质粒提取试剂盒及提取质粒的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体地说，涉及一种质粒提取试剂盒及提取质粒的方法。
背景技术：
：碱裂法提取质粒最早由birnboin和doly于1979年提出，能有效去除染色体dna以及回收质粒dna，但是菌液的量一般不会太多，否则会导致过多的蛋白残留而使裂解不完全，或者会导致蛋白与质粒共沉淀无法回收到足够的质粒。一般国际上的试剂公司，采用有滤芯的回收柱来回收质粒dna，但是由于碱裂法的要求和限制，难以对更大容量的dna进行有效的回收。目前市面上各种试剂盒一般会加入聚乙二醇、triton和mops等易造成水体污染的有机试剂。因此，亟待开发一种既能够提高质粒提取的量，又绿色、环保和高效的质粒提取方法及相关试剂盒产品。技术实现要素：本发明旨在提高质粒提取的量来满足大多数实验室的科研需要，并且改进实验技术减少对环境的污染，使质粒提取实验方法和试剂盒绿色、环保和高效，提供一种基于碱裂法开发的质粒提取试剂盒及提取质粒的方法。为了实现本发明目的，本发明的质粒提取试剂盒，包括溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5和絮凝粉；所述溶液1为双蒸水，所述溶液2为0.21m的naoh溶液，所述溶液3为含有1.6～2.0m乙酸钾(优选1.6m)、1m乙酸和0.11m氯化钙的浓盐溶液，所述溶液4为70％的乙醇溶液，所述溶液5为含有10mmtris-hcl、1mmedta和10-15μg/ml(优选10μg/ml)rnase的rna清除液，所述絮凝粉为naoh和sds按1:6-7(优选1:6)质量比的混合物。其中，溶液2、溶液3、溶液4和溶液5均用双蒸水配制。所用试剂均为分析纯级别以上。溶液3和溶液5均保存于4℃，其它溶液室温保存。溶液5作为rna清除液，先用双蒸水配制tris-hcl和edta的混合液，高压灭菌后，再按比例加入rnase。本发明提供利用上述试剂盒提取质粒的方法，包括以下步骤：(1)将新鲜培养16～24小时的高拷贝质粒大肠杆菌菌液收集入离心管中(10～500ml菌液收集入50ml离心管中，或1～10ml菌液收集入2ml离心管中)，2100g-16000g离心1-10min，将菌体沉淀于管底部；(2)按每1ml菌液加入10μl溶液1的量，向菌体沉淀中加入溶液1，涡旋，直到菌体悬浮均匀，得到菌悬液；(3)按每1ml菌液加入20μl溶液2的量，向上述菌悬液中加入溶液2，颠倒离心管5～10次，动作轻柔，室温下放置3～5min，得到裂解液；(4)按每1ml菌液加入30μl溶液3的量，向上述裂解液中加入溶液3，盖紧瓶盖上下剧烈摇动10-15次(优选10次)，然后3000g-16000g离心2-5min，将上清转入新的离心管内；(5)按每1ml菌液加入0.04g絮凝粉的量，向上清中加入絮凝粉，盖紧瓶盖上下剧烈震荡2～3min或涡旋2～3min，于-20℃放置5-10min；然后，4℃2100g-16000g离心2-5min，将上清转入新的无内毒素无核酶的离心管内，且后续步骤中所用耗材均为无内毒素无核酶；(6)向(5)所得上清中加入1/3体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃3000g-16000g离心5-30min，迅速倒掉上清，离心管继续离心1min后，小心吸除残留的异丙醇溶液；(7)向(6)所得沉淀中加入250-800μl溶液5，吹打混匀，转入新的离心管内(按10ml～500ml菌液转入2ml离心管内，或按1ml～10ml菌液转入1.5ml离心管内)，16000g离心1min后将上清转入新的离心管内；(8)75℃保温10-15min(优选10min)，然后室温静置30min；(9)冷却至室温后加入1.2～1.5倍体积的异丙醇，震荡混匀，于12000-16000g(优选16000g)离心10min，快速倒掉上清，重新离心1min后吸除多余的异丙醇溶液；(10)向(9)所得沉淀中加入0.5～1ml溶液4，12000-16000g(优选16000g)离心2min，小心吸除液体保留沉淀，于室温干燥30-35min(优选30min)；(11)加入适当体积的无酶水回溶质粒沉淀，-20℃保存或直接用于实验。前述的方法，步骤(1)具体为：当离心管中的菌液为1-2ml，离心条件为：12000-16000g(优选16000g)离心1min。当离心管中的菌液为3-500ml，离心条件为：2100g以上离心10min。前述的方法，步骤(4)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，离心条件为：12000-16000g(优选16000g)离心2min。当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，离心条件为：2100g以上离心5min。前述的方法，步骤(5)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，具体操作为：向上清中加入絮凝粉后盖紧瓶盖上下剧烈震荡或涡旋，于-20℃放置5min；然后，4℃16000g离心2min。当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，具体操作为：向上清中加入絮凝粉后盖紧瓶盖上下剧烈震荡或涡旋，于-20℃放置10min；然后，4℃2100g离心5min。前述的方法，步骤(6)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，离心条件为：16000g离心5min。当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，离心条件为：3000g离心30min。前述的方法，步骤(7)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，向(6)所得沉淀中加入250μl溶液5。当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，向(6)所得沉淀中加入800μl溶液5。本发明所述质粒的大小为1-10kb。所述质粒的拷贝数为1×1010-7×1011copies/ml。本发明所述大肠杆菌的出发菌株包括dh5α、stbl3、bl21等。本发明具有以下优点：本发明提供的提取质粒的方法及相关试剂盒产品，进行质粒小提，可以达到一般公司的中量提取质粒的量(约100μg)，达到同等或更好的纯度，且提高菌液的量至500ml，也可以得到大量的高纯质粒，完全能够满足各种分子实验室的一般要求。本发明的质粒提取试剂盒中，除乙酸钾、氯化钙、乙酸、异丙醇、氢氧化钠、十二烷基苯磺酸钠、edta和rna酶，没有其他有机化学成分，对环境污染小，属于环境友好型产品。而且，本发明无需制造各种dna结合膜以及塑料柱耗材，减少了塑料制品的消耗，减少了间接所产生的工业废物，进一步减轻了实验室对环境的压力。附图说明图1为本发明实施例5中内毒素测定结果。图2为本发明实施例6中酶切鉴定结果。图3为本发明实施例7中蛋白浓度标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1质粒提取试剂盒的构建本实施例的质粒提取试剂盒，包括溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5和絮凝粉。所述溶液1为双蒸水，所述溶液2为0.21m的naoh溶液，所述溶液3为含有1.6m乙酸钾、1m乙酸和0.11m氯化钙的浓盐溶液，所述溶液4为70％的乙醇溶液，所述溶液5为含有10mmtris-hcl、1mmedta和10μg/mlrnase的rna清除液，所述絮凝粉为naoh和sds按1:6质量比的混合物。其中，溶液2、溶液3、溶液4和溶液5均用双蒸水配制。所用试剂均为分析纯级别以上。溶液3和溶液5均保存于4℃，其它溶液室温保存。溶液5作为rna清除液，先用双蒸水配制tris-hcl和edta的混合液，高压灭菌后，再按比例加入rnase。实施例2质粒小提方法1、将1ml～25ml含有1μl/ml氨苄青霉素的lb液体培养基培养16～24小时的大肠杆菌，于2100g离心10min后，弃上清液，用1ml去离子水重悬后转入2ml离心管，16000g离心1min弃上清；2、按照表1加入各试剂：表1小提试剂用量培养菌液的体积溶液1溶液2溶液3絮凝粉溶液5溶液4离心管11ml～25ml250μl500μl750μl0.5g250μl500μl2ml离心管1ml～10ml100μl200μl300μl0.2g100μl500μl1.5ml离心管3、向菌体沉淀中按表1加入溶液1，涡旋使菌体重悬均匀；4、加入溶液2，颠倒6～10次混匀，室温静置3～5min；5、加入4℃预冷10min的溶液3，用手剧烈上下摇动10次，16000g离心2min；6、小心取出菌裂解液，置于孔板上，用1ml移液器将上清液体移入新的离心管内，并避免吸入蛋白杂质；7、按表1向上清液中加入絮凝粉，盖紧管盖并且涡旋2～3min，置于-20℃放置5min；8、于4℃，16000g离心2min，将上清液转入新的无内毒素无核酶的离心管中，且此步骤之后的需采用无核酶及无内毒素等级的耗材；9、加入1/3体积异丙醇，盖紧盖子，颠倒5～10次混匀，于16000g，4℃离心5min，快速将上清倒掉，然后盖好盖子重新于16000g，4℃离心1min；10、取出离心管可以看到有白色沉淀沉于管底，此时用100μl移液枪，小心倾斜吸取残留的液体并保留沉淀；11、按表1加入溶液5，将沉淀用枪头吹打均匀，16000g离心1min，上清液转入新的离心管中；12、置于75℃固体浴中，恒温加热10min，置于37℃下30min；13、加入1倍体积的异丙醇，涡旋震荡10s，置于室温下10min，然后于16000g，4℃下离心5min；14、快速倒掉上清，重新放回离心机16000g离心1min，吸去残留液体，加入500μl溶液4，离心1min，小心吸走上清；15、将离心管开口横放于吸水纸上室温干燥30min；16、按表1用无酶水回溶质粒dna，保存于-20℃或用于下步实验。实施例3质粒大提方法1、将培养于37℃的菌液离心收集到50ml离心管内(小于500ml菌液)，弃去上清；2、按照表2加入各试剂：表2大提试剂用量培养菌液的体积液体1溶液2溶液3溶液5溶液4絮凝粉26～100ml1ml2ml3ml800μl1ml2g101～300ml3ml6ml9ml800μl1ml6g301～500ml5ml10ml15ml800μl1ml10g3、按表2加入溶液1重悬菌体，加入溶液2颠倒10次混匀，室温静置5min；4、按表2加入溶液3，剧烈上下震荡10次，于4℃2100g离心5min，上清缓慢倒入新的50ml离心管内，尽量避免倒入大块沉淀；5、按表2向上清中加入絮凝粉，盖紧瓶盖剧烈涡旋或震荡2～3min，于-20℃保温10min，4℃2100g离心5min；6、将上清小心倒入新的无内毒素无核酶的50ml离心管内，并且以后步骤中使用无核酶无内毒素耗材；7、向上清液中加入1/3体积的异丙醇，颠倒混匀，于4℃离心30min，快速倒掉上清液，再次离心1min，小心吸去异丙醇残留；8、加入800μl溶液5，将沉淀吹打混匀，转入2ml离心管，16000g离心1min后将上清重新转入新的2ml离心管内，于75℃保温10min，37℃保温30min；9、加入1ml的异丙醇，颠倒混匀，16000g离心10min，快速倒掉上清液，然后重新离心1min，吸除残留液体，保留沉淀；10、加入1ml溶液4，颠倒混匀，16000g离心2min，小心吸除溶液，保留沉淀；11、打开管口横放于吸水纸上干燥30～60min；12、适量无酶水回溶dna，-20℃长期保存或直接用于接下来的实验。实施例4不同体积菌液的质粒提取所需仪器及试剂：nanodrop2000c，高压蒸汽灭菌锅，大型台式低温离心机，小型台式高速低温离心机，电子天平，牛肉膏蛋白胨，分析纯nacl，酵母提取物，20μg/ml氨苄青霉素及实施例1试剂盒。称量并配制lb培养基，其中含有10g/l的nacl，10g/l的酵母提取物，5g/l的牛肉膏蛋白粉，加入水溶解后放入高压蒸汽灭菌锅，于120℃灭菌20min，待冷却至室温后，每1l加入1ml的氨苄青霉素，并接种含有质粒的大肠杆菌stbl3(质粒大小为10kb，高拷贝，可在哺乳动物细胞内表达荧光蛋白egfp)于37℃，200r/min摇床培养16～24h。分别取6组25ml菌液，6组100ml菌液，6组500ml菌液，按照实施例2和3所述方法提取质粒dna。所提取的质粒dna，用nanodrop2000c测定质粒浓度及纯度，各浓度菌液所提质粒数据取平均值，结果如表3所示：表3质粒提取浓度及纯度测定结果实施例5内毒素检测所需试剂及仪器：酶标法内毒素检测试剂盒，内毒素国家标准品(批号150600-200707)，无酶水，恒温箱，酶标仪。取实施例4中6组500ml菌液所提质粒为实验组，内毒素国家标准品用无酶水稀释成10eu/ul浓度作为阳性对照组，无酶水作为阴性对照组，按照试剂盒内说明书测定各组内毒素水平，将数据录入excel取平均值，并计算各组间p值确定差异。国家标准品内毒素水平，以及无酶水内毒素水平，内毒素水平测定结果如图1所示，纵坐标为吸光值。由图1可知所提质粒内毒素水平小于1eu/ug。实施例6酶切检测所需试剂及仪器：无酶水，去离子水，fastdigestecorv内切酶(thermofisher),10×fastdigestbuffer,10×loadingbuffer，1kbmarker，琼脂糖，微波炉，恒温水浴锅，电泳成像仪。制胶：于100ml锥形瓶中加入0.5g琼脂糖，加入50ml去离子水混匀，于微波炉中加热，使胶粒完全溶解，静置15min待液体冷却至40～50℃后，加入10000×gelstain染色，将胶溶液倒入电泳胶板中，插入胶板梳，冷却1h后拔出梳子放入电泳槽内。酶切：取实施例4中25ml组质粒，按表5建立酶切反应体系，酶切15min，加入2ul10×loadingbuffer后混匀，取10μl上样电泳，以1μl质粒溶液最为阴性对照组。表4酶切鉴定反应体系试剂体积质粒溶液1μl10×fastdigestbuffer2μlfastdigestecorv1μl无酶水16μl酶切后电泳结果如图2所示，泳道1～6为酶切后质粒电泳图，单一明亮条带；泳道7为未酶切的对照组，可见两条亮带。实施例7蛋白残留检测所需试剂与设备：考马斯亮蓝g-250染液，无酶水，2mg/mlbca蛋白标准品，酶标仪。标准品稀释：将2mg/ml标准品，用无酶水稀释成0.2mg/ml后，按表5稀释成不同的浓度梯度的溶液。表5蛋白浓度梯度稀释浓度梯度/(μg/ml)0.2mg/ml标准品溶液/μl无酶水/μl001002010906030701005050140703018090102001000蛋白浓度测定：各梯度取20μl加入到酶标板中，每梯度做三孔平行，取实施例4中500ml菌液所提质粒溶液20μl加入酶标板中，每孔再加入200μl考马斯亮蓝g-250染液，室温反应10min后，于595nm下测量吸光值，数据录入excel处理。实验结果如表6和图3所示，计算得每微克质粒所含蛋白为3.93ng。表6蛋白浓度测定结果实施例8细胞转染效率检测所用试剂及仪器：50mmpei(linearpolyethylenimine)溶液，含有150mmnacl的hepes缓冲液，含有10％fbs的dmem高糖缓冲液，trypleselect消化酶溶液，pbs缓冲液，去离子水，洁净工作台，台式离心机，细胞培养箱，流式细胞工作站。细胞培养：洁净台内，取10cm直径的培养皿内培养的293t细胞，加入trypleselect消化酶溶液3ml，轻微震荡使酶液覆盖全皿，37℃恒温箱内孵育5min，将细胞吹打均匀转入15ml离心管，于4℃1500rpm离心5min，弃上清，用3ml10％fbs的dmem培养基重悬细胞，在24孔板内每孔加入100μl细胞悬液，共加入20孔，并每孔补加900μl10％fbs的dmem培养基，于37℃，5％co2细胞培养箱培养24小时。质粒转染液配制：取实施例4中25ml质粒0.5μl加入到含有150mmnaoh的24.5μlhepes缓冲液中，共10管，震荡混匀；再取0.6μl50mmpei溶液加入到含有150mmnaoh的24.4μlhepes缓冲液中，共10管，震荡混匀；将每管质粒稀释液与每管pei稀释液互相混匀，即为质粒转染液。对照组将0.6μl50mmpei加入到49.4μl的含有150mmnaoh的hepes缓冲液中，混匀作为空白组转染液。质粒转染细胞：培养24小时的24孔板内细胞，吸走上清液，每孔加入室温的pbs静置1min，吸走上清液，加入100μl的10％dmem培养液，然后选10孔每孔缓慢加入50μl质粒转染液，选1孔加入空白组转染液，轻摇24孔板混匀，于37℃培养30min后，弃去上清液，加入1mlpbs静置1min，弃尽上清液，重新加入1ml10％fbs的dmem培养基，细胞培养箱中培养一天后换液，继续培养一天。流式细胞仪检测：将转染细胞和对照组细胞消化后分别转入1.5ml离心管，每管补充pbs缓冲液至500μl，立即送细胞于流式细胞工作站检测荧光细胞所占总细胞的百分比，以空白组作为对照。结果表明，表达荧光蛋白的细胞认定为转入质粒的细胞，不具有荧光蛋白表达的细胞认定为没有转入质粒的细胞，其中荧光细胞所占百分比平均为15.41％即为转染效率。实验结果表明，本发明所提质粒的质量达到了用于各类分子及细胞实验所需的标准。本发明方法克服了经典的碱裂法以及市场上常见的硅胶柱提取质粒方法中出现的弊端，如蛋白去除不彻底，离心力转速需求高，质粒丢失严重等问题。同时由于无需硅胶柱以及其它有机试剂，降低了提取成本，对环境友好，尤其是大提质粒的成本比市场上柱提法降低了5-10倍，节约了实验成本。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12