一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及医学分子诊断及生物技术，涉及一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用，具体涉及一种检测taz基因新突变c.622a>g的引物及探针。

背景技术：

肥厚型心肌病(hcm)为一种最常见的遗传性心脏疾病，主要表现为左心室或双心室不对称性肥厚，较少患者表现出左室流出道梗阻。主要病理特征为心肌细胞弥漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纤维紊乱等。hcm临床表现从无征兆到呼吸困难、晕厥、胸痛甚至发生心源性猝死和致命性的心律失常。

hcm是第一个从遗传角度阐明病因的遗传性心脏疾病，是青少年及年轻运动员猝死的主要原因之一。1990年在一个加拿大家族性肥厚型心肌病患者中发现第一个致病基因myh7，其主要遵循的是常染色体显性遗传模式。但部分hcm患者也表现为常染色体隐性及性染色体遗传，大约有50％的hcm患者为家族性遗传，称为家族性肥厚型心肌病(fhcm)。hcm的全球发病率和年死亡率分别约为1/500和1％。相关证据表明，zou等人随机抽查中国9个省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并对其进行超声心动图检测，结果表明中国人群患hcm的概率大约为0.8/500。实际上，超声心动图对肥厚型心肌病的检测为一种患病后的诊断方式，还存在更多潜在的hcm患者，依此推断，中国人群中至少存在200万hcm患者。该病也是是青少年和年轻运动员猝死的最主要原因之一，morn等人对1986-2006年猝死的1886名美国年轻运动员进行统计分析发现，死亡的主要原因为心血管疾病1056名，占约56％，其中hcm的患者就占据了36％。

众多研究表明，hcm的致病基因除肌节基因外，还包括和能量代谢基因、离子通道基因、tafazzin(taz，genbank:ng_009634.1)基因及心脏发育相关的转录因子。其中taz基因高表达于心肌组织，除与hcm的发病相关外，还与扩张型心肌病和左心室发育不全有关。对hcm患者进行基因检测和家族筛查能够为临床诊断提供重要的指导作用，主要体现为：1)产前诊断，指导优生优育；2)辅助明确诊断，进行临床干预；3)家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理。

目前，遗传疾病基因突变的检测方法较多，如：限制性片段长度多太性、单链构象多态性、高分辨率溶解曲线分析、荧光定量pcr的检测方法、pcr扩增直接测序和高通量测序。上方法各有优缺点，毛细管电泳技术是基因突变检测的金标准，但因其对设备的要求高、价格昂贵等缺点，很难从实验室普及到临床，而荧光定量pcr具有快速、简便、经济和准确等特点。

cn102965428a公开了一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。该试剂盒采用探针捕获测序，主要针对的是多个基因的多个变异位点，该方法耗时长，且价格十分昂贵。针对单个突变位点来说，实时荧光pcr检测方法具有快速、简便、经济和准确等特点。

值得一提的是taqman-mgb荧光定量pcr的检测方法，该方法与传统的taqman不同的是在探针的3’端连接了非荧光的猝灭基团mgb(minorgroovebinder，mgb)，当探针序列与模板结合时，mgb能高度结合于dna双链的小沟，增加了寡核苷酸探针和单链模板结合的稳定性，由此通过缩短探针序列长度，增加探针序列的特异性，实现了能区分一个碱基的差别。当具有5’-3’外切酶活性的dna聚合酶对碱基进行延伸时，可把发光基团解离下来，解除了非荧光的猝灭基团对发光基团的抑制，实现了荧光信号的积累与pcr产物的同步进行，从而能较好的区分野生型、纯合突变和杂合突变样本。taqman-mgb对单核苷酸多态性检测方面有较多的应用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐药突变检测和肿瘤细胞p⁵³基因突变等。

cn104388595a公开了一种猪圆环病毒2型实时荧光定量pcrmgb-taqman探针检测方法，该方法利用荧光定量pcr技术，采用mgb探针，建立了猪圆环病毒2型(pcv2)检测方法。但目前mgb探针还未用于hcm的检测。

因此，为肥厚型心肌病建立一种简便、快速、经济和准确的突变筛查方法，为肥厚型心肌病的预防、辅助临床诊断和预后评估提供技术平台显得尤为重要。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用，本发明通过所述引物可以构建阳性野生型taz-c.622a和纯合突变型taz-c.622g的载体，应用abi7500实时荧光pcr仪，以阳性载体为参照，建立一种简便、快速、准确和经济的肥厚型心肌病taz基因c.622a>g突变检测方法，为肥厚型心肌病的临床早期诊断和预防提供了新的技术平台。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种引物及探针序列，所述序列能检测新突变位点taz-c.622a>g的实时荧光pcr引物和taqman-mgb探针序列。

优选地，所述检测taz-c.622a>g新突变位点的实时荧光pcr引物的核酸序列如seqidno.1-2所示，所述taqman-mgb探针的核酸序列如seqidno.3-4所示；

具体的序列如下所示：

优选地，所述taqman-mgb探针的核酸序列5’端标记有发光的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团mgb。

优选地，所述发光的报告荧光基团为fam和hex。

优选地，所述不发光的淬灭基团为mgb小分子化合物。

第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的实时荧光pcr引物和taqman-mgb探针序列。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物及探针或如第二方面所述的试剂盒用于肥厚型心肌病相关致病taz基因新突变c.622a>g的检测。

第四方面，本发明提供一种肥厚型心肌病相关致病taz基因新突变c.622a>g的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组；

(2)以步骤(1)的基因组为模板，进行pcr扩增，构建野生型、纯合突变型及杂合突变型阳性质控品；

(3)将步骤(2)得到的阳性质控品采用如第一方面所述的引物组合物进行实时荧光pcr检测。

优选地，步骤(1)所述的基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(2)所述的pcr扩增的引物的核酸序列如seqidno.5-6所示，所述pcr扩增的引物的核酸序列如下：

优选地，步骤(2)所述的pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；72℃延伸5分钟；

优选地，构建阳性质控品的具体步骤如下：将pcr扩增产物进行纯化，将纯化后的片段克隆到pmd-18t载体上，转化到大肠杆菌jm109，挑选单克隆，测序验证野生型及纯合突变型阳性质粒，将野生型和纯合突变型阳性质粒按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型阳性质控品。

优选地，步骤(3)所述的实时荧光pcr的条件中检测taz-c.622a>g新突变位点的反应体系为：pcr扩增反应混合酶5μl，50×的rox校正染料0.1μl，上下游引物各0.3μl，taqman-mgb探针seqidno.30.5μl，taqman-mgb探针seqidno.40.5μl，基因组0.5μl和纯净水为2.8μl。

优选地，步骤(3)所述的实时荧光pcr条件中检测taz-c.622a>g新突变位点的pcr反应条件为循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、58℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明一次可检测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为肥厚型心肌病的临床早期分子诊断和预防建立了新的方法；

(2)本发明方法可用于产前诊断，指导优生优育，辅助明确诊断，进行临床干预，家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理；

(3)本发明的方法方便快捷，成本低，利用96孔pcr反应管可一次性检测多个样本。

附图说明

图1为本发明阳性质控品taz，c.622a>g菌液pcr琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明阳性质控品tnni3，c.622a毛细管电泳检测；

图3为本发明阳性质控品tnni3,c.622g毛细管电泳检测；

图4为taz，622aa基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的扩增曲线；

图5为taz，622aa基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的标准曲线；

图6为taz，622gg基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的扩增曲线；

图7为taz，622gg基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的扩增曲线；

图8为以野生型为模板的新变异位点taz，c.622a>g的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针，；

图9为以纯合突变型为模板的新变异位点taz，c.622a>g的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；

图10为以杂合突变型为模板的新变异位点taz，c.622a>g的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；

图11为以不同基因型为模板的新变异位点taz，c.622a>g的taqman-mgb特异性检测的散点图分布，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；

图12为对72例已知基因型的肥厚型心肌病患者进行taz，c.622a>g突变位点实时荧光检测的基因分型散点图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

应用本发明方法对参照2011年美国心脏病协会肥厚型心肌病诊断指南，在云南省第一人民医院心血管内科临床确诊的1例家族性肥厚型心肌病先证者(患者签订知情同意书，且通过医院医学伦理委员会批准)外周血基因组进行实时荧光pcr的突变筛查，寻找可能的与hcm发病相关的致病性变异位点。

一种肥厚型心肌病相关致病基因taz，c.622a>g突变的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组：对入选临床确诊的家族性肥厚型心肌病1例先证者，抽取其外周静脉血1ml，edta抗凝后，采用商业化的小量基因组提取试剂盒(axygen,美国)提取其全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳后、对浓度和od值进行测定，od260/280为1.8-2.0之间为可用；

(2)以步骤(1)的基因组为模板，进行pcr扩增：

其中，步骤(2)所述的pcr扩增的引物的核酸序列如seqidno.5和6所示，具体如下：

，pcr扩增的反应条件如下：

，pcr扩增反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，显示目的片段大小与预期大小一致，并对其进行纯化；

(3)pcr产物经琼脂糖凝胶dna纯化试剂盒纯化后，用pmd-18t载体进行t-a克隆后，筛选出阳性克隆菌株，提取其质粒载体。

(4)利用abi3130毛细管电泳仪对含有克隆目的片段后的质粒载体进行毛细管电泳，其检测反应体系为：模板dna1μl，引物(3.2pmol/ul)0.5μl，bigdye染料(2.5x)8μl，纯净水10.5μl；

(5)克隆载体毛细管电泳pcr反应条件如下

(6)以靶基因taz(genbank:ng_009634.1)的基因序列为模板，利用bioedit序列分析软件对变位点进行分析。

结果如图2和3的测序结果可以看出，成功构建野生型和突变型的阳性质控品。

实施例2

应用本发明方法对参照2011年美国心脏病协会肥厚型心肌病诊断指南，在云南省第一人民医院心血管内科临床确诊的1例家族性肥厚型心肌病先证者(患者签订知情同意书，且通过医院医学伦理委员会批准)外周血基因组进行实时荧光pcr的突变筛查，寻找可能的与hcm发病相关的致病性变异位点。

一种肥厚型心肌病相关致病基因热点突变的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组：对入选临床确诊的家族性肥厚型心肌病1例先证者，抽取其外周静脉血1ml，edta抗凝后，采用商业化的小量基因组提取试剂盒(axygen,美国)提取其全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳后、对浓度和od值进行测定，od260/280为1.8-2.0之间为可用；

(2)以步骤(1)的基因组为模板，进行pcr扩增，构建野生型、纯合突变及杂合突变阳性质控品；

其中，步骤(2)所述的pcr扩增的引物的核酸序列如seqidno.5和6所示，具体如下：

，pcr扩增的反应条件如下：

，pcr扩增反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，显示目的片段大小与预期大小一致；

构建野生型、纯合突变及杂合突变阳性质控品的具体步骤如下：将纯化后的片段克隆到pmd-18t载体上，转化到大肠杆菌jm109，挑选单克隆，测序验证野生型和纯合突变型阳性质粒，将野生型和纯合突变型阳性质粒按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型阳性质控品；

(3)将步骤(2)得到的阳性质控品采用所述的引物组合物进行实时荧光pcr检测，所述引物及探针序列如下：

具体反应体系如下：

分别把taz基因c.622a>g野生型和突变型模板进行10倍梯度稀释，利用abi7500实时荧光pcr仪对引物探针的灵敏性进行检验，具体条件如下：

结果如图4-7的扩增曲线和标准曲线所示，随着模板起始拷贝数的降低，ct值开始相应增加，标准曲线的线性关系较好(r²>0.98)，以上结果说明了引物探针具有较好的灵敏性。

实施例3

经条件优化，步骤(4)所述的引物-探针的序列的重复性验证，分别进行3次重复试验(批间和批内重复)。观察模板的ct值，并计算其变异系数，变异系数(p)＝标准偏差(sd)/平均数(x)，测试检测方法的灵敏性和重复性。

批间和批内重复结果分别如表1-表2所示：

表1

表2

从表1-表2可见，批间和批内重复变异系数均小于2％，具有较好的批间和批内重复性。

实施例4

经条件优化，步骤(4)所述的引物-探针的序列的特异性验证。

特异性验证以变异位点taz，c.622a>g的野生型、纯合突变型和杂合突变型的阳性质粒为模板，同时加入双标记探针，按照优化好的条件对其进行taqman-mgb的特异性实验验证，结果如图8-11所示。

结果显示，图8中的野生型样本反应的曲线表现为野生型探针产生的荧光信号增高，而纯合突变无荧光信号或仅有很低的荧光信号；图9中的纯合突变表现为只有突变型探针产生荧光信号；图10中的杂合突变样本能使野生型和突变型探针都表现出相对较高的荧光信号；更重要的是，图11所示，通过反应结果的散点图可以明显看出不同基因型的样本单独成簇。

实施例5

本发明中，对来自于已知(sanger测序)基因型的72例肥厚型心肌病患者(患者知情同意，且得到医院医学伦理委员会批准)进行taz，c.622a>g突变检测。图12为检测变异位点的基因分型散点图，aa基因型为64例，ag基因型为6例，gg基因型为2例，检测结果与sanger测序结果一致，准确率为100％。

综上所述，由实施例的结果分析可得出，本发明建立了肥厚型心肌病致病基因taz新突变位点c.622a>g的简便、快速、准确和经济的遗传筛查方法。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>昆明理工大学

<120>一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用

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