷酸分子群体。也就是说，在本发明情境下提供的样品可以含有相同长度的寡核苷酸，或者可以含有不同长度的寡核苷酸，或者这两者，其包括但不限于目标寡核苷酸的前体和成熟形式，如mirna及其前体或长非编码rna。然而，存在不同长度的寡核苷酸不会阻碍采用本发明方法对等长寡核苷酸的定量检测。因此，在一个优选的实施方式中，至少两个不同的寡核苷酸具有从10至50个核苷酸，优选地从12至40个核苷酸，更优选地从18至30个核苷酸的长度。在本发明的情境下，待检测的寡核苷酸还可以来自各种各样的天然、非天然或人工来源，包括但不限于病毒、细菌和真核dna或rna。或者，目标寡核苷酸可以来自合成的来源，包括那些被生产和合成以用于研究、作为诊断剂或作为治疗剂的寡核苷酸。如在本申请中所使用，术语“合成”优选地指采用化学合成的方法制备dna或rna寡核苷酸，其包括但不限于使用自动的dna和/或rna合成仪和/或酰胺三酯合成法。自动的dna或rna合成仪是本领域技术人员常规使用的并且可以从不同供应商购买获得，如appliedbiosystems(达姆施塔特，德国)、biolytic(纽瓦克，美国加利福尼亚州)、gehealthcare或bioautomation(普莱诺，美国得克萨斯州)。如在本发明情境下所使用，特征“提供生物样品”是指适于制备含有至少两种不同的目标寡核苷酸的组合物或者在进一步分析中待检测的寡核苷酸群体的各种方法。这些方法包括但不限于适于制备细胞或组织提取物的标准生化和/或细胞生物学方法，其中细胞和/或组织可以来自含有至少两种目标寡核苷酸的任意种类的生物体。例如，本发明的样品可以是细胞提取物或组织提取物，包含经纯化的总rna和/或经尺寸分级的总rna，例如来源于在细胞培养中生长的或通过解剖和/或手术从生物体获得的一个或多个细胞。特别地，本发明的生物样品可以从一个或多个患者或任意种类的活体对象的一个或多个组织获得。从细胞、细胞提取物或组织中提供生物样品可以包括一个或多个生化纯化步骤，例如离心和/或分级，通过机械或化学破坏步骤例如多次冻融循环、盐处理、酚-氯仿提取、十二烷基硫酸钠(sds)处理和蛋白酶k消化的细胞裂解。任选地，提供本发明的生物样品还可以包括在聚乙烯或盐存在的条件下通过沉淀除去大rna(如丰富的核糖体rrna)或者在存在盐的条件下(优选地在存在氯化钾溶液的条件下)通过沉淀除去有干扰性的十二烷基硫酸钠(sds)。从细胞和/或组织中纯化总rna的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如诸如使用硫氰酸胍-酸性苯酚-氯仿提取(例如invitrogen,美国)的标准方法。然而，在本发明的情境下，同样优选的是在不进行本申请所述的任何沉淀和/或纯化步骤的情况下提供生物样品。也就是说，在一个优选的实施方式中，本发明的生物样品可以仅在存在sds的条件下进行蛋白酶k消化。在存在sds的条件下将生物样品消化后，可以随后通过在盐存在的条件下(优选地在存在钾离子的条件下)的沉淀步骤将有干扰性的十二烷基硫酸钠(sds)除去。然而，同样优选的是在存在蛋白酶k(优选地通过酶促蛋白酶k消化)但不存在sds的条件下提供或处理生物样品。在这种情况下，可以省略所有去除有干扰性的sds的沉淀步骤。而且，本发明的生物样品还可以含有或者被补充入一种或多种合成分子，如具有已知浓度和/或已知分子量的合成的寡核苷酸分子，其可以作为用于定量和/或定量荧光读数的内部标准品。作为内部标准品使用的合成分子可以通过具有不同浓度和/或具有不同分子量的分子混合物的形式提供，或者以不同的系列稀释物的形式提供。在所有实施方式中，合成的寡核苷酸分子优选是荧光标记的并且以与目标生物样品相同的方式处理。可以作为本应用情境下的内部标准品的适宜分子可以包括，但不限于，与至少两个目标寡核苷酸的目标序列对应的或与其片段对应的合成的寡核苷酸。或者，生物样品可以含有至少三种(优选地五种)不同浓度的荧光标记的合成分子，该合成分子的序列对应于待检测的目标寡核苷酸序列的不同长度。例如，对于检测长度为20个核苷酸的目标寡核苷酸而言，可以分别使用长度为8、11和14个核苷酸的荧光标记的合成的寡核苷酸分子作为定量的内部标准品。或者，荧光标记的寡核苷酸可以具有超过待检测的目标寡核苷酸原始长度的不同长度。例如，对于检测长度为20个核苷酸的目标寡核苷酸而言，可以分别使用长度为24、28和32个核苷酸的荧光标记的合成的寡核苷酸分子作为定量荧光读数的内部标准品。在此处，荧光标记的寡核苷酸可以对应于待检测的目标寡核苷酸的序列，并且还可以包含额外的，优选地人工设计的，不与目标靶序列对应的核苷酸延长段。通常情况下，在本发明的情境下，用于内部定量的荧光标记的寡核苷酸优选是合成的。而且，优选地，在通过阴离子交换hplc色谱对其进行分离前，作为内部标准品使用的荧光标记的寡核苷酸将以与目标目标寡核苷酸相同的方式和其各自的检测分子杂交。也就是说，使用如本申请所述的内部标准品所进行的定量依赖于双体(duplex)的形成、洗脱和通过阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)的分离，其中内部标准品的双体包含与检测分子的互补序列杂交的荧光标记的寡核苷酸。更优选地，为了定量读数，将荧光标记的寡核苷酸与目标生物样品一起在一个实验设置中，特别是作为同一次aex-hplc柱运行的一部分，从阴离子交换柱中分离和洗脱。在这样的设置中，定量读数取决于内部标准品的寡核苷酸双链产生的不同峰高和/或不同峰面积与各检测分子-目标寡核苷酸部分产生的洗脱峰的峰高和/或峰面积之间的比较。使用内部标准品进行定量荧光读数是本领域技术人员熟知的和在实验室实践中常规使用的，并且有市售的软件程序用于在定量的基础上计算、比较、整合和/或量化洗脱峰的峰高和/或峰面积(例如thermofisher、waters、shimadzu、agilent,美国)。本发明的生物样品的示例包括但不限于，例如从个体，优选地从患有特定疾病的个体，优选地从患有肾病的，更优选地从患有肾损伤的个体获得的血液、血浆、尿液、粪便、肝、肺、脊髓液或任意其他细胞、组织和/或组织活检样品。因此，在一个优选的实施方式中，生物样品是从一个或多个个体(包括非人和人类对象)中获得的样品，优选地以组织活检样品形式，更优选地以细胞、组织或液体形式。然而，同样优选的是生物样品来自例如生物或生化测定、分子遗传测定、细胞培养测定或小鼠的实验设置或体外或体内实验。本发明的生物样品还可以选自下组：血液、血浆、尿液、粪便和脊髓液样品，包括来自肝、肺、肾、乳房、前列腺、心脏或脑的组织和/或细胞样品。在一个优选的实施方式中，生物样品是血浆样品。在本发明的情境下，术语“检测分子”通常指适于通过互补碱基配对与目标寡核苷酸序列退火从而形成具有两条互补链的双体的任意种类的分子。而且，本发明的检测分子应含有荧光部分，其允许对所述至少两个目标寡核苷酸在杂交以后进行检测、分析和/或成像。在通常情况下，至少两个目标寡核苷酸不是荧光标记的。本发明的适宜的检测分子包括但不限于各种各样的具有中性净电荷的合成设计的和/或生产的分子，如肽核酸(pna)、磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和ugimer。也就是说，本发明的检测分子，优选地，特征在于具有中性骨架电荷，特别是特征在于缺乏任何带电的离子基团，例如带负电荷的磷酸酯基团。因此，在一个优选的实施方式中，检测分子选自下组：肽核酸(pna)、磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和ugimer。本发明的检测分子通常被合成以匹配目标核苷酸序列并且可以使用其在分子水平上检测、分析和/或成像所述核苷酸序列。对于本领域技术人员将是显而易见的是，本发明的检测分子具有适于提供与其靶分子的退火所需的特异性的长度。本发明的检测分子由若干核苷酸组成，优选地至少10个、更优选地至少15个核苷酸，并且优选地包含以荧光标记形式存在的至少一个荧光部分。在一个优选的实施方式中，在本发明情境下使用的检测分子具有从10至30个核苷酸的长度，优选地从10至20个核苷酸的长度，更优选地从15至20个核苷酸的长度。如在本申请中使用的，术语“肽核酸(pna)”通常是指任意种类的核酸类似物，其中的天然核酸的糖磷酸骨架已经被替代为由重复的缺少任何带电磷酸基团的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元所形成的合成肽骨架。任选地，肽核酸还可以包含任意种类适宜的非甘氨酸单元和/或可能允许或有助于引入一个或多个其他标记或化学修饰的连接试剂。在通常情况下，肽核酸是客户设计和化学合成的。也就是说，在本发明的情境下，肽核酸被特别设计以匹配各个目标寡核苷酸，其优选地指肽核酸的序列与待检测的目标寡核苷酸的序列是互补的。肽核酸是本领域技术人员熟知的并且可以从多个供应商处购买得到，包括例如biosynthesisinc.,美国或panagene(韩国)。磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)是非离子dna类似物，并且因此其是一种在本发明的情境下可以作为检测分子的独特类型的寡核苷酸类似物。pmo的非离子特征及其抗降解性使得其适合作为检测分子，用于定量检测本发明的等长的寡核苷酸。因此，在本发明的情境下，由于可以基于目标基因序列数据对其进行合理设计，可以将磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)作为肽核酸同样适宜的替代物。磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)是本领域熟知的(参见例如summertonj,wellerd(1997),antisensenucleicaciddrugdev,7:187–95)并且可以从多家公司购买获得，包括例如genetools有限责任公司,美国。ugimer是肽核酸的又一个替代物，在本发明的情境下可以将其作为检测分子。ugimer是基于非天然肽核酸(pna)骨架，并且因此具有pna的所有优点，包括具有强空间阻滞效能、高靶标特异性、高稳定性、低毒性和低激发免疫应答的风险。可以通过沿着pna骨架引入特定侧链对ugimer进行修饰，这可以显著增加其在水中的溶解度并能够选择性调节其总表面电荷，包括偶联用于荧光检测的荧光部分。ugimer可以从例如ugichemgmbh,因斯布鲁克,奥地利公司购买获得。本发明的检测分子可以优选地，但不是必须地，被设计为与其寡核苷酸目标序列具有100％互补性。如果认为适当，还可以将检测分子设计为与寡核苷酸目标序列具有低于100％的互补性。然而，检测分子与其目标寡核苷酸序列之间的互补性必需达到足够的程度，以提供与目标寡核苷酸的特异性结合并因此对其进行荧光检测。互补程度将根据具体情况确定，其取决于各目标分子和各实验设置。对检测分子(如肽核酸)的设计对本领域技术人员而言是常规的方法，并且可以通过生物信息学方法辅助。随着被克隆的基因数量增加，可以很容易地基于任何公开的cdna序列和/或基因库的记录设计肽核酸、ugimer或pmo。具有来自不同生物体的基因组序列的数据库是本领域技术人员公知的，并且包括例如来自ncbi(美国国家生物信息中心或microrna注册数据库)的所有公共数据库。在本发明的情境下使用的检测分子的特征进一步在于具有不同的总表面电荷。如在本申请中使用，术语“不同的表面电荷”通常指，在本发明的情境下使用的至少两种检测分子的总表面电荷彼此之间不同。特别地在本发明的情境下，不同的表面电荷是指，检测分子例如肽核酸带有的负电、正电或电中性达到可区分的程度，使得它们能够在阴离子交换色谱的过程中改变等电荷的目标寡核苷酸分子的结合亲和性。特别地，在本发明的情境下使用的多个检测分子的不同的表面电荷能够在与其各自的目标序列退火后，仅通过一个阴离子交换色谱步骤就以较高分辨率从一个生物样品中平行地分离等长的目标寡核苷酸。在本发明的情境下，至少两个检测分子的不同表面电荷是因为引入了化学修饰，如引入带正电和/或带负电的其他氨基酸和/或改变各分子的总表面电荷的其他官能团。在与各目标序列杂交后仍然保持这样的差异。在本发明的情境下，可以设想，将根据特定的感兴趣的目标分子的结构特征和要求，来确定在检测分子中待引入的化学修饰的数量和/或种类，即设计各个总表面电荷。也就是说，当设计经化学修饰的检测分子的表面电荷时，需要考虑各个目标分子的表面电荷。可以改变检测分子如肽核酸或ugimer的总表面电荷的化学修饰包括，但不限于，具有带正电或带负电的侧链的任意种类的氨基酸，以及能够被引入肽核酸或ugimer骨架但不改变分子与其各自的靶序列特异性退火和结合的功能的其他带正电或带负电的化学接头和/或分子。优选地，将化学修饰引入检测分子的任意一端，例如在肽核酸的n’-末端或c’-末端，更优选地在n’-末端和c’-末端。然而，同样优选的是将化学修饰引入肽核酸或ugimer的骨架，优选地其中将化学修饰与n-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架的γ位连接。将这些种类的经化学修饰的pna称为所谓的γ-pna。肽核酸和ugimer都同样适用于通过将其他表面电荷引入其骨架(特别是与γ位连接)进行修饰。经化学修饰的肽核酸或经化学修饰的ugimer可以从多种渠道购买获得并且例如可以从paranege(韩国)或ugichemgmbh,奥地利购买。在本发明的情境下提及的术语“与……互补”，通常指多核苷酸通过互补碱基配对的方式与感兴趣的目标序列特异性结合的能力。在两个彼此互补的核苷酸分子(其可以包含或可以不包含一个或多个修饰)之间形成互补的碱基对。在本发明的情境下，例如在检测分子与目标寡核苷酸分子之间形成的互补碱基对可以包括各种各样的标准或非标准的碱基对，其包括但不限于watson-cricka-u、watson-cricka-t、watson-crickg-c、g-uwobble碱基对、a-u和a-c反向hoogsteen碱基对或者嘌呤-嘌呤和嘧啶-嘧啶碱基对如经剪切的g-a碱基对或g-a亚氨基碱基对。优选地，术语“与……互补”指标准碱基对。如在本申请中所使用，术语“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”通常指两个互补的寡核苷酸链的退火，并且特别指至少两个检测分子与其互补的目标寡核苷酸的退火。成功的杂交取决于多种因素，包括温度、盐浓度和/或ph。杂交的最佳温度优选在低于tm值5-15℃的范围内，tm定义为杂交体的解链温度(tm)，即50％的双链寡核苷酸链分离的温度。用于计算tm值的各种公式是本领域技术人员公知的。有助于在本发明情境下进行杂交的条件包括，使用含有使双体的形成最大化并且抑制检测分子与其靶序列的非特异性结合的试剂的缓冲液。如有需要，可以针对每个反应对各检测分子(如在特定实验情境下使用的特定肽核酸)的终浓度进行优化。有助于杂交的条件还包括将检测分子与目标分子孵育足够长的一段时间以使得能够达到最佳退火。优选地，本发明的杂交是指将检测分子(如肽核酸)与其目标分子在溶液中孵育(优选地通过形成杂交混合物)的杂交条件。例如在实施例部分有对本发明的杂交条件进行的详细说明。本发明的杂交优选地通过将样品加热至70℃至80℃之间的温度，并且随后将样品冷却至5至15℃的温度来实施。在特定情况下，还可以在室温(即约25℃)下进行杂交。而且，根据具体的情况，例如考虑到并依赖于ph，可以优选对温度条件进行优化。本领域技术人员可以容易地进行此类优化。如在本申请中所使用，术语“荧光部分”通常指能够附接至和/或连接至本发明的检测分子的任何物质或试剂，其可以用于在其与靶序列杂交后通过荧光读数的方法对目标寡核苷酸进行成像和/或定量。在本发明的情境下，荧光部分优选是设计用于高灵敏度应用如荧光显微镜、流式细胞术或原位杂交的荧光标记或荧光团。常规使用的荧光标记包括但不限于荧光素染料、罗丹明染料或花青染料。本发明优选的荧光标记包括各种atto染料并且优选荧光标记atto425、atto520和atto610等。荧光标记还可以是选自下组的：荧光素染料如羧基荧光素(fam)、6-羧基-4′,5′-二氯-2′7′-二甲氧基荧光素(joe)、异硫氰酸荧光素(fitc)或5'-六氯荧光素-ce-亚磷酰胺(hex)；罗丹明染料如羧基-x-罗丹明(rox)、德克萨斯红和四甲基罗丹明(tamra)，花青染料如吡喃鎓花青染料、dy548、quasar570或染料如cy3、cy5、alexa568等。荧光标记的选择通常取决于其光谱性质和是否有可用的成像设备。在定量测定中使用荧光标记是本领域技术人员熟知的标准方法，并且荧光标记可以从包括例如invitrogentm(美国)在内的多个供应商处购买获得。在一个优选的实施方式中，在本发明的情境下使用的至少两个检测分子均经具有相同种类的荧光部分标记。使用相同的荧光标记能够仅使用一个检测通道进行荧光读数，即可以仅在一个波长下进行荧光读数。仅使用一个荧光检测通道不仅方便了整个实验设置，而且还能够更加简便和可靠的进行定量荧光读数。然而，在本发明的情境下同样优选的是，在至少两个检测分子的情境下的荧光标记种类是不同的，即，使用具有不同种类的荧光部分对检测分子进行标记。本发明的方法原则上适用于对各种长度的寡核苷酸进行检测。然而，如本申请所述的方法特别适于对具有相同或相似长度的数个寡核苷酸，包括例如小调控性rna分子如microrna、治疗性寡核苷酸如sirna、反义寡核苷酸或诱饵寡核苷酸，进行多重检测。在本发明的情境下，术语“检测(detection)”或“检测(detecting)”通常指对目标杂交检测分子-寡核苷酸部分进行成像、分析和/或定量。特别地，术语“检测(detecting)”指适于通过荧光读数的方法对荧光标记的分子进行检测的本领域公知的任何方法。如在本申请中所使用，术语“检测分子-寡核苷酸部分”指由荧光标记的检测分子(优选地肽核酸)与其互补的寡核苷酸靶序列杂交组成的复合物。因此，本发明的检测分子-寡核苷酸部分指双链分子或双体结构。在阴离子交换色谱过程中，双链分子与游离的、未杂交的检测分子分离，后者在hplc系统的空体积中洗脱。本发明的实施例对根据本发明的检测分子-寡核苷酸部分的分离和纯化进行了进一步的举例说明。在本发明的情境下，检测分子-寡核苷酸部分优选地指，由荧光标记的肽核酸与其各自的来源于待分析生物样品的寡核苷酸靶序列组成的双体。术语“定量荧光读数”通常指本领域公知的适于当目标寡核苷酸与其各自的检测分子杂交时，从样品中对其进行目测观察、检测、分析或定量的各种成像方法。本发明的定量荧光读数包括将峰高、峰宽和/或峰面积与如本申请所述的内部标准品进行定量比较，或者与外部校正曲线形式的外部标准品进行定量比较。本发明的定量荧光读数例如在实施例的图8至13中举例说明。还可以将本发明的方法成功用于从一个样品中平行地检测两个以上目标寡核苷酸。也就是说，在一个优选的实施方式中，将本发明的方法用于在一项实验设置中平行地检测多个等长的寡核苷酸，如平行地检测三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个不同的寡核苷酸。在这种情况下，目标寡核苷酸的长度可以是相同的或相似的或者两者兼有。也就是说，如果采用本发明的方法平行地检测几个不同目标寡核苷酸，例如共计七个不同的目标寡核苷酸，则这些目标寡核苷酸中的四个可以具有相同的长度，而其余的三个目标寡核苷酸可以是相似长度，即长度相差一个或多个核苷酸，优选最多相差五个寡核苷酸。因此，在另一个优选的实施方式中，本发明的方法用于从一个生物样品中平行地定量检测三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个不同的寡核苷酸。优选地，至少两个等长的不同寡核苷酸由dna或rna核苷酸组成。也就是说，待检测的至少两个不同的寡核苷酸优选地是dna或rna寡核苷酸。更优选地，至少两个等长的不同寡核苷酸选自下组：mirna(mirna)、小干扰rna(sirna)、短活化rna(sarna)、诱饵寡核苷酸、反义寡核苷酸、适体和镜像异构体(spiegelmer)。在本发明的情境下等同使用的术语“mirna”或“microrna”通常指在细胞中内源性表达的长度较短的rna分子。特别地，术语“mirna”指长度约20至25个核苷酸的单链rna，其通常由长度约70个核苷酸的内源性发夹形前体分子产生。在人、动物、植物和病毒的基因组中分别发现了编码mirna的基因。术语“小干扰rna”或“sirna”通常指通过将dsrna分子外源性递送进入细胞后产生的、将长dsrna转基因表达后产生的rna分子，或者通过基因转移、细胞转染或细胞转导而引入细胞的rna分子，或者在细胞中内源性表达的rna分子。术语“sirna”还指参与rna干扰和基因沉默的小调控性rna分子，优选地，其导致目标rna的转录物降解。小干扰rna可以是单链rna或者可以是由两条独立的rna链(即正义链和反义链)组成的双链rna。小干扰rna的长度通常是18-30个核苷酸。“短活化rna”或“sarna”通常指能够靶向基因启动子中的序列从而诱导靶基因表达的任意种类的双链rna(dsrna)分子，也将这种现象称为dsrna诱导的转录活化。也就是说，sarna是本领域技术人员公知的通过靶向启动子区域在人类细胞中诱导转录活化的小dsrna(参见例如li等，2006,procnatlacadsciusa103:17337–17342；janowski等，2007,natchembiol3:166-173)。术语“诱饵寡核苷酸”通常指能够在活细胞中特异性抑制转录因子功能的任意种类的反义剂。优选地，诱饵寡核苷酸是类似于和/或模拟核酸或蛋白(例如转录因子)的互补序列从而阻止转录因子与靶基因的启动子区域结合的dna或rna的短合成片段。如在本申请中使用的术语“反义寡核苷酸”指具有与特定目标mrna分子的序列互补的序列的任意种类的dna或rna寡核苷酸。在与其靶序列杂交后，反义寡核苷酸能够特异性抑制靶mrna的表达，其结果是导致遗传信息从dna向蛋白转移的阻断。本发明的反义寡核苷酸还指通过与靶序列退火从而激活经由rnaseh的酶促剪切，进而抑制基因表达的任意寡核苷酸。反义寡核苷酸是本领域熟知的治疗剂或研究基因功能的工具(综述参见例如dias和stein,2002,molecularcancertherapeuticsvol.1,347–355)。在本发明的情境下，“适体”通常指与特定靶分子结合的各种寡核苷酸分子。适体通常是从大量的随机序列池中选择得到的，但是也存在天然适体。如在本申请中使用的术语“适体”还包括已经通过多轮体外选择或等同地，通过selex(指数式富集配体的系统进化)进行工程改造以结合各种分子靶点(如小分子、蛋白、核酸以及甚至细胞、组织和生物体)的核酸适体。适体在生物技术和治疗应用中是有用的，因为其提供了与抗体相当的分子识别性质。除了其区分识别以外，适体提供了优于抗体的优点，因为可以完全在试管中对其进行工程改造，其能够容易地通过化学合成生产，具有理想的储存性质并且在治疗应用中很少引起或没有免疫原性。“镜像异构体(spiegelmer)”通常指l-核糖核酸适体或l-rna适体。镜像异构体是由l-核糖单元构成的rna样分子。镜像异构体是一种被称为天然寡核苷酸镜像的人工寡核苷酸。镜像异构体或者l-rna适体是适体的特殊形式。由于其是l-核苷酸，因此其对核酸酶的降解具有高度抗性。镜像异构体被认为是一种潜在的治疗药物，已在临床试验中对其进行了常规测试。如已经描述的，在本发明的情境下使用的检测分子的不同表面电荷必须被设计为，当与它们的靶序列退火后，它们能够改变各自等长的目标寡核苷酸在阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)情境下，特别是当被用于色谱柱并且随后从色谱柱中洗脱分离时的结合亲和性。根据待检测的目标靶分子，可以根据具体情况，确定为将目标寡核苷酸的总表面电荷改变为更高的正的或负的表面电荷范围所适用的或所必需的在检测分子中的额外的化学修饰的数量。在通常情况下，在本发明的情境下使用的所述至少两个检测分子可以包含各种程度的几种不同的表面电荷，包括额外的中性、额外的正电荷、额外的负电荷、多个额外的正电荷和/或多个额外的负电荷。也就是说，本发明的检测分子(优选地肽核酸)可以彼此之间存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个正表面电荷的差异，或者存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个负表面电荷的差异，或者这些选择的任意组合。在本发明的实施例部分(特别是在图3、5和10至13中，包括表3和5)进一步描述了用于成功分离等长的目标寡核苷酸的在本发明的情境下使用的不同表面电荷的组合。因此，在一个优选的实施方式中，至少两个检测分子的不同表面电荷选自下组：中性、负电荷和正电荷，优选地选自中性和负电荷的组合、中性和正电荷的组合和/或负电荷和正电荷的组合，更优选地选自多个负电荷、多个正电荷或其任何组合。也就是说，在一个优选的实施方式中，至少两个检测分子(优选地至少两个肽核酸)的不同表面电荷选自下组：中性、6个额外的负电荷和5个额外的正电荷。在例如图3、图5和表3中举例说明了，使用阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)和具有这种选择的表面电荷的检测分子从一个样品中对至少两个不同的寡核苷酸平行进行的分离。同样优选的是至少两个检测分子(优选地至少两个肽核酸)的不同表面电荷选自下组：中性、4个额外的负电荷和8个额外的负电荷。在例如图11、图12和表5中举例说明了，使用阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)和具有这种选择的表面电荷的检测分子对至少两个不同的寡核苷酸平行进行的分离。同样优选的是如上所述的不同表面电荷的任意组合。也就是说，可以预期具有不同表面电荷的检测分子的任意组合以在对特定目标分子进行洗脱的过程中通过阴离子交换色谱能够提供充分的和理想的高度分离，并且可以将其应用于本发明的情境下，其包括中性和多个负和/或多个正表面电荷的组合，或者多个负电荷与多个正表面电荷的组合，或者多个正电荷的任意组合，或者仅多个负表面电荷。如在本申请中所使用，术语“多个电荷”通常指存在2、3、4、5、6、7个或8个额外的负电荷和/或正电荷，即2、3、4、5、6、7个或8个负电荷和/或正电荷形式的净电荷差异。优选地，本发明的“多个电荷”还包括各个检测分子净电荷的更高的差异，例如9、10、11个或12个额外的正电荷和/或负电荷。对本领域技术人员显而易见的是，在本发明的情境下使用的检测分子的不同表面电荷必须被设计以使得通过阴离子交换色谱就能对目标寡核苷酸以足够高的分辨率进行分离，即当各个靶分子和与其各自互补的检测分子复合时，其结合亲和性被改变，这样就能在洗脱谱图中将靶序列彼此独立地分离。也就是说，可以预期本发明的检测分子(特别是肽核酸)可以包含适于相应地改变分子表面总电荷的各种化学修饰的不同组合。也就是说，本发明的至少两个检测分子(优选地至少两个肽核酸)可以包含电中性与几个正电荷和/或几个负电荷的组合。适于提供高分辨率的生化分离性质的化学修饰的每种组合是可以预期的并且可以将其用于本发明的情境下。在例如实施例部分(特别是在图10至13中)详细描述了通过使用例如具有中性、正的和负的总表面电荷的肽核酸利用阴离子交换色谱以高分辨率对等长的寡核苷酸进行色谱分离。在一个优选的实施方式中，负表面电荷的特征在于存在至少两个引入的带负电荷的氨基酸残基或氨基甘氨酸骨架修饰，优选地其中带负电荷的氨基酸残基是谷氨酸形式。在另一个优选的实施方式中，正表面电荷的特征在于存在至少两个引入的带正电荷的氨基酸残基或氨基甘氨酸骨架修饰，优选地其中带正电荷的氨基酸残基是赖氨酸形式。谷氨酸和赖氨酸是优选的带电氨基酸的例子，可以将其作为化学修饰以分别将一个或多个额外的正电和或负电荷引入肽核酸。可以改变检测分子(特别是肽核酸)的总表面电荷的其他氨基酸是同样优选的。具有不同电荷的氨基酸是本领域熟知的并且是本领域技术人员的公知常识。同样优选的是通过一个或多个氨基甘氨酸骨架修饰(优选地通过氨基甘氨酸单元的γ位)将额外的正电荷和/或负电荷引入检测分子的骨架(特别是引入肽核酸的骨架)。在一个优选的实施方式中，可以将氨基酸修饰与氨基甘氨酸骨架修饰组合。也就是说，在一个优选的实施方式中，至少两个检测分子(优选地至少两个肽核酸)包含额外的带电荷(带正电荷或负电荷或者这两者)的氨基酸形式的化学修饰、与氨基甘氨酸骨架连接(优选地通过γ位)的额外的带电荷基团(带正电荷或负电荷或者这两者)形式的化学修饰、或者其任意组合。在这个实施方式中，肽核酸的净电荷是决定化学修饰程度的重要标准。在实施例中进一步举例说明了根据本发明的经修饰的肽核酸的实例。在本发明的情境下，术语“形成杂交混合物”通常指在提供的条件下，本发明的荧光标记的检测分子能够与其目标寡核苷酸序列杂交，即在该条件下检测分子能够与其靶序列结合。至少两个检测分子与其至少两个不同的寡核苷酸目标序列之间的杂交包括互补碱基对的形成，其定义为氢键的形成和疏水性相互作用达到平衡。也就是说，两条互补链的退火和分离取决于多种因素，包括温度、盐浓度、ph、探针和靶分子的性质以及杂交溶液的组成。本发明的有利于成功杂交的条件还包括使用杂交缓冲液，其中含有能最大化地形成双体并且抑制各个检测分子与非靶序列的非特异性结合的试剂。在本发明的情境下，还发现在部分变性条件下形成杂交混合物可能是有利的，因为其显著降低杂交部分的降解。因此，在一个优选的实施方式中，在变性条件下形成杂交混合物。特别地，在根据本发明的变性条件下的杂交可以在存在变性剂的条件下进行，变性剂包括但不限于尿素、福尔马林、二甲基甲酰胺(dmf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)、二甲亚砜(dmso)和硫氰酸胍。通过实施例(包括图5)进一步举例说明了在部分变性条件下的杂交。因此，在一个优选的实施方式中，在存在浓度为1m至5m的尿素的条件下(更优选地在存在浓度为2m至4.5m的尿素的条件下)形成杂交混合物。在本发明的情境下，还发现在升高的温度下进行阴离子交换色谱可获得更好的分离性质。由于肽核酸-靶双体的稳定性得到改善，因而能够在高温下洗脱杂交部分。在实施例部分进一步举例说明了本发明的在升高的温度下对杂交的肽核酸-寡核苷酸部分进行的洗脱。因此，在本发明的情境下，在步骤c)中，阴离子交换高效液相色谱(aex-hplc)优选地在从30℃至75℃的温度下，优选地在从40℃至55℃的温度下，更优选地在50℃的温度下进行。而且，通过定量荧光读数来检测杂交的检测分子-寡核苷酸部分。本发明的定量荧光读数涉及使用内部或外部标准品。已在本发明的情境中描述了使用内部标准品的定量荧光读数。或者，并且同样优选的是定量荧光读数涉及以与外部校正曲线进行比较的形式使用外部标准品。因此，在一个优选的实施方式中，步骤d)的定量荧光读数的特征在于将杂交的检测分子-寡核苷酸部分的荧光信号与内部标准品或外部校正曲线形式的外部标准品的荧光信号进行比较。优选地，外部校正曲线来自已知浓度或已知摩尔质量的靶分子的系列稀释物，其在与目标样品相同的条件下进行了处理，特别是将靶分子与荧光标记的检测分子杂交。在该情境下，荧光标记的检测分子优选地选自下组：荧光标记的肽核酸、磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和ugimer。而且，本发明的外部校正曲线优选地由包含靶分子及其各自经荧光标记的检测分子的等摩尔浓度的混合物的至少3个(优选地5个)不同浓度的系列稀释物产生。在本发明的实施例中，如图9，举例说明了通过将荧光信号与外部校正曲线进行比较进行的定量荧光读数。在该情境下，荧光标记的检测分子通常被合成为与目标核苷酸的序列相匹配，并且可以用于在分子水平上检测、分析和/或成像所述核苷酸序列。对本领域技术人员显而易见的是，本发明的检测分子具有适于提供与其靶分子特异性退火所需的长度。检测分子优选地由至少10个核苷酸，更优选地至少15个核苷酸组成，并且优选地包含荧光标记形式的至少一个荧光部分。在又一个方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)与至少两个等长的不同目标寡核苷酸互补的至少两个检测分子，其中每个检测分子经至少一个荧光部分标记，并且其中检测分子的特征在于具有不同的表面电荷；和(ii)杂交混合物，其中所述杂交混合物优选地含有蛋白酶k和蛋白酶k消化缓冲液。试剂盒的检测分子优选地选自下组：肽核酸(pna)、磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和ugimer。更优选地，试剂盒的检测分子是肽核酸形式。如在本申请中所使用，术语“杂交混合物”通常指能够使生物样品混悬(包括优选地使所提供的检测分子和/或任意其他荧光标记分子混悬)的任意种类的水溶液、缓冲液或液体。杂交混合物提供适用于将检测分子与其各靶序列杂交的适宜水性条件，并且因此可以含有在特定ph值(如ph7或8)下的任意种类的盐或缓冲系统。对本领域技术人员显而易见的是，本发明的试剂盒还可以含有多种标准组分，如终止特定反应的缓冲液和/或试剂。本领域技术人员将能够根据主要用途来调整试剂盒的成分，其取决于例如检测系统、所考察的细胞和/或组织、待检测寡核苷酸的目标序列、荧光标记等。优选地，本发明的试剂盒包含分别使用至少一个荧光部分标记的至少两个检测分子，其中所述荧光标记具有相同的种类。因此，在一个优选的实施方式中，试剂盒的至少两个检测分子分别使用相同的荧光部分标记，荧光部分优选地选自但不限于下组：atto425、atto520和atto610。使用相同荧光部分具有的优点是可以仅在一个波长下进行定量荧光读数，这不仅方便了实验设置，而且还为定量比较和荧光读数提供了改进的基础。然而，同样优选的是使用具有相同种类的至少两个荧光部分分别对至少两个检测分子进行标记。在本发明的情境下可以进一步预期的是，可以使用具有相同种类的两个以上的荧光部分(例如使用具有相同种类的至少3、4、5个或6个荧光部分)分别对至少两个检测分子进行标记。或者，本发明的试剂盒可以包含与至少两个不同的等长目标寡核苷酸互补的至少两个不同的检测分子，其中所述检测分子分别经具有不同种类的至少一个荧光部分(如atto425和atto610、atto425和atto520、或者atto520和610)标记。本领域技术人员将理解，对不同荧光标记的种类的选择将取决于具体的实验设置。在另一个优选的实施方式中，至少两个检测分子分别经至少一个荧光部分标记，优选地经具有不同种类的至少两个荧光部分标记。同样优选的是，可以预期，在对多种不同的目标寡核苷酸进行多重检测的情况下，试剂盒包含若干不同的荧光标记的检测分子。也就是说，在一个优选的实施方式中，试剂盒可以包含用于对至少3、4、5、6、7、8、9个或10个等长的不同寡核苷酸进行平行定量检测的3、4、5、6、7、8、9个或10个不同的检测分子。同样优选的是，试剂盒可以包含用于对甚至超过10个的不同目标寡核苷酸进行平行定量检测的甚至超过10个不同的检测分子。在该情境下，对本领域技术人员而言显而易见的是，从最佳实验结果的角度选择荧光标记，即荧光标记可以是相同的或不同的或者两者都有，只要可以适于最佳色谱分辨率和对特定的一系列不同目标靶点进行分离即可。在另一个优选的实施方式中，试剂盒还包含与至少两个检测分子的结合位点互补的至少一个荧光标记的分子，其中该结合位点不参与靶序列的结合。也就是说，在这个优选实施方式的情境下，将所述至少两个检测分子设计为包含针对所述至少一个荧光标记分子的至少一个额外的结合位点，其中该结合位点不与任何目标靶序列互补。因此，所述至少两个检测分子优选地含有不参与靶序列结合的结合位点。进一步在这个实施方式中，所述至少两个检测分子优选地标记有与荧光标记的分子中相同的荧光部分。如在本申请中所使用，术语“荧光标记的分子”通常指具有中性表面电荷的任意种类的分子，其可能能够与在特定检测中使用的检测分子中特定的、普遍存在的(ubiquitous)结合位点退火。额外的荧光标记的分子退火是为了增加各个检测分子产生的荧光信号。在该情境下，荧光标记的分子优选地选自但不限于下组：肽核酸、磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和ugimer。通过使用一种或多种额外的荧光标记的分子，可以显著增加本申请所述方法的灵敏度。使用一种或多种额外的荧光标记的分子特别适于检测低丰度的目标寡核苷酸。优选地，将额外的荧光标记的分子设计为在各检测分子(优选地各肽核酸)的特定结合位点发生结合，该结合位点不参与特定目标寡核苷酸靶序列的结合。该结合位点可以是一段核苷酸的形式，其被设计为能够与互补的额外的荧光标记分子退火和/或杂交。在本发明的情境下，结合位点可以由约10至20个或者更多的核苷酸组成，并且其可以是被认为适于与目标寡核苷酸分子建立互补碱基配对的任何序列。结合位点优选地不是待检测的寡核苷酸序列。通用引物结合位点序列(如回文序列)是本领域技术人员熟知的，并且例如可以从包括ncbi基因库(美国国家生物技术信息中心，马里兰州,美国)在内的公共数据库获得。原则上，此类荧光标记的分子可用于提高如本申请所定义的检测分子所产生的荧光读数的灵敏度，这在本发明方法的情境下也是适用的并且可以预期的。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法还包括向生物样品或向杂交混合物中加入荧光标记的分子的步骤，其中荧光标记的分子与所述至少两个检测分子的结合位点互补，该结合位点不参与靶结合。在这个实施方式中，至少两个检测分子优选地使用与荧光标记的分子相同的荧光部分标记。在又一个方面，本发明涉及如在本发明情境中所定义的至少两个检测分子用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个等长的不同寡核苷酸的用途，其中所述检测优选地根据本申请所述的任意实施方式的定义实施。如本发明的情境中所定义的至少两个检测分子可用于从一个生物样品中平行地定量检测至少两个不同的寡核苷酸的用途，这特别适于诊断目的的情境，例如，用于诊断伴有一个或多个特定靶序列的增加或减少的特定疾病，这些靶序列反过来又可以作为诊断特定疾病的生物标记物。因此，在一个优选的实施方式中，如本申请所定义的至少两个不同的检测分子的用途是用于诊断目的，特别是用于诊断疾病，更特别地是用于诊断肾病如急性肾损伤。在例如图13中举例说明了在诊断目的的情境下，至少两个不同的寡核苷酸用于定量检测至少两个目标寡核苷酸的靶序列的用途，特别是对作为急性肾损伤的生物标记物的特定目标序列进行定量检测。下述附图和实施例旨在说明本发明的各种实施方式。因此，不应将其中讨论的具体修改理解为是对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将是显而易见的是，可以在不脱离本发明范围的前提下进行各种等同替换、改变和修改，并且因此应当理解此类等同的实施方式将包括在本申请中。附图说明图1a：使用赖氨酸在肽核酸骨架上的γ修饰的图示。图1b：通过马来酰亚胺环结构与半胱氨酸偶联的荧光染料atto425的图示。图1c：通过nhs酯偶联的荧光染料atto425和o-接头的化学结构的图示。图2：肽核酸的表面电荷对保留时间的影响。色谱实验设置：hplc系统1，-100-柱，柱温为50℃，缓冲液ph8以及在9分钟内由5％到55％梯度变化的缓冲液b。图3：比较由三个双体mir16-γ位正电荷、mir16-中性和mir16-带负电得到的色谱图。在分别加热至95℃和室温(rt)后杂交温度为0℃。色谱实验设置：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在9分钟内由5％到55％梯度变化的缓冲液b。图4：比较在0h、5.5hrs和11hrs的孵育时间后mir16-γ位正电荷的色谱图。色谱实验设置：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由5％到55％梯度变化的缓冲液b，并在25℃且不存在尿素的条件下杂交。图5：比较在有或没有4.5m尿素的条件下使用mir16-γ位正电荷、mir16-中性和mir16-带负电进行杂交的设置。色谱实验设置：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b。图6：比较mir16-带负电在不同柱温下得到的色谱图。分别在30℃、40℃、50℃、55℃和60℃的柱温下进行色谱。色谱实验设置：hplc系统1，-100-柱，缓冲液ph8以及在9分钟内由5％到55％梯度变化的缓冲液b，和在40℃下杂交。图7：mir16-γ位正电荷、mir16-中性和mir16-带负电的色谱图。色谱实验设置：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b和在25℃下杂交。图8：1:1:1校正样品混合物与mir-16-γ位、mir16-中性和mir16-带负电的色谱图。色谱实验设置：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b以及在25℃和存在4.5m尿素的条件下杂交。图9a：mir-16-γ位的校正曲线。图9b：mir-16-中性的校正曲线。图9c：mir-16-带负电的校正曲线。在图9a、9b和9c中的色谱实验设置分别为：hplc系统1，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b，以及在25℃和存在4.5m尿素的条件下杂交。图10：来自三次独立检测的mir-16-中性、mir210-中性和mir320-中性的色谱图。色谱实验设置：hplc系统2，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b，以及在25℃和存在4.5m尿素的条件下杂交。图11：mir320-中性、mir16-带4个负电和mir210-带8个负电的色谱图。色谱实验设置：hplc系统2，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b，以及在25℃和存在4.5m尿素的条件下杂交。图12：在一项实验中通过hplc分离mir320-中性、mir16-4x带负电和mir210-8x带负电。色谱实验设置：hplc系统2，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由15％到66％梯度变化的缓冲液b，以及在25℃和存在4.5m尿素的条件下杂交。图13：对来自对照组的对象ctl8血浆和来自急性肾损伤对象akt154血浆的hplc色谱图的比较。色谱实验设置：具有中间middle16x检测水平灵敏度的hplc系统2，柱温为50℃的-100-柱，缓冲液ph8以及在7分钟内由20％到60％梯度变化的缓冲液b，并且在80℃下杂交。实施例microrna(mirna)是含有约22个核苷酸的短单链非编码rna。其具有调控功能，对发育、分化、增殖和凋亡中的多个生物过程具有深远影响。其在对多种疾病的诊断和治疗中具有很高的潜力。在这项工作中，评估了与急性肾损伤(aki)相关的称为mir16、mir210和mir320的三种不同mirna之间的比例。对roehl等(wo2010/043512a1)开发的测定方法进行了改进以使得能够从生物基质中同时检测三种mirna。使用不经过提取、纯化和扩增步骤的样品制备。样品制备基于使用蛋白酶k进行初始细胞裂解。对于利用aex-hplc的检测而言，将样品与互补的肽核酸(pna)杂交。pna表示其带负电的糖磷酸骨架被电中性的n-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架取代的经修饰的dna链。使用负电荷或正电荷修饰pna以使得在一次aex-hplc检测中将mirna分离。将pna与mirna杂交后，利用aex-hplc技术和荧光检测在人血浆中对三种mirna进行同步定量检测。结果显示可以将mir210和mir320作为急性肾损伤的生物标记物，因为在aki的情况下mir210与mir320的比例发生变化。因此，可以将这些mirna作为诊断急性肾损伤的生物标记物。roehl等在2011年开发了一种用于检测寡核苷酸的简化方法。这种方法能够通过hplc(高效液相色谱)分离单一代谢物，该方法采用简单和快速的样品制备，无需进行提取、扩增或分离步骤。在该测定中，在存在sds的条件下进行蛋白酶k消化(含十二烷基硫酸钠的缓冲液)以避免生物样品中的寡核苷酸降解。在存在饱和氯化钾溶液的条件下将干扰aex(阴离子交换色谱)hplc柱的sds沉淀。随后，将目标寡核苷酸与互补的经荧光标记的pna杂交。利用aex-hplc和荧光检测对所形成的双体进行检测。目前，只有通过使用具有多种不同荧光染料的肽核酸分子时，才能通过hplc对具有相似长度的不同寡核苷酸进行平行检测。由于这些显示出不同的响应因素(检测灵敏度)，因此不可能依靠对峰面积的直接比较来分析样品中的摩尔比。对pna的修饰(例如在链末端或序列内引入表面电荷)提供了解决这一问题和通过仅使用一种荧光染料平行地检测若干成分的可能性。1.pna-设计可以采用几种技术对肽核酸(pna)进行修饰。一方面，由于使用氨基酸(例如赖氨酸或谷氨酸)对链进行修饰，可以分别在序列的任一端引入表面电荷。这些氨基酸在特定ph值下具有带电侧链。另一方面，可以通过例如使用赖氨酸的γ修饰在序列中产生正电荷。(见图1a)。为了能够使用高灵敏度的荧光检测器，使用荧光染料(如atto425)在序列的两端对肽核酸(pna)进行修饰。为此，可以使用巯基反应性atto425，其使用马来酰亚胺化学和通过巯基将序列的其余部分偶联至末端半胱氨酸(见图1b)。或者，可以使用氨基反应性。此处，通过使用nhs酯化学(n-羟基琥珀酰亚胺酯)通过赖氨酸的氨基或通过o接头将荧光染料与链的其余部分连接(见图1c)。肽核酸通过watson-crick碱基配对，与具有高度特异性和选择性互补的dna或rna形成双体。由此形成的pna-dna和pna-rna杂交物显示出高度稳定性，因为pna的中性骨架因此避免了pna与dna/rna之间的静电斥力(egholm等，(1993)nature,365:566-568)。而且，肽核酸针对酶(如核酸酶、蛋白酶和肽酶)显示出高度稳定性(demidov等，(1994)biochemicalpharmacology,48:1310-1313)。2.研究目的本研究的目的是进一步研发已有的roehl等的方法(wo2010/043512)。目的是在仅使用一个荧光染料的背景下利用具有不同电荷的pna对至少三个mirna(如mir16、mir210和mir320)进行同步检测。开始时，在无生物基质的缓冲液中检测在mir16与不同修饰的pna之间形成的双体。在这个方面，使用中性的、带负电荷的pna和带正电荷的γ修饰的pna。此外，建立一种hplc方法，该方法仅在一次hplc运行中就能够以明显不同的保留时间平行地检测全部三个双体。随后，预期使用这种新建立的方法从生物基质(如人血浆)中检测mirna并将其扩展至检测mir210和mir320。3.材料和方法3.1光密度检测使用nearest-neighbor法(tataurov等，(2008)biophysicalchemistry,133:60-70)确定mir16、mir210和mir320的消光系数，并根据公式1计算各浓度。公式1：通过光密度(od)和消光系数(ε0)计算mir16、mir210和mir320的浓度(μm)在这个方面，使用milli-q水将原始浓度的mirna溶液分别稀释为约3μm的终浓度。使用eppendorfbiophotometerplus检测3次od。为此，使用200μl3μm的溶液。计算三次独立检测的平均值并使用公式1确定浓度。然后可以通过稀释因子确定储备液的浓度。3.2hplc检测样品制备基于mirna与互补pna的杂交制备样品。为了分析mir16，首先制备不含生物基质的杂交缓冲液。随后，与人血浆进行杂交，然后再与另外两个mirna(mir210和mir320)进行杂交。3.2.1材料和试剂用于样品制备的材料和试剂列于表1和2中。表1：用于杂交的材料生产厂商mastercyclergradientpcr仪eppendorfagthermomixercomfort恒温混匀器1.5mleppendorfagminispinplus离心机eppendorfagtwintecpcr96板eppendorfaglobind管0.5mleppendorfaglobind管1.5mleppendorfag表2：用于杂交的试剂3.2.20.1μmmirna溶液和1μmpna溶液的制备使用具有根据公式1计算得到浓度的mirna储备液首先制备1μm溶液，随后以1:10的比例对其进行稀释。使用含10vol.-％乙腈(acn)和0.01vol.-％吐温20的溶液作为稀释剂。随后，通过将来自panagene(韩国)的各冻干pna(见表3)加入含10vol.-％acn和0.01vol.-％吐温20的溶液制备25μm的储备液。使用相同的稀释剂以1:25的比例对储备液进行稀释以用于杂交。表3：具有各序列的经修饰的pna链。c＝半胱氨酸，o＝o接头，e＝谷氨酸，k＝赖氨酸，atto425＝荧光染料，t＝胸腺嘧啶，a＝腺嘌呤，g＝鸟嘌呤，c＝胞嘧啶，*＝赖氨酸-γ-修饰3.2.3不含生物基质的裂解物的制备最初，选择了不含生物基质的杂交设置。杂交缓冲液的组成取决于用于细胞和组织的sds沉淀蛋白酶k裂解缓冲液。对于10ml裂解缓冲液而言，需要33μl蛋白酶k和9967μl组织和细胞裂解溶液。然后使用热混匀器在65℃和350rpm下将杂交缓冲液加热30分钟。随后，将溶液置于冰上冷却。由于作为杂交混合物的一部分的sds将不可逆地损坏阴离子交换柱，因而使用1000μl3mkcl溶液将其沉淀，随后将沉淀物在5℃和4000rpm下离心15分钟。为进一步用于杂交，在冰上分离上清液并将sds沉淀弃去。3.2.4生物基质如人血浆的裂解物的制备随后，将该方法扩展至从人血浆中检测mirna。使用肝素钠抗凝的人血浆购自dunnlabortechnik股份有限公司。在生物基质可以用于该测定之前，需要通过使用含蛋白酶k的组织和细胞裂解溶液进行处理以便消化所有存在的核酸酶(如rnasea)。为此，使用7ml裂解缓冲液在65℃下将3ml血浆消化30分钟，裂解缓冲液由含33μl蛋白酶k的2.9ml细胞和组织裂解溶液和4.1ml水组成。随后，如3.2.3节中所述将sds沉淀、离心并弃去沉淀物。3.2.5杂交根据表4中提供的方案设置杂交混合物。表4：200μl的杂交设置在不同条件下进行杂交。在将杂交混合物短暂加热至95℃5分钟后，在冰上形成pna与mir16之间的双体。在25℃下的杂交在无任何加热或冷却步骤的室温下进行。开始在不存在尿素的条件下进行杂交。此外，测试了尿素对杂交步骤的影响。此处，尿素以2m和4.5m的浓度在杂交混合物中使用。3.2.6用于单次测定和平行检测的校正样品的产生对于校正曲线而言，使用0.1μm的mir16溶液(见3.2.2)。在六个随后的稀释步骤中以1:5的比例对该溶液进行稀释。使用含10vol.-％acn和0.01vol.-％吐温20的溶液作为稀释剂。以与3.2.5节中类似的方法进行杂交步骤。此处，将不同的经修饰的pna(见表3)与人血浆在杂交缓冲液中混合。单次稀释步骤生成了一系列浓度，从0.16至500fmolmirna每100μl注射液。由于这种方法能够在一个hplc实验设置中进行平行检测，因而将杂交后的溶液以1:1:1的比例混合。3.2.7用于双体如mir16-中性、mir210-中性和mir320-中性的单次测定和平行检测的样品制备如3.2.5节中所述的进行mirna与其各自互补pna的杂交。首先，选择无修饰和无任何电荷的互补pna。为此，使用如3.2.2所述的1μmpna溶液和0.1μmmirna溶液。为进行平行检测，杂交后将所有三个样品以1:1:1比例混合。3.2.8用于双体如mir320-中性、mir16-4-x-带负电和mir320-8-x-带负电的单次测定和平行检测的样品制备为了获得更好的色谱分离，将已经过负电荷修饰的pna用于接下来的杂交步骤。此处，与mir16互补的pna含有4个负电荷，而与mir210互补的pna含有8个负电荷。这两种pna均由panagene公司(韩国)合成(见表5)。表5：具有相应序列的经修饰的pna链。c＝半胱氨酸，o＝o接头，e＝谷氨酸，k＝赖氨酸，atto425＝荧光染料，t＝胸腺嘧啶，a＝腺嘌呤，g＝鸟嘌呤，c＝胞嘧啶对于杂交而言，如3.2.2段中所述使用1μmpna溶液和0.1μmmirna溶液。如3.2.5中所述对各mirna进行杂交。对于平行检测而言，以1:1:1比例混合所有三个杂交混合物。3.3建立hplc方法3.3.1缓冲液的制备用于制备缓冲液的材料和试剂如表6和7中所示。表6：用于缓冲液制备的材料生产厂商磁力搅拌器rctbasicikawerkeph-meter766calimaticknick量筒bandelernaduransilber过滤器上杯0,2μmpes膜，无菌vwr表7：用于缓冲液制备的试剂5m高氯酸钠储备液的制备：对于5mnaclo4(高氯酸钠)溶液而言，称量总计702.30g的摩尔质量为1240.46g/mol的naclo4xh2o并溶解在1升水中。随后将溶液通过孔径为0.2μm的过滤器过滤。0.1m焦磷酸钠储备液的制备：对于0.1mna4p2o7(焦磷酸钠)溶液而言，称量总计22.3g的摩尔质量为446.06g/mol的na4p2o7x10h2o并溶解在500mlh2o中。hplc缓冲液1(ph7)缓冲液a：30vol.-％acn，100mmnacl，10mmtris-hclph7缓冲液b：30vol.-％acn，900mmnacl，10mmtris-hclph7缓冲液c：10vol.-％acn，4mnaclo4hplc缓冲液2(ph8)缓冲液a：30vol.-％acn，100mmnacl，10mmtris-hclph8缓冲液b：30vol.-％acn，900mmnacl，10mmtris-hclph8缓冲液c：10vol.-％acn，4mnaclo43.3.2hplc系统hplc系统1hplcdionexultimate3000被用于在建立该方法的情境下进行hplc分析，其包括除气器、自动进样器、柱温箱和泵系统。使用来自dionex的rf荧光检测器进行检测，其激发波长为436nm和发射波长为484nm，缺省的检测灵敏度为middle4x。hplc系统2为进一步分析，使用hplc系统dionexultimate3000和购自shimadzu公司的具有更高灵敏度的荧光检测器rf-20axs，其激发波长为436nm和发射波长为484nm，缺省检测灵敏度为middle16x。3.3.3对在建立hplc方法的情境下经测试的参数的总结为建立该方法，使用长250mm和直径4mm的100柱。柱温在30℃至60℃之间变化。此外，对缓冲系统(见3.3.1)和梯度进行调整。进样体积为100μl，以及检测在1ml/min的流速下进行。3.4mirna解链温度tm的确定将解链温度tm定义为熔解曲线拐点处的温度，在该温度下50％的物质以单链形式存在。通过使用beckmancounterdu800uv/vis分光光度计测定260nm处的uv吸收分析各mirna的解链温度。在磷酸盐缓冲液(pbs)中制备各mirna的1μm的溶液。将样品转移至350μl微量比色杯中并在20℃下在比色杯架上平衡三分钟，随后以0.5℃/min加热至80℃。在80℃的温度下，将样品平衡5分钟并且随后以0.5℃/min冷却至20℃。在从20℃至80℃的温度范围以1℃的间隔测定uv吸收。根据一阶导数的最大值确定解链温度，并且在该温度下50％的分子是单链的和50％是结构化的。3.5从人血浆中检测mir16、mir210和mir320总而言之，对由汉诺威医学院thum教授课题组提供的10份血浆样品进行了分析。这些血浆样品中的5份来自对照组的对象，和另外5份血浆样品来自已诊断为急性肾损伤的对象。如3.2.4章中所述使用裂解缓冲液处理血浆，并且在存在氯化钾溶液的条件下沉淀sds。随后，如表8中的方案所述将样品在80℃下杂交。表8：用于检测来自人血浆的mirr16、mir210和mir320的杂交混合物将表5中的pna用于杂交。对于hplc检测而言，选择配有灵敏度为middle16x的检测器的hplc系统2(参见3.3.2)，并调整梯度为7分钟内缓冲液b由20％至60％。4.结果4.1mirna的浓度表9中汇总了根据nearest-neighbor法测定的mir16、mir210和mir320的消光系数。表9：靶分子mir16、mir210和mir230的特征。u＝尿嘧啶，a＝腺嘌呤，g＝鸟嘌呤，c＝胞嘧啶，p＝5’磷酸为了确定mirna的精确浓度，如3.1章中所述检测其各自的光密度。检测得到共计三个单次的值，根据其计算平均值。基于光密度的平均值和其各自的理论消光系数，根据公式1计算浓度(见3.1)。4.2杂交条件的优化4.2.1pna的电荷对色谱分离的影响当使用中性pna检测相似长度的mirna链时，无法实现对双体的高质量的色谱分离。为了评估pna上额外的正电荷和负电荷对hplc分离的影响，使用下述pna对mir16进行检测：中性的、带负电的和γ位带正电的(见表3)。如3.2.5中所述将这些pna均分别与mir16杂交。该杂交步骤包括将溶液短暂加热至95℃5分钟，随后在冰上形成pna与mir16之间的双体。随后，将样品注入hplc中，在已建立的条件下(见4.3.4)在9分钟内由5-55％梯度变化的缓冲液b中进行色谱分离。如图2中所示，对pna使用不同的表面电荷，使得能够通过色谱分离mir16与各互补pna之间形成的这三个双体。而且，在主峰区域中观察到了额外的峰，其是由在偶联的atto-荧光染料中存在的马来酰亚胺环水解引起的，这导致在双体中产生了额外的负电荷，这反过来也会影响保留时间。半峰的形成使得色谱分析变差和丧失灵敏度。由于峰高降低而总峰面积相似，因而信噪比减小。马来酰亚胺环结构的水解可能是由于杂交温度太高所致或可能是由杂交缓冲液的组成导致的。为了进一步评估这些影响，分析了杂交缓冲液的组成和作为杂交缓冲液的一部分的尿素的影响。因为在存在尿素的条件下mirna具有降低的解链温度，所以也可以在降低的温度下进行杂交步骤。4.2.2杂交条件对hplc色谱图的影响为了评估杂交条件对色谱图的影响，在将混合物分别加热至95℃和25℃，然后mir16与具有不同电荷的pna在冰上杂交。杂交条件见3.2.5和色谱条件见4.3.4。杂交温度的降低导致水解产物量的显著降低。因此，峰的分裂显著减小，进而导致信号强度增加，从而改善了信噪比(见图3)。在表10中，再次总结了较低杂交温度的影响。通过降低杂交温度，可以在最大可能限度下避免马来酰亚胺环的水解以及因此在色谱图中产生的肩峰。这种作用被较小的保留时间所佐证，当在95℃下水解马来酰亚胺环时，额外的负电荷会导致更高的保留时间。对于主峰面积而言，当与总峰面积进行比较时，并未将肩峰计算在内，其中总峰面积由主峰面积和肩峰面积组成。表10：杂交条件对mir-中性、mir-带负电和mir16-γ位正电荷hplc色谱图的影响，w0.5＝半峰高处的峰宽*无法分析尽管在较低杂交温度下观察到mir16-带负电的主峰面积大约变为两倍，但是观察到mir16-γ位正电荷增至2.5倍和观察到mir16-中性的主峰面积甚至增至3倍。除了主峰面积显著增加以外，还观察到了额外的峰高的增加。从表10中的数据可以看出，在mir16与带负电pna之间形成双体的情况下，峰高甚至增加至2倍。与使用95℃加热步骤的杂交相比，达到了mir16-中性的峰高增至4倍和mir16-γ位正电荷的峰高增至3倍。4.2.3在存在尿素的条件下的杂交在样品在自动进样器中的孵育时间较长的情况下，观察到马来酰亚胺环的水解增加。因此，在杂交步骤中测试加入浓度为2m和4.5m的尿素。作为比较，还因此在不存在尿素的条件下根据3.2.5章描述进行了更多的杂交。随后在0h、5.5h和11h后，在已建立的hplc条件下(见4.3.4)使用hplc系统1(见3.3.2)对杂交混合物进行了检测。为了避免在这些检测过程中样品的任何水解，将自动进样器冷却至4℃。在不含尿素的mir16-pna样品的情况下，可以观察到随着孵育时间的增长马来酰亚胺环结构的水解显著增加。如图4所示，可以观察到两个肩峰，其以水解产物的形式出现在主峰的前后。位于主峰之前的肩峰可能是mir165'-末端磷酸的分离所产生的。其他峰是开环的马来酰亚胺环。随着孵育时间增加，每个这些肩峰均增加，这转而导致主峰面积的减小。如图5所示，在存在尿素的情况下，能够较大程度的避免这些副反应。对在不存在尿素和存在4.5m尿素条件下的杂交的直接比较显示出，在存在尿素的条件下信号强度显著增加。从表11所示的值可以清楚地看出，通过加入尿素能够避免水解反应的程度。在mir16-中性的情况下，向杂交混合物中加入4.5m尿素使主峰面积增至1.1倍，而在其他mir16带负电和mir16-γ位正电荷双体的情况下，主峰面积增至1.2倍。在所有这三种情况下，能够观察到各峰高的值增至1.2倍。因此，通过使用尿素能够显著减少水解。表11：不存在尿素条件下的杂交和存在4.5m尿素条件下的杂交的结果比较w0.5＝半峰高处的峰宽4.2.4优化的杂交参数的总结杂交实验表明，在mir16与带不同电荷pna之间形成的双体的情况下，通过将杂交温度降至25℃和通过加入4.5m尿素不能完全抑制马来酰亚胺环水解，但是能够大大降低水解。4.3hplc方法的优化4.3.1柱温的优化为了评估柱温对色谱图分辨率的影响，对不同温度进行了测试。为此，如3.2.5段中所述将样品杂交。在40℃下进行杂交。随后，根据4.3.4段中所述的hplc参数在30℃、40℃、50℃、55℃和60℃的温度下对样品进行检测。图6显示了以mir16-带负电为例的峰面积和峰高对柱温的依赖性。柱温升高导致马来酰亚胺环的部分水解并且从而在pna上形成额外的负电荷。在超过50℃的温度下可以观察到这些影响。然而，柱温从30℃升高至50℃会导致主峰面积和峰高的持续增加。在这项实验的情境下，可以观察到保留时间与柱温直接成正比。因此，柱温升高导致保留时间增加。表12中所示的数据显示了由于柱温升高导致保留时间增加的影响。柱温从30℃升高至60℃会导致保留时间从8.89分钟增加至9.75分钟。最佳柱温显示为50℃，因为在这个温度下能达到13.6mv*min的最大峰面积和104.9mv的最大峰高。表12：柱温对mir16-带负电的保留时间的影响，w0.5＝半峰高处的峰宽4.3.2ph值的优化由于ph影响pna样品的离子化水平并且从而影响其保留时间，因而下一步要对ph值进行优化以实现这三个双体的最佳分离。为此，对ph为7和ph为8的hplc柱缓冲液进行了测试。如3.3.1段中所述制备ph为7和ph为8的各个缓冲液。随后，根据3.2.5进行样品杂交，并且在经优化的hplc条件下在这些ph值下对样品进行检测(见4.3.4)。这些实验表明，ph值从7增加到8使得保留时间增加。通过增加ph值，能够通过避免马来酰亚胺环的水解实现对峰分离的总体改善，并因此获得更好的信号强度。将ph由7增加到8还改善了信号强度。mir16-中性的信号强度由87.3增至103.9mv，mir16-带负电的信号强度由86.3增至94.7mv以及mir16-γ位正电荷的信号强度由76.3增至97.8mv。同时，能够观察到主峰面积的增加(见表13)。mir16-中性的主峰面积由12.8增至13.4mv*min。mir16-带负电的主峰面积由9.9增至11.8mv*min，以及mir16-γ位正电荷的主峰面积由11.6增至12.3mv*min。表13：ph值对mir16-中性、mir16-带负电和mir16-γ位正电荷保留时间的影响，w0.5＝半峰高处的峰宽4.3.3梯度的优化在对ph值进行优化后，目标为相应地调整梯度。在通常情况下，平缓的梯度产生更好的分离度。然而，更陡的梯度能够达到更高的信号强度。梯度优化结果如表14中所示。起初，在9分钟内以缓冲液b从5％至55％的斜率实现梯度。这导致三个双体的保留时间在7.25至9.47分钟之间的范围。随后，梯度的斜率由5.6％每分钟增至7.3％每分钟。随着缓冲液b的初始盐浓度由5％增至15％，运行总时间可以从17分钟缩短至15分钟。各保留时间在4.84至6.47分钟范围内。表14：不同梯度对mir16-中性、mir16-带负电和mir16-γ位正电荷的保留时间的影响4.3.4优化的hplc条件的总结图7显示了对mir16-rna与三个带不同电荷的pna之间形成的三个双体进行分离的色谱图。在空体积中显示了增加的pna过量的信号，这是确保双体完全形成所必需的。这三个双体在4与7.5分钟之间的范围内洗脱。hplc运行缓冲液的ph为8，其梯度的斜率为在7分钟内在缓冲液b中从15-66％。梯度的该斜率还显示出所需的分辨率。4.4hplc方法的校正在对杂交和hplc条件进行优化后，对已建立的方法进行了校正。为此，进行了系列稀释，其使得能够在柱上对从0.16至500fmol范围内的mirna进行校正(见3.2.5)。随后，在25℃下对样品进行杂交。由于目的是为了能够进行平行检测，因而在已建立的hplc条件下对在杂交步骤后产生的各系列稀释步骤的等摩尔混合物进行检测(见4.3.4)。图8显示了对各系列稀释物进行检测获得的色谱图。该图显示了各个系列稀释浓度的1:1:1混合物的色谱图，其注射量为0.053至166.7fmol。在注射0.267fmol的mir16时，mir16-γ位正电荷的信噪比(s/n)为2.2。在注射相似浓度的mir16-中性和mir16-带负电时，信噪比分别为9.4和11.5。因此，在mir16-γ位正电荷的情况下，检测极限(lod)为约0.267fmol，其中可以将另外两个双体的相同量定义为检测限(lod)。对用于校正的最低量0.053fmol无法进行分析，因为该量低于检测极限。各校正线如图9中所示。在mir16-γ位正电荷的情况下(图9a)，斜率是0.1015[(mv*min)/fmol]和相关系数r2是0.9993。此处，由于相关系数几乎与理想值1是相同的，因而实现了高精度。mir16-中性的校正线如图9b中所示。此处，斜率是0.1254[(mv*min)/fmol]和相关系数r2是0.9966。如已在图8中所示，可以清楚地看出mir16-中性最后一个校正点的偏离。因此，相关系数是0.9966，比mir16-γ位正电荷低。图9c显示了mir16-带负电的校正线。此处，斜率是0.0889[(mv*min)/fmol]。r2＝0.9999，在该情况下已经达到了理想的相关系数。4.5mir16-中性、mir210-中性和mir320-中性的平行检测由于通过马来酰亚胺化学的荧光染料的偶联伴随着难以控制的水解，并且无法实现对水解的完全抑制，因此下面选择了另一种pna设计，其中荧光染料以一种更加稳定的方式通过nhs化学与pna偶联。在下一个步骤中，应在一次hplc柱运行中检测mir16、mir210和mir320。为此，首先按照3.2.7章将样品与其互补的中性pna在25℃下杂交，并且随后制备这三种mirna的1:1:1混合物。然后在已建立的hplc条件下(见4.3.4)使用hplc系统2(见3.3.2)对这些样品进行检测。图10显示了对这三个样品进行单独检测的色谱图比较。此处，观察到mir16-中性和mir210-中性仅有较差的分辨率。这两个双体显示出相似的保留时间。使用包含中性pna和各个mirna的这三个双体的1:1:1混合物也无法达到令人满意的分辨率。双体混合物的色谱图与在每个单独双体的色谱图中观察到的峰是一致的。4.6mir320-中性、mir16-带4个负电和mir210-带8个负电的平行检测为了获得三个双体的最佳分离，必需使用新的经修饰的pna。在此处，对与mir16和mir210互补的新pna进行分析。为了使保留时间的偏移增加，通过分别在序列的每个末端加入两个谷氨酸残基对与mir16互补的pna进行修饰，其导致产生了4个额外的负电荷。以类似方式对与mir210互补的pna进行修饰，但是引入8个负电荷。将用于mir320的pna保持中性。随后如3.2.8章中所述将样品在25℃下杂交，然后生成这些杂交混合物的1:1:1混合物。随后，在已建立的hplc条件下(见4.3.4)使用hplc系统2(见3.3.2)对样品进行检测。如图11中所示，使用这种新的pna设计能够获得改进的分辨率性质。也就是说，可以观察到与图10相比显著改善的分离。与预期目标一致，pna所带的负电荷使得其各自的保留时间可以增加。从图12中可以看出，这些检测具有较高重现性，也可以在1:1:1混合物中实现双体的分离。从图12中也可以明显看出，与其他两个双体相比mir16-带4个负电的峰面积显著降低。4.8来自人血浆的mir16、mir210和mir320的检测随后，对来自由汉诺威医学院提供的人血浆的mir16、mir210和mir320进行了检测。此处，旨在对急性肾损伤与推定为其生物标记物的mirna之间的相关性进行分析。因此，如3.2.4段中所述对来自对照组(ctl)对象的5个血浆样品和来自急性肾损伤(aki)对象的5个血浆样品进行消化，并且随后如3.5章中所述对其进行杂交。在80℃下杂交以破坏mir320中所有推定的二级结构。随后使用hplc系统2(见3.3.2)利用已建立的hplc条件(见4.3.4)，在7分钟内以缓冲液b从20-60％的梯度变化对样品进行检测。图13显示了来自对照组对象的血浆样品(ctl8)与来自急性肾损伤对象的血浆(aki154)的色谱图比较。此处，可以清楚地看到，在aki154的情况下mir320的发光显著高于对照对象ctl8的情况，而在这两种情况下mir210的发光几乎相似。表15汇总了来自人血浆的mir16、mir210和mir320的值。计算mir210与mir320的各比值和各平均值以及其标准偏差。来自对象aki_138的血浆样品的值不作为这些计算的一部分考虑，因为认为其不具有代表性。各对照对象检测结果的平均值在1.5范围内，相对标准偏差为17％。在急性肾损伤患者的情况下，观察到较高的平均值2.6和较低的相对标准偏差5％。总之，所有值均接近检测器的检测极限。表15：来自由汉诺威医学院提供的人血浆的mir16、mir210和mir320的双体的峰面积以及标准偏差(sd)和相对标准偏差(rsd)6.总结在本工作中研发的新建立的hplc方法能够在一次hplc运行中对具有相似长度的不同mirna进行同步检测。在该情境下，在存在带有不同电荷pna的条件下杂交后通过aex-hplc对三种mirna(即mir16、mir210和mir320)进行分离。开始，选择能够通过马来酰亚胺化学将荧光染料与pna序列偶联的pna设计。然而，发现这并不是最优的，因为对杂交和hplc条件进行优化过程中的色谱图显示，由于马来酰亚胺环水解导致峰分裂和因此产生信号强度的降低。在更高的温度和对样品进行更长时间孵育后尤其能够观察到这种效应。随后选择了一种能够通过nhs酯化学偶联荧光染料的新pna设计。这使得样品具有稳定性并且成功避免了峰分裂。使用新pna设计，可以从人血浆中定量检测两种mirna(210和320)。总之，在来自急性肾损伤对象的血浆中观察到了与对照组相比mir210与mir320的比值增加。据知情人士透露，该趋势已由独立的pcr分析所证实。因此，本发明的检测方法允许将mirnamir210和mir320作为生物标记物用于急性肾损伤的诊断。因此，可以将在本发明情境下研发的hplc方法开发成诊断试剂盒，以提供一种能够在早期阶段诊断这种特殊疾病的快速和简便的方法，从而确保对患者进行早期治疗。序列表<110>axo实验室股份有限公司(axolabsgmbh)<120>寡核苷酸的同步检测及其相关的试剂盒和用途<130>a69492pc<150>ep15000588.2<151>2015-03-02<160>9<170>patentin3.5版<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:1)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过半胱氨酸和两个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(19)..(19)<223>以通过半胱氨酸和1个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>1gccaatatttacgtgctgc19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:2)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过半胱氨酸和3个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(19)..(19)<223>以通过半胱氨酸和3个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>2gccaatatttacgtgctgc19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:3)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过半胱氨酸和两个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(3)..(3)<223>具有赖氨酸γ修饰的位点<220><221>misc_结合<222>(6)..(6)<223>具有赖氨酸γ修饰的位点<220><221>misc_结合<222>(9)..(9)<223>具有赖氨酸γ修饰的位点<220><221>misc_结合<222>(12)..(12)<223>具有赖氨酸γ修饰的位点<220><221>misc_结合<222>(15)..(15)<223>具有赖氨酸γ修饰的位点<220><221>misc_结合<222>(19)..(19)<223>以通过半胱氨酸和1个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>3gccaatatttacgtgctgc19<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:4)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过两个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(17)..(17)<223>以通过半胱氨酸和1个o-接头偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>4tcgccctctcaacccag17<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:5)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过1个o-接头和两个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(19)..(19)<223>以通过赖氨酸和两个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>5gccaatatttacgtgctgc19<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>经修饰的肽核酸(seqidno:6)<220><221>misc_结合<222>(1)..(1)<223>以通过1个o-接头和4个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<220><221>misc_结合<222>(17)..(17)<223>以通过赖氨酸和4个谷氨酸偶联的atto425形式与另一部分共价结合的位点<400>6cagtgtgcggtgggcag17<210>7<211>22<212>rna<213>智人<400>7uagcagcacguaaauauuggcg22<210>8<211>22<212>rna<213>智人<400>8agccccugcccaccgcacacug22<210>9<211>22<212>rna<213>智人<400>9aaaagcuggguugagagggcga22当前第1页12